のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

Amy M. Wen; Karin L. Lee; Ibrahim Yildiz; Michael A. Bruckman; Sourabh Shukla; Nicole F. Steinmetz

doi:10.3791/4352

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方法論記事

のためのウイルス粒子

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DOI:

10.3791/4352

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2012年11月16日

Amy M. Wen¹ , Karin L. Lee¹ , Ibrahim Yildiz¹ , Michael A. Bruckman¹ , Sourabh Shukla¹ , Nicole F. Steinmetz²

¹Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , ²Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

この記事について

サマリー

植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。

要約

ナノ材料の使用は、材料科学と医学に革命を起こす可能性を秘めています。現在、異なるナノ粒子の数は、イメージング及び治療への応用が検討されている。植物由来のウイルス粒子（VNPs）が定義されたサイズと形状を持つ自己組織化bionanomaterialsとみなすことができる。シュタインメッツのラボで研究中の植物ウイルスは直径30nmのが、どちらもササゲモザイクウイルス （CPMV）とブロムモザイクウイルス （BMV）によって形成された正二十面体粒子が挙げられる。我々はまた、以下の植物ウイルス由来の棒状、糸状の構造を開発している：18 nmで、300 nmの寸法、および糸状粒子515を形成ポテトウイルスX（PVX）で剛体棒を形成したタバコモザイクウイルス （TMV）、長さと幅で13 nmのナノメートル（ リーダーがレフリーと呼ばれています。VNPsの詳細については^、1および^2）。

プランタで大規模に容易に製造することができる、非常に安定していて、生体適合性である。また、VNPsは、特に遺伝子組み換えや化学バイオコンジュゲーション法^3を用い^て操作すること^ができる"プログラマブル"単位です。 VNPsの構造を原子レベルの分解能に知られており、変更は原子レベル^4、現在の最先端の技術を有する合成ナノ材料を用いて達成することができないコントロールのレベルで空間的な精度で行うことができる。

本稿では、 緑豆ungiuculataとNicotiana benthamianaのプラントで CPMV、PVX、TMV、とBMVの伝播を記述します。各VNPための抽出と精製プロトコルが与えられている。精製し、化学的に標識VNPsのキャラクタリゼーションのための方法が記載されている。そこで、本研究ではchに焦点を当てるフルオロフォア（ 例えばのAlexa Fluor 647）、ポリエチレングリコール（PEG）とVNPsのemicalラベリング。染料は^、5月10日 VNPsの追跡および検出を容易にし^、8,11その薬物動態を向上させながら、PEGはタンパク質性ナノ粒子の免疫原性を低減します。我々は、マウス異種移植腫瘍モデルを用いてPEG化VNPsのホーミング腫瘍を実証している。マエストロイメージングシステムを用いて組織ex vivoでの蛍光イメージングの組み合わせは、均質化された組織における蛍光定量、および共焦点顕微鏡は、生体内分布を研究するために使用されています。 VNPsは細網内皮系（RES）を経由してクリアされます。ホーミング腫瘍が強化された透過性と保持（EPR）効果^12を介して受動的に達成されます。 VNPナノテクノロジーは、画像に強力なプラグ·アンド·プレイ·テクノロジーであり、 生体内での病気のサイトを扱います。今後はへの薬物貨物や臨床的に意義のあるイメージング部分、ならびに組織特異的リガンドを運ぶためにVNPsを開発しているがんや心臓血管疾患で過剰発現分子の受容体を標的とする。

プロトコル

1。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）伝搬

一日の15時間（100％の光、25℃、65％湿度）と夜の9時間（0％光、22℃、60％湿度）に屋内植物室制御を設定します。
表1のタイムラインによると、植物に接種する。

CPMV	PVX、TMV、とBMV
0日目：植物3ササゲ種子/ポット。	0日目：植物〜30 N. benthamianaの種/ポット。大さじ1肥料/ 5リットルの水で週に一度受精。
0日目：植物3ササゲ種子/ポット。	14日目：1工場/ポットで再ポットN. benthamianaの。
10日目：感染は、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりCPMV（5μg/50μL/葉）を使用してプライマリ·紅葉。	28日目：3〜fを感染IVEは、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりPVX、TMV、またはBMV（5μg/50μL/葉）の葉。
20日目：収穫の葉や店舗-80℃である。	42日：収穫の葉や店舗-80℃である。

