方法論記事

1 F O ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

DOI：

10.3791/4394

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2013年5月4日

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1Department of Internal Medicine, Yale University

この記事について

サマリー

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ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO ATPアーゼ複合体の活性の研究とその変調を可能にする。

要約

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ミトコンドリア代謝、生存1、開発および、カルシウムシグナリング2を含む多くの重要な細胞機能に関与している。最も重要なミトコンドリア機能の二つはATP、酸化的リン酸化による細胞のエネルギー通貨、およびプログラムされた細胞死3つの信号の調停を効率よく製造に関連している。

ATPの生産を主に担当する酵素はまた、ATP合成酵素と呼ばれる4-5 F1FO-ATP合成酵素である。近年では、アポトーシスおよび壊死細胞死におけるミトコンドリアの役割は、かなりの注目を集めている。アポトーシス細胞死では、このようなBaxのようなBCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリア外膜を入力してオリゴマー化し、サイトゾル6にプロアポトーシス因子を放出し、外膜を透過性。古典的な壊死性細胞死で、このような神経細胞における虚血や興奮毒性、ラーグによって生成されるようにeは、マトリックスカルシウムに難規制増加は、内膜の細孔の開口部、ミトコンドリア透過性遷移孔またはMPTPに貢献しています。これは、内膜を脱分極と外膜の破裂、プロアポトーシス因子の放出、代謝機能不全に貢献する、浸透シフトを引き起こす。のBcl-xLの7を含む多くのタンパク質は、その機能を調節する、F1FO ATP合成酵素と相互作用する。 BCL-XLはF1FO ATP合成酵素のβサブユニットと直接相互作用し、この相互作用はF1FO ATPase活性8中F1FOによってH +の正味の輸送を増加させる、F1FOATPasecomplex内に漏れコンダクタンスを減少させ、それによってミトコンドリアの効率を高める。 ATP合成酵素の活性及び変調を研究するために、我々はF1FO ATPアーゼを含む齧歯類の脳亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）から分離された。 Alavian らに示されているようにSMVsはF1FO ATPアーゼの構造および機能の完全性を維持する。ここでは、方法が記載さ我々は、ラット脳からSMVsを単離するために正常に使用していると我々はSMVsのチャネル活性を分析するためのパッチクランプ法（イオンリークコンダクタンス）を描くこと。

プロトコル

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1。脳ミトコンドリア単離（ ブラウンMRらから適応。9）

  1. インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された方法を用いてラットを生け贄に捧げる。
  2. 断頭により、動物の頭をカットし、皮膚をカットし、頭蓋骨を公開します。
  3. はさみや骨鉗子で切断してそっと頭蓋骨を開きます。脳を取り外します。
  4. 分離バッファにおける小脳（ 表1を参照）することなく、細かく脳をミンチし、5ミリリットルガラス/テフロンホモジナイザー（機器リストを参照）に転送します。
  5. そっとティッシュをホモジナイズ10回（無気泡）、約5分。
  6. 4時10分°Cベンチトップ遠心分離機で用1,500×gでサンプルを遠心分離します。
  7. 上清を保存（ミトコンドリアとシナプトソーム）とペレット（核物質と細胞の破片）を捨てる。ベンチトップ遠心分離機で4℃で10分間、16,000×gで遠心分離します。
  8. 捨てるアイソレーションバッファー500μlの上清と再懸濁ペレット。細胞破砕容器（機器リストを参照）シナプトソームを乱す。急減圧が続く10分間のために1,200 PSIの圧力を適用します。
  9. 126500で層フィコール勾配上に混合物（ 表2参照）、SW-50.1ローターと遠心で行わ×gで4℃で20分間遠心°におけるC（機器リストを参照してください）。ペレットを精製ミトコンドリアで、フィコールの異なる密度の間の層は未破砕シナプトソームです。
  10. 4時10分°ベンチトップ遠心分離機でC用16,000×gで分離バッファに遠心分離によってペレットを洗浄。

2。亜ミトコンドリアの小胞（SMV）アイソレーション（チャンら 10から適応）

  1. 1％ジギトニン等量と組み合わせる200μlのアイソレーション·バッファ内のミトコンドリア再懸濁、15分間氷の上に座ることができます。
  2. より多くのアイソレーションバフを追加16,000でERと遠心×4 gで10分間°ベンチトップ遠心分離機でC。これを2回行う。
  3. 200μlのアイソレーションバッファーでペレットを再懸濁すると10％Lubrol PX（C12E​​9）2μlのを追加します。混ぜ、15分間氷上で座ることができます。
  4. 分離バッファ上に層混合物、182,000でSW-50.1ローター遠心×4のG℃で1時間で場所。
  5. 4℃で10分間16,000で分離バッファで卓上遠心×gでの遠心分離することにより最終的に得られたペレットを洗浄します

