鳴禽類における聴覚刺激と機能的磁気共鳴画像法（fMRI）

サマリー

この記事では、機能的磁気共鳴画像法（fMRI）を使用して鳴き脳の聴覚刺激の神経基質のイメージングのための最適化された手順を示している。これは、音刺激の準備、被写体の位置決めとfMRIのデータの取得とその後の分析を説明しています。

要約

小鳥のさえずりの神経生物学は、人間の音声のためのモデルとして、行動の神経科学の研究の顕著な領域です。電気生理学、分子アプローチが異なるいくつかのニューロンに刺激、または脳の大部分で1つの刺激のどちらかの調査を可能にするのに対し、血液酸素化レベル依存（BOLD）機能的磁気共鳴画像法（fMRI）が両方の長所を組み合わせることができ、神経の活性を比較し、すなわち一度に脳全体に様々な刺激によって誘発される。鳴禽類におけるfMRIのは、それらの脳のサイズが小さいと、その骨と特に彼らの頭蓋骨が重要感受性アーティファクトを誘発する、数多くのエアキャビティを備えているため困難である。グラディエントエコー（GE）BOLD fMRIのは正常鳴禽^1-5（審査のために^、6を参照）に適用されている。これらの研究は、感受性アーチファクトのない領域であり、プライマリとセカンダリの聴覚脳領域、に焦点を当てた。しかし、プロシージャ興味のあるS字は、これらの地域を超えて発生する可能性があり、脳全体BOLD fMRIのは、これらの成果物の影響を受けにくいMRIシーケンスを使用して必要とされる。これは、スピンエコー（SE）BOLD fMRIの^7,8を使用することによって達成することができる。本稿では、広範囲に鳥の鳴き声の行動の神経科学で研究15〜25グラムの体重の小さな小鳥であるキンカチョウ（Taeniopygiaののguttata）、この手法を使用する方法について説明します。小鳥にfMRIの研究の主なトピックは、曲の知覚と歌学習です。 SEの弱いBOLD感度（GEと比較して）ベースのfMRIのシーケンスと組み合わせ刺激の聴覚性質は、この技術の実装は非常に困難になります。

プロトコル

1。聴覚刺激の調製

1. 最初7T MRシステムの穴の内側に再生されている間に音刺激を記録します。ボアは、特定の聴覚周波数の強化の結果聴覚刺激を歪めることができる限られたスペースである。として磁石内に鳥の頭の位置で行われたホワイトノイズの我々の録音が示す周波数が拡張され、抑制され図1に示すように 、使用して穴光ファイバー·マイク（Optimic 1160 Optoacoustics）。この人工的な拡張を補償するため、イコライザ機能は、WaveLabのソフトウェアを使用して各刺激に適用される。最大振幅：私たちの特定の設定の場合、この関数は次のパラメータを使用してガウシアンカーネルで構成されています - 20デシベル：0.05オクターブ（我々のシステムの範囲は2,500〜5,000 Hzまで対応）3,750 Hzで、幅を中心に、。
2. 曲の刺激は沈黙期間でインターリーブ各鳥のいくつかの個々の曲のモチーフで構成されています。 Dこれらの無音期間のurationはすべての刺激を介して音と沈黙の総量が同じに保つように調整されます。この構造は、曲の長さの自然内個人や個人間変動を節約します。各刺激の全長は16秒である。各曲の強度の面で正規化され、完全な刺激（歌とサイレントピリオド）に統合される前に400 Hzのフィルタ二乗平均平方根とハイパスマッチ。これらの操作は、Praatソフトウェアを使用して行われます。
3. 実験では、ON /休息期間（ブロックオフ）（ 図2）とブロックデザイン交互聴覚刺激周期（ブロックON）OFFで構成されています。各ブロックは、（ONとOFF）2画像の取得時間（取得については下記を参照）に相当する16秒、持続。各刺激タイプ​​は刺激当たり、被験者ごとに50画像の取得、その結果、25回提示されます。条件の提示順序は、内との間に無作為であるべき科目。刺激のこの無作為順序は、プレゼンテーションソフトウェアにコード化することができる。