、成長して感染し、葉を収穫するための表1。タイムライン。

注：のみCPMV伝播が例として示されている。

2。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）精製

注：すべてのステップは氷上または4で行われる℃の

（表2参照）冷緩衝液の2倍量を使用して標準的なブレンダーで冷凍葉の100グラムをホモジナイズする。寒冷紗の2-3層を介してフィルタリングします。
PVXの場合、1M HClを用いてpHを6.5に調整してください。 0.2％（w / v）のアスコルビン酸および0.2％（w / v）のナトリウムsulfiを追加TE。
20分間5500 xgで粗製植物ホモジネートを遠心分離します。上清を収集します。
BMVのため、層の10％（w / v）スクロース溶液5ml上清の25ミリリットル。 3時間と38.5パーセントのCsCl溶液（w / v）に再懸濁しペレット9000×gで遠心分離します。 5時間振とうして混合し、次にステップ2.12に進みます。
1:1（v / v）のクロロホルム:1-ブタノール0.7ボリュームを追加することで、植物材料を抽出します。 30-60分間混合物をかき混ぜる。
20分間5500 xgでソリューションを遠心分離します。上部の水相を回収します。
PEG（分子量8000）、0.2MのNaClを追加して8％（w / v）である。 TMVは、1％（v / v）トリトンX-100を追加することも。少なくとも1時間撹拌し、少なくとも1時間放置します。
15分間、15,000×gでソリューションを遠心分離します。緩衝液10mlでペレットを再懸濁します。 PVXについては、0.5メートルに0.1％β-メルカプトエタノール及び尿素を追加
30分間8000 xgで遠心し、上清を集める。
3時間16万xgで上清を超遠心。 5ミリリットルOバッファでペレットを再懸濁しvernight。
バッファの10％、20％、30％、および40％スクロース（最も重い第一）の等量を使用して10から40パーセントショ糖勾配を準備します。勾配は室温で一晩平衡化させます。
超遠心機は、2時間（BMVのため24時間）を100,000 xgで、ショ糖勾配上にペレットを再懸濁した。
光散乱バンドを収集し、緩衝液に対して透析する。
4時にVNPs（下）と店舗を特徴付ける℃に長期保存には、-80℃で保存し

CPMVおよびTMV	0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 38.5 mMのKH ₂ PO ₄ 61.5 mMのK ₂ HPO _4、
PVX	0.5 Mホウ酸緩衝液（pH7.8） 0.5Mのホウ酸 NaOHを用いてpHを調整
BMV	SAMA緩衝液（pH4.5） 250 mM酢酸ナトリウム 10mMのMgCl ₂ 2 mMのβ-メルカプトエタノール（新鮮追加）

表2各VNP用のバッファーとそのレシピ。

注：のみCPMV伝播が例として示されている。

3。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）キャラ

VNPsの濃度を決定するために、UV /可視分光法を実行します。
1. 光度計、分光光度計を使用してサンプルを2μlの吸光度を測定します。
2. ランベルト·ベールの法則を用いて粒子と色素の濃度を測定（吸光度=εcl、εは吸光係数、cは濃度、lはパスの長さです。）パスの長さは光度は0.1 cmです。
  VNP固有の吸光係数は、次のとおりです。
  CPMV：8.1 cm ^-1のミリグラム^-1ミリリットル（260nmで）
  PVX：2.97 cm ^-1のミリグラム^-1ミリリットル（260nmで）
  TMV：3.0 cm ^-1のミリグラム^-1ミリリットル（260nmで）
  BMV：5.15 cm ^-1のミリグラム^-1ミリリットル（260nmで）
サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）によって粒子を分析します。
1. スーパーロース6サイズ排除カラムとÄKTAエクスプローラー、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）200μl中VNPsの負荷50から100μgを用いた。
2. 260 nmの（核酸）、280 nmの（タンパク質）、および接続された任意の色素の励起波長に検出器を設定します。
3. 72分間、0.5ml /分の流速で実行します。
4. 溶出プロファイルとA260：A280 nmはVNPの準備が純粋であるかどうか、および粒子が無傷で組み立てられているかどうかを示します。
  以下A260：280比率は純粋VNPの準備を示します：
  CPMV：1.8±0.1
  PVX：1.2±0.1
  TMV：1.1±0.1
  BMV：1.7±0.1
個々のコートタンパク質への準備と共役の純度を分析する（プレキャストNuPAGE）変性ビス - トリスアクリルアミド4-12％勾配ゲル電気泳動を行います。
1. リン酸カリウム緩衝液9μlの中の粒子の10μgを4倍LDSサンプルバッファーの3ミリリットルを追加します。ジスルフィド結合の高い数を減らすためのbmv 4X LDSサンプルバッファーおよびβ-メルカプトエタノールを3μlの追加の1μlを添加する。
2. 100℃で5分間熱ブロックでインキュベート℃、
3. SDSゲルにサンプルをロードします。
4. ランニングバッファー1X MOPSで1時間、200Vでサンプルを実行します。
5. 蛍光コートタンパク質を可視化するためにUV光下でゲルを文書化します。
6. 非蛍光性タンパク質は、1時間クーマシーブルー（0.25％（w / v）をクーマシーブリリアントブルーR-250、30％（v / v）メタノール、10％（v / v）の酢酸）で染色。
7. 一晩30％メタノール、10％酢酸で脱色。チャン必要であればGEはソリューションを提供します。
8. 白色光の下でゲルを文書化します。
透過型電子顕微鏡（TEM）により粒子の整合性を分析します。
1. DI水20μlに0.1から1 mg / mlに試料を希釈します。
2. パラフィルム上のサンプルの20μlの水滴を置きます。
3. TEMグリッドでドロップをカバーし、2分間放置します。ろ紙でグリッド上の余分な溶液をオフウィック。
4. 乾いたウィッキングその後DI水の降下に配置することにより、グリッドを洗ってください。
5. 2パーセント20μlのドロップ（w / v）の2分間酢酸ウラニルに配置することにより、グリッドを染色。ろ紙汚れ過剰をオフウィック。
6. もう一度水でグリッドを洗う。
7. 透過型電子顕微鏡下のグリッドを観察します。

