ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

サマリー

CyTOFマスメーターの性能の毎日のチューニングと最適化のために必要な手順が記載されている。最適な試料調製および流量に対するコメントは、説明されてい

要約

近年では、単一細胞の迅速な分析は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光標識された抗体を用いて実施されています。しかしながら、フルオロフォアの排出量スペクトルの重複の問題は同時プローブの数を制限している。これとは対照的に、むしろ蛍光団より^{、ICP-MS。1〜}液体単一セル導入システムDVS科学夫婦による新しいCyTOF質量サイトメーターは、高濃縮金属同位体を含むキレートポリマーは、抗体または他の特異的なプローブに結合されている^。2-5なぜなら金属純度と質量メーターの質量分解能により、隣接する同位体からの "スペクトルの重なり"はありませんので、補償行列は不要。さらに、ランタニド金属を使用しているため、生物学的な背景のため、自家蛍光の等価なものはありません。マスウィンドウで理論的には最大100個のラベルにまたがる原子量103から203は、同時に識別することができた。現在、35以上のチャンネルがサンプルの免疫学的プロファイルの前例のない解剖を可能にする、DVS科学から入手可能なキレート試薬を使用して利用できます^。6月7日

マスメトリーの欠点は、プローブごとに別々の金属の同位体（前方または側方散乱のない同等品）、それは破壊的技術（リカバリを並べ替えの可能性なし）であるという事実のために厳格な要件があります。大容量メーターの現在の構成は、このように細胞のより高い入力番号を必要とするだけのセル伝送レート〜25％を持っています。

大容量メーターの最適な毎日の性能はいくつかの手順が必要です。最適化の基本的な目標は、M信号強度を低下させるとM 16で任意の所望の信号と干渉する酸化物（M 16）の形成を最小限に抑えながら、所望の金属の同位元素（M）の測定された信号強度を最大にすることである。最初のステップは、マシンはとても暑い、安定した私を暖めるためにあるCPはプラズマが確立されています。第二に、現在の、メイクアップガス流量の設定は、日常的に最適化する必要があります。サンプル採取時には、最大セルイベント発生率は、1000セル/秒に検出器の効率や処理速度によって制限されます。しかし、サンプルの品質に応じて、遅い細胞イベント発生率は（300〜500セル/秒）は、通常、セルのイベントとの間にこのように良い分解能はダブレットと破片の上に無傷のシングレットを最大化できるようにすることが望ましい。最後に、一日の終わりに、マシンの適切な洗浄は遊離金属に起因するバックグラウンドシグナルを最小限に抑えることができます。

プロトコル

CyTOFためのすべての細胞サンプルは、固定、膜透過しなければなりません。これは、イリジウム含有DNAインターカレーターの大きいエントリーが可能となり、また、質量メーターに注入する直前にMilliQ水洗浄と再懸濁工程の間に、細胞溶解を防ぐことができます。

1。マスメーターの起動

1. CyTOFソフトウェアプログラムを開きます。インストゥルメントのセットアップ]を選択します。カードケージのタブで、右下の隅に移動し、ボタンを "ON"にヒーターをクリックします。 200℃に到達するために、スプレーチャンバマントルに十分な時間を許可するようにヒーター上に所望の時間より前に少なくとも15分を回し
2. MilliQ水で満たされた新鮮な注射器とシリンジポンプの白いノルムジェクト3mlの注射器を交換してください。
3. ネブライザーのクリーニング。小さい液体導入口と大きなガス導入口の両方を介して5パーセントcitranox 2-3回を引っ張るために注射器とチューブを使用して噴霧器をバックフラッシュ。ミリQ水トンでバックフラッシュを繰り返す残留citranoxを削除O。
4. CyTOFのフロントパネル上のライトが図1のように点灯していることを確認するためにチェックします。

結果

上記のプロトコルに従うことで、4つのことを達成する必要があります。まず、大量のメーターのための十分なウォームアップ時間を許容するのに最適な信号と最小限の酸化物形成のために必要な熱い、安定したプラズマが生成されます。 MilliQ水とDVSウォッシュ溶液（ 図9）で質量メーターの第二に、十分な洗浄は、サンプルの取得（ 図8）の間にバックグラウンドを低減するために貢献し、チューブとマシンの他の部分に金属吸着のレベルを減らすのに役立ちます。また、マシンで立ち往生し、それによってサンプルからサンプルへのキャリーオーバーを最小限にする恐れがあります任意の細胞を除去するのに役立ちます。酸化物の質量M 16でバックグラウンドを最小限に抑えながら、大容量メーター（ 図5-7）の第三に、酸化物の形成を完全に防止することはできませんが、適切なチューニングは、所望の質量Mに最適化全信号を助けるでしょう。 図10に 、不適切なチューニング（マゼンタ）で有意に増加した酸化物の形成に見られるようにM 16は、適切にチューニングされ.......

ディスカッション

過去数十年では、蛍光フローサイトメトリーは、表面発現の観点および機能アッセイの両方において、単一細胞を解析するための馬車馬方法であった。しかし、蛍光色素のスペクトルの重複の問題が同時マーカーの数を制限している。 12以上の同時マーカーを用いた実験が報告されているが、必要な補償金の額は、これは技術的に困難になります。

代わりにフルオロフォアの、質量サイトメトリーは、抗体のラベルのような金属のためのキレート部位を有するポリマーを使用したDVS科学によって開拓^1-3金属の純度とICP-MSの質量分解能により、効果的には"スペクトルの重なりが"ありません使用されている要素のほとんどが生物学的に関連していないので、原因となるために少し背景もある "autofluoresenceは。"これらの事実は、単一の実験内の30以上の同時マーカーの使用を許可します^。6,7広いDYもあります典型的な蛍光実験より、ICP-MSにおける信号のダイナミックレンジ。

しかし、.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
CyTOF TMマスメーター	DVS科学
洗浄液	DVS科学	201071	水に0.05％のフッ化水素酸
ソリューションのチューニング	DVS科学	201072	0.5ppmのラ、CS、Tbは、Tm値、IR、トレース硝酸
Euを含有ポリスチレンビーズ	DVS科学	201073	自然豊かEuの同位体が含まれ、約1万個/ mLで供給ビーズを
マルチランタノイド含有（ラ/ PR / TB / TM /呂） - ポリスチレンビーズ	DVS科学	まだ市販されている	上場ランタニドの自然豊か同位体が含まれています
硝酸（濃）	フィッシャー·サイエンティフィック	A467-500	オプティマ微量金属純粋なICP-MSのグレード
セルストレーナーキャップ5mLを有するポリスチレン丸底チューブ	BD	352235	注入前の細胞サンプルをフィルタリングするために使用
ノルムジェクトtuberkulinシリンジ1mLの	ヘンケサスウルフ	4010-200V0	シリコンフリー、ラテックスフリー
ノルムジェクトシリンジを3mL	ヘンケサスウルフ	4010.000V0	シリコンフリー、ラテックスフリー
MilliQ水			18MΩの純水は、市販の洗剤（バリウム現在の彼らの高いレベルのために）で洗浄されたガラスやプラスチックのボトルに格納してはいけません。
CITranox	シグマアルドリッチ	Z273236	酸性洗剤
アルゴンガス	Praxair社	AR 5.0UH-T	99.999パーセント超高純度