2。件名準備

2.1件名とグループサイズ

ここでは、具体的には（成人）キンカチョウの使用に適したプロトコルを提示します。種の選択は、科学的な質問に応じて異なります。しかし、麻酔鳥のロバスト性のような他の考慮事項も考慮することができる。ゼブラフィンチ（Taeniopygiaののguttata）は、12時間の光の下で鳥小屋に収容する必要があります：12時間暗光周期と研究を通して食料や水を自由に摂取へのアクセス権を持っている。実験ごとに個人の最小数は15である。この数は、考慮にスピンエコーfMRIの、実験で測定された生物学的現象の自然個体間変動の感度をとります。

2.2セットアップのインストールと動物の準備

（仕様について使用される機器、我々は）、この記事の末尾に特定の試薬と機器の一覧を参照してください

1. 7T MRシステムのMRIのベッドの上でくちばしマスクを取り付け、プラスチック管をガスコントローラデバイスに接続します。両方の酸素と窒素ガスボトルを開けて、ガスコントローラデバイス（流量酸素：200のcc /分、窒素：400のcc /分）に切り替えます。

上述したように、7T MRシステムが提示セットアップで使用されている。異なる磁場強度を有する他のMRシステムも可能であるが、7Tで良好な妥協は、信号対雑音比と磁化率アーチファクト度（議論を参照）との間に到達する。より高い電界強度で信号対雑音比は、感受性アーティファクトの程度と共に増加する。

2. フィードバック制御されたシステムと暖かい気流デバイス上のスイッチ。
3. くちばしを導入することにより、酸素と窒素の混合物中のイソフルラン3％キンカチョウをAnaesthetizeマスクへと鳥は完全に麻酔になるまで頭を押した。これは、柔らかく足を引っ張って確認することができます：鳥が完全に鎮静されたときの足は鳥によって撤回されることはありません。また、鳥の目には、部分的に閉じられます。
4. キンカチョウの腹の下に空気圧センサーを配置することによって、体温をスクリーニングし、呼吸数を監視するためにクロアカ温度プローブをご紹介します。鳥の体（ 図3）を抑制するためにジャケットを閉じます。
5. 40の範囲内の呼吸速度を維持 - 毎分100回の呼吸を、40±0.5℃での狭い範囲内の体温を一定に保つ呼吸範囲が低すぎる/高すぎると、それに応じて麻酔（％イソフルラン）のレベルを調整する。問題が解決しない場合は、実験を回収するために停止し、動物が設定から削除する必要があります。
6. キンカチョウヘッドと詐欺のいずれかの側に非磁性のダイナミックスピーカーを置きアンプにそれらを接続します。それはあまりにも近い読み温度に影響を与えることができるので、スピーカーの配線は、温度プローブから離れて導かれていることを確認してください。
7. キンカチョウヘッドと磁石（および磁石の真ん中に位置して送信コイルの自動中央）の中心に位置キンカチョウをの上に表面RFコイルを配置します。
8. 酸素と窒素と混合イソフルラン1.5％に麻酔レベルを下げる。