4。 PEGおよびフルオロフォア、精製とキャラクタリゼーションとVNPsの化学的結合

下記の反応のための計算の場合は、VNPsのモル質量は以下のとおりです。
CPMV：5.6×10 ⁶ g / molで
PVX：35×10 ⁶ g / molで
TMV：41×10 ⁶ g / molで
BMV：4.6×10 ⁶グラム/モル
ワンステップN-ヒドロキシスクシンカップリング反応を用いたCPMVおよびPVXの表面リジンに染料とPEGコンジュゲート：のAlexa Fluor 647、スクシンイミジルエステルの2500モル当量（全モル過剰がVNPあたりモル過剰を参照してください）との4500同等追加NHSを- PEG（分子量5000）は、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液中でCPMVをDMSOに溶解した。 PVXで作業する場合、NHS-染料とNHS-PEGの万モル過剰を追加します。 CPMVおよびPVXの最終濃度が2 mg / mlとし、DMSO含有量となるようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。光から保護し、室温で一晩反応混合物をインキュベートする。 CPMVおよびPVXは、それぞれ300と1270にアドレス指定リジンを持っています。（ 読者は上のさらなる読書のための以下の参照と呼ばれますCPMVおよびPVXの化学修飾^{：13-15）。}
ジアゾニウムカップリングによるTMVのチロシンと共役染料およびPEGが銅（I）触媒によるアジド - アルキン環が続く。
1. 0.3Mのp-トルエンスルホン酸一水和物、3.0 Mの亜硝酸ナトリウムを25μl、及び0.68Mの蒸留1時間4℃でアセトニトリルに溶解した3 - ethynylaniline75μlの400μlの混合することによりジアゾニウム塩（アルキン）を準備します。
2. TMVの1.25ミリリットル（20 mg / mlの原液）のNaClを100mMを含むホウ酸塩緩衝液、pH 8.8の3.3ミリリットルを追加します。
3. ジアゾニウム結合によってTMVにアルキンライゲーションハンドルを追加するには3時間、氷浴中でジアゾニウム塩（アルキン）溶液450μlで、TMVに反応する。解決策は、薄茶色に変わります。 TMVは抱合のための2140利用可能なチロシンを持っています。
4. ステップ4.4で説明されるようにショ糖クッションを使用して最終生成物を精製する。
5. アジド官能のAlexa Fluor 647及びPEG-アジド（MW 5000）usinを取り付けグラム銅（I）触媒によるアジド - アルキン環化（CuAAC）。 1mMのCuSO _4を、2mMのAMGは、15分間室温で2mMのアスコルビン酸ナトリウムとコートタンパク質とインキュベート当たり染料およびPEG-アジド2当量を追加します。 TMVの最終反応濃度が2 mg / mlとなるようなバッファの音量を調整します。 ^（：16,17読者はTMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。
リジンとBMVシステイン変異体（cBMV）のシステインにPEGに染料を結合さ：
1. 0.1MのTNKM緩衝液（50mMトリス塩基、50mMのNaCl、10mMのKCl、5mMのMgCl _2、pH7.4）にcBMVにDMSOに溶解オレゴングリーン488、スクシンイミジルエステルの2000モル当量を追加します。 BMVの最終濃度が1 mg / mlおよびDMSOのコンテンツであることそのようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。 4℃で一晩反応混合物をインキュベート℃で光から保護。
2. 遠心を使って浄化する粒子ステップ4.4で説明されるようにフーガのフィルタ。
3. 前と同じ反応条件を用いてPEG-マレイミド（MW 2000）の2000モル過剰を追加し、4℃で2時間反応混合物をインキュベート℃にcBMVは180反応性リジン及びシステインを持っています。 ^（：18読者はBMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。
精製：2.5時間16万xgで40％（w / v）ショ糖クッションを通して溶液を渡します。バッファーでペレットを再溶解。あるいは、10kDaのカットオフスピンフィルターを使用して、適切な緩衝液に対して透析する。
キャラクタリゼーション：UV /可視分光法、SDSゲル電気泳動、FPLC、およびTEM（ 図示されていない、しかし、 図6と図7を参照してください ）：PEG化および蛍光標識VNPsは、上述した方法を用いて分析されています。