3。電気生理学的記録

  1. 典型的な電気生理学リグは、増幅器、pClamp10.0ソフトウェア、マニピュレータ、顕微鏡、防振台、ファラデーケージと一緒にDigidata 1440Aアナログ - デジタル変換器インタフェースを備えたPCのコンピュータを含む。
  2. ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブはフレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-87に挿入されます。ピペットプラープログラムに最適化されていますMΩ80〜100の間に抵抗とピペットを生成します。
  3. SMVs生理的細胞内液（ATP、記録中に適切な時間に加算されます）（ 表3）に配置されます。パッチクランプピペットは、同じ溶液（無ATP）が充填されている。レコーディングを室温でSMVsにギガオームシールを形成することによって作られる。小胞はニコン又はツァイス倒立顕微鏡と位相差顕微鏡によって可視化される。
  4. 膜電位は、-100 mVでから10秒の期間で+は100mVの範囲の電圧で維持される。録音はアンプ回路を使用して5 kHzでフィルタリングされます。 1未満の浮遊pAの電気的又は非特異的なノイズのレベルが成功記録のために望ましい。
  5. データは、単一チャネル·イベントの周波数と振幅を決定するために、例えばClampfit 10.0ソフトウェアを使用して分析される。電圧依存性は、直流電圧の関係をプロットすることによって決定される。

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結果

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我々のプロトコルの最初のステップは、 図1のウェスタンブロットにより示されるようにミトコンドリアの単離精製を可能にする。 図2に脳由来亜ミトコンドリアのベシクルパッチ記録の一例を示している。インサイドアウトパッチ構成を用いて、我々は、ATPによって変調されたチャネルの活性を示す。コントロール（CTL）記録（左）は平均で600 psのピークコンダクタンスを持つマルチコンダクタンスチャネル活性を示す。それはすぐにお風呂に1mMのATPを添加すると低下した。 ATPの全体的な効果は、濃度依存的にSMVsパッチのコンダクタンスを減少させることである。 SMV-除外H +インジケータACMAの蛍光強度の減少を測定し、 図3に示すように、単離後F1FO ATPアーゼの効率を測定するために、我々はATP加水分解に応答してSMVsへのH +イオンの移動を測定した。 ATP感受性H + SMVsへのイオンの隔離は、追加した後に強化されていATPのition。このアッセイは、H +イオン封鎖の効率を測定するために使用することができる。あまり効率SMVsはH...

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ディスカッション

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この方法によってphenotypes.SMVspurified細胞の区別なく全脳から、手順2の後にここに、ステップ1の終了時に純粋なミトコンドリアの分離を可能にし、亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）に記載された方法は、に示されているように他の細胞内小器官による汚染の本質的に自由である図1に、私たちの前の仕事（Alavian KN ら 8）、凍結前にその構造と機能の整合性を保持します。凍結融解後、孤立したミトコンドリアやSMVsはレコーディングや生化学的アッセイのためにではなく、呼吸器の研究に使用されています。

この方法は、さらに、同じ手順を使用して肝臓からミトコンドリアを単離することができる。ミトコンドリアとSMVsは電気生理学的記録室に播種したときにクラスターを形成する傾向があるため、注意が過剰凝集や過度の希釈として、サンプルのロードに与えられるべきでpossibiliを減少させることができるシール形成のTY。また、注意が分離を開始する前に、いくつかの技術的な詳細に与えられるべきである。それはきれいなツール...

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開示事項

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利害の衝突は宣言されていない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Potter-Elvehjem ティッシュグラインダー with PTFEPestleKrackeler Scientific, Inc.1-7725T-5
エッペンドルフ 遠心分離機 5424 エッペンドルフ5424 000.410
4639 細胞破壊容器Parr Instrument Company4639
FicollSigma-AldrichF5415
ポリカーボネート遠心分離管ベックマン・コールターP20314
SW-50.1 ローター ベックマン・コールター
L8-70M 超遠心分離機ベックマン・コールター
DigitoninSigma-AldrichD5628
Lubrol PX (C12E9) Calbiochem205534
Axopatch 200B Axon Instruments
Digidata 1440A Molecular Device
pClamp10.0Molecular Device
マニピュレーターサッター機器
ホウケイ酸ガラスキャピラリーワールド精密機器1308325
フレーミング/ブラウン マイクロピペットプーラーモデル P-87サッター機器

参考文献

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  1. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  2. Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
  3. Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
  4. Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
  5. Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
  6. Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
  7. Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
  8. Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
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