3。データ収集

1. 1水平および1冠状グラディエントエコー（GE）スカウト画像（トリ-パイロットシーケンス）と、水平冠状および矢状マルチスライス画像のセット（T ₂加重迅速取得緩和強化操縦（1矢のセットを取得する磁石脳（ 図4）の位置を決定するためにRARE）SE配列）。
2. 1,000マイクロ秒に彼らのランプ時間を増やすことで勾配のノイズを減らします。
<李> fMRIのシーケンス準備：RARE T ₂加重シーケンス、実効TE：60ミリ、TR：2,000ミリ秒、RAREファクター：8、FOV：16ミリメートル、マトリックスサイズ：64×32、向き：矢状、スライス厚：0.75ミリメートル、スライス間ギャップの厚さ：0.05ミリメートル、ほぼ全脳（ 図4）をカバーする15のスライス。
3. プレゼンテーションソフトウェアにおける聴覚プロトコル（聴覚刺激と刺激配信のタイミング）を選択します。このプロトコルは、一連のコマンドで構成されています - 特定のスキャン数で実行されている - 特定の聴覚刺激の開始のために。 fMRIのシーケンス内のすべての繰り返しでは、スキャナソフトウェアは、順番にスキャン番号を登録し、対応するコマンドを実行し、聴覚プレゼンテーションソフトウェアにトリガを送信します。
4. 聴覚プレゼンテーションソフトは、スキャナからのトリガを逃さないようにするには、聴覚プロトコルが最初に開始されます。プロトコルが完全にロードされると、fMRIのシーケンスが開始される。
5. 各実験は、fMRIの信号が聴覚刺激を開始する前に定常状態に到達するために、スキャナノイズに起因する可能にするために12ダミー画像の取得が先行する。
6. 買収後に64×64にデータをゼロフィル。
7. Paravisionの機能ツール（オプション加工/機能イメージング）を用いた結果で最初の（暫定）を見てみましょう。ブロックとベースライン（ブロックオフ）ONすべての差BOLD応答を計算します。この分析では、実験の質の最初の指示を与える。全く活性化は、この段階で一次聴覚の分野で見られない場合には、鳥は、おそらく刺激提示、麻酔レベルなどの設定が検証されるべきであり、繰り返し測定と技術的な問題に起因する聴覚刺激を聞く/処理されていませんでした。
8. 以前のfMRIのスキャンと同じ向きで、効果的なTEと解剖3D RARE T2強調シーケンスを実行します：60ミリ、TR：2,000ミリ秒、RAREファクター：8、FOV：16ミリメートル、マトリックスサイズ：256×128×64。
9. 256×256×256にデータをゼロフィル。
10. MRIベッドからキンカチョウを取ると、それは赤いランプの下でケージに麻酔から回復しましょう​​。通常、イソフルラン麻酔後のキンカチョウの回復が（最大5分）比較的高速になります。わずか数分後に、鳥が立ち上がるしようとかつて鳥が完全に回収され、代わりにケージの底の上に座っての枝にとまります。麻酔の持続時間は、本実験のために約2時間である。弊社ラボでキンカチョウに適用イソフルラン麻酔の最大時間は、鳥も5分以内に回復した後、6時間である。

4。データ処理

1. 分析またはNIfTIフォーマットにMR-データを変換。
2. SPMは、ヒトで取得したfMRIのデータを処理するように開発されたので、それが約2mmのボクセルのためである。多数のSPM設定は、この近似ボクセルサイズに適合される。 1は、Wない場合はアリがすべてのこれらの設定を変更するには、続行する最も簡単な方法は、人工的に鳥のfMRIのデータのボクセルサイズを大きくすることです。 MRIcroを使用して10で本当のボクセルサイズを乗じヘッダー内ボクセルサイズを調整します。そのような調整は、それ自体のデータ、又はデータがないリサンプリングが適用される任意の他の修飾に影響を与えないことに留意すべきである。

これの代わりに、SPMは、任意のボクセル次元のファイルを開いて解析することができるツールボックスです 'SPMMouse'を使用することである。このツールは、SPM 'ガラス脳を'任意の画像から作成することを可能にし、自動的にデフォルトのイメージファイルやユーザー入力されたデータのヘッダーに基づいて長さのスケールを調整します。したがって、このツールボックスは、我々が提案するものよりは逆の方法で動作します。代わりに、SPMに収まるように画像のボクセルサイズを変更することで、SPMのデフォルト設定は、異なるボクセルサイズで画像を使用するように変更される。