5。マウス異種移植モデルを用いて腫瘍標的とイメージング

文化HT-29ヒト結腸癌細胞をRPMI培地で5％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充し、37℃で1％L-グルタミン℃、5％のCOのC ₂ 175cm ^2の細胞培養フラスコを使用しています。
5分間37℃でトリプシン-EDTA 5mlでインキュベートすることにより、滅菌PBSと収穫で細胞を2回洗浄します。 RPMI培地5mlのトリプシンを不活性化する。 5分間、500×gで遠心分離して細胞を回収する。 ^{5×10 6} cells/50μlの培地（トリパンブルーおよび血球計数器を用いて総細胞数を決定）で新鮮なRPMI中で4℃で再懸濁します。注射（すべてのソリューションおよび試薬は無菌に保つ）に先立ってマトリゲルの等量で混ぜます。
調達6週齢のNCR nu / nuマウス、2週間アルファルファフリーダイエットでそれらを維持する。 [注：すべての動物の動物実験委員会の手続きが承認されなければならない。]無菌の18 1/2ゲージを用いて脇腹に^{5×10 6} cells/100μL/腫瘍（2腫瘍/マウス）の皮下注射による腫瘍異種移植片を誘導針。定期的に動物を監視します。ノギスを用いて腫瘍の大きさを測定し、腫瘍が20ミリメートル^3（今後12日以内）の平均体積にまで成長することができます。 PBSおよびVNP（N = 3匹/群/時点）：ランダムに二つのグループにマウスを割り当てる。 1ミリリットル28ゲージインスリン注射器を用いて、静脈内の滅菌PBS尾静脈注射を100μlまたは10 mg / kgのVNP製剤によって管理します。

注：生きた動物を用いて組織培養実験と研究が実証されることはありません。ハンズオンデモが組織の処理とデータ取得に制限されます。 HT-29腫瘍の異種移植モデルで参照するために、読者はrefに呼ばれています¹⁹

3つの手法がVNPsのホーミング腫瘍を評価するために使用されています：

CO _2を使用して、異なる時間点（2、24、および72時間）で生け贄マウス：マエストロイメージングシステムを用いた蛍光イメージングガス。脇腹に腫瘍と一緒に動物や消費税、すべての主要な臓器（脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）解剖、パラフィルム上にティッシュを置いて、（800ミリ黄色励起および発光フィルターを用いた蛍光イメージング装置で分析組織における蛍光シグナル（VNPsに共役A647ラベル由来）の存在を検出するための露光）。画像を保存すると、ImageJ 1.44oソフトウェア（使用して蛍光強度を分析http://imagej.nih.gov/ij ）。時間は他の主要な組織と腫瘍におけるVNPsの取り込みのパターンを比較してください。
撮影後、半分に各組織を切断し、凍結切片および共焦点解析用OCTコンパウンドで半分を埋め込む。予め秤量したクライオバイアル内の他の半分を収集し、直ちにそれらを液体N _2を使用_してフリーズ。 -80℃で保存さらなる処理のための準備が整うまでは、C。
蛍光定量：再コードは、組織の重みを。室温で凍結組織を解凍し、1mlのPBSを含む別々の50mlのFalconチューブの中に置いてください。ハンドヘルド組織ホモジナイザーを用いて、PBS中で2〜3分間組織をホモジナイズ後、マイクロチューブにホモジネートを転送します。非均質化された組織を除去するために13000×gで10分間ホモジネートを遠心分離します。
384ウェル黒色のUVプレートに各グループ（PBSおよびVNP製剤/時点）から組織からの上清をピペットで100μL添加します。プレートリーダーを用いて蛍光強度（励起/ EM波長665分の600）を評価します。組織重量によって得られた蛍光値を正規化します。
免疫組織化学：-20℃で凍結ミクロトーム切片（10μm）とストアを準備細胞核（DAPI）および内皮細胞マーカー（FITC標識抗マウスCD31抗体）の組織切片を染色します。蛍光標識VNPの血管および腫瘍内局在をマッピングする共焦点顕微鏡分析を行うsである。

注：この手順は、実証されませんが、代表的なデータは、図8に示されている。免疫組織化学上の基準及び記載の染色法について、読者はrefに呼ばれています¹⁹