3. fMRIのデータを再調整。 tに共同登録解剖3Dデータセット彼fMRIの時系列。キンカチョウ脳MRIアトラスに3Dデータ（および共同登録fMRIの時系列）を正規化します。 fMRIのデータセットに変換行列を適用します。これは、すべての統計パラメータマッピング（SPM）8ソフトウェアを使用して行うことができる。
4. SPM8を用いた0.5 mmの幅のガウスカーネルでデータを滑らかにします。
5. SPM8を用いた統計的なボクセルベースの​​分析を行う。モデルボックスカー（無血行動態応答関数）としてデータを。古典的な制限付き最尤アルゴリズムでモデルパラメータを推定する。各被験者の各聴覚刺激（固定効果分析）の平均効果を計算した後、グループ分析（混合効果分析）を望んだとして統計を計算。
6. 機能的なアクティベーションします（ 図6）ローカライズするSPM8にキンカチョウアトラス（ 図^5）9上に統計的パラメトリックマップを投影。

結果

我々はここに視覚的にキンカチョウの脳内の聴覚刺激の神経基質の成功のイメージングのための手順の最適化されたシーケンスを提示した。ブロックパラダイム（ 図2）のON / OFFに組み込むことができ、脳の差動反応を引き起こす可能性が音圧レベルの電位差をなくすために正規化される刺激における聴覚刺激の結果を調製するため、まず、記載された手順。 MRIは磁石のボア（ 図1）にそれをスキャンして位置決めするためのゼブラキンカチョウを準備した後、fMRIのを取得することができる。また、3次元の高解像度画像がキンカチョウアトラス⁹にデータを正規化するために取られる。最後に、データの前処理及び統計的分析は、得られた結果（ 図6）の可視化を可能にする。

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ディスカッション

本稿では、麻酔キンカチョウにおける聴覚刺激の神経基質の生体内での詳細な特性評価のために最適化されたプロトコルを記述します。

提示プロトコルに沿って、BOLD fMRIのを使用して、動物における脳機能の活性化研究の大半は、取得時に動物をanaesthetize。調査期間中に磁石環境とスキャナノイズにそれらを慣らすためのトレーニング動物も可能ではなく、時間がかかり、困難なので、めったに採用していないです。

麻酔は、関心のある生理学的反応にストレス誘発効果を最小化し、動物の取り扱いを容易にし、その効果は神経応答にと神経活動の間の伝達関数の両方とのfMRIで測定されたBOLD応答は、進行中の重要な研究課題であるが、 。したがって、AUDの間BOLD応答に対する麻酔の影響キンカチョウにおけるitory刺激は私たちの研究室²で検討した。したがって、キンカチョウ三広く使われている麻酔薬 - medetomodine、イソフルラン及びウレタン - 異なる神経伝達物質系に作用するが、検討した。その結果、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イソフルラン麻酔薬	Isoflo	05260-05
PC-Sam ハードウェア/ソフトウェア	SA-Instruments		http://www.i4sa.com
モニタリングおよびゲーティングシステム		1025
MR対応小型齧歯類用加温システム			Model 1025 対応
直腸温度プローブ		RTP-102B	7'', 0.044''
7T MRスキャナー	Bruker Biospin	PHS 70/16
Paravision ソフトウェア		5.1
グラジエントインサート		BGA9S	400 mT/m, 300A, 500V
グラジエントアンプ	Copley Co., USA	C256
送信レゾネーター			内径: 72 mm, 送信専用, アクティブデカップリング
受信アンテナ - 20 mm クアドラチャー マウスヘッド			受信専用, アクティブデカップリング
WaveLab ソフトウェア	Steinberg
Praat ソフトウェア	Paul Boersma, University of Amsterdam		http://www.praat.org
非磁性ダイナミックスピーカー	Visation, Germany	HK 150
ファイバーオプティックマイクロホン	Optoacoustics,	Optimic 1160
サウンドアンプ	Phonic corporation	MM 1002a
プレゼンテーションソフトウェア	Neurobehavioral Systems Inc.
MRIcro	Chris Rorden		http://www.cabiatl.com/mricro/mricro/
統計的パラメトリックマッピング (SPM)	Welcome Trust Centre for Neuroimaging	8	http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/