方法論記事

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

DOI：

10.3791/4398

⸱

2012年11月2日

 , 
1Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Stanford University

この記事について

サマリー

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CyTOFマスメーターの性能の毎日のチューニングと最適化のために必要な手順が記載されている。最適な試料調製および流量に対するコメントは、説明されてい

要約

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近年では、単一細胞の迅速な分析は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光標識された抗体を用いて実施されています。しかしながら、フルオロフォアの排出量スペクトルの重複の問題は同時プローブの数を制限している。これとは対照的に、むしろ蛍光団より、ICP-MS。1〜液体単一セル導入システムDVS科学夫婦による新しいCyTOF質量サイトメーターは、高濃縮金属同位体を含むキレートポリマーは、抗体または他の特異的なプローブに結合されている。2-5なぜなら金属純度と質量メーターの質量分解能により、隣接する同位体からの "スペクトルの重なり"はありませんので、補償行列は不要。さらに、ランタニド金属を使用しているため、生物学的な背景のため、自家蛍光の等価なものはありません。マスウィンドウで理論的には最大100個のラベルにまたがる原子量103から203は、同時に識別することができた。現在、35以上のチャンネルがサンプルの免疫学的プロファイルの前例のない解剖を可能にする、DVS科学から入手可能なキレート試薬を使用して利用できます。6月7日

マスメトリーの欠点は、プローブごとに別々の金属の同位体（前方または側方散乱のない同等品）、それは破壊的技術（リカバリを並べ替えの可能性なし）であるという事実のために厳格な要件があります。大容量メーターの現在の構成は、このように細胞のより高い入力番号を必要とするだけのセル伝送レート〜25％を持っています。

大容量メーターの最適な毎日の性能はいくつかの手順が必要です。最適化の基本的な目標は、M信号強度を低下させるとM 16で任意の所望の信号と干渉する酸化物（M 16）の形成を最小限に抑えながら、所望の金属の同位元素（M）の測定された信号強度を最大にすることである。最初のステップは、マシンはとても暑い、安定した私を暖めるためにあるCPはプラズマが確立されています。第二に、現在の、メイクアップガス流量の設定は、日常的に最適化する必要があります。サンプル採取時には、最大セルイベント発生率は、1000セル/秒に検出器の効率や処理速度によって制限されます。しかし、サンプルの品質に応じて、遅い細胞イベント発生率は（300〜500セル/秒）は、通常、セルのイベントとの間にこのように良い分解能はダブレットと破片の上に無傷のシングレットを最大化できるようにすることが望ましい。最後に、一日の終わりに、マシンの適切な洗浄は遊離金属に起因するバックグラウンドシグナルを最小限に抑えることができます。

プロトコル

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CyTOFためのすべての細胞サンプルは、固定、膜透過しなければなりません。これは、イリジウム含有DNAインターカレーターの大きいエントリーが可能となり、また、質量メーターに注入する直前にMilliQ水洗浄と再懸濁工程の間に、細胞溶解を防ぐことができます。

1。マスメーターの起動

  1. CyTOFソフトウェアプログラムを開きます。インストゥルメントのセットアップ]を選択します。カードケージのタブで、右下の隅に移動し、ボタンを "ON"にヒーターをクリックします。 200℃に到達するために、スプレーチャンバマントルに十分な時間を許可するようにヒーター上に所望の時間より前に少なくとも15分を回し
  2. MilliQ水で満たされた新鮮な注射器とシリンジポンプの白いノルムジェクト3mlの注射器を交換してください。
  3. ネブライザーのクリーニング。小さい液体導入口と大きなガス導入口の両方を介して5パーセントcitranox 2-3回を引っ張るために注射器とチューブを使用して噴霧器をバックフラッシュ。ミリQ水トンでバックフラッシュを繰り返す残留citranoxを削除O。
  4. CyTOFのフロントパネル上のライトが図1のように点灯していることを確認するためにチェックします。

figure-protocol-1
起動する前に、図1。CyTOFパネルが点灯します。

  1. アルゴンガスのボンベのバルブを開きます。これは、前面に "アルゴン"ライトがオンするようになります。
  2. ガス入口を補うためにネブライザを取り付けます。緩めてガスチューブコネクタをメイクと黒のゴム製のO-リングと白い円錐形のプラスチック片を外してください。ネブライザのガス導入口の茎に広い "ナックル"に注意してください。ガス導入口のコネクタを配置します。ガスポートの端の上に黒のOリングを置き、ポート茎の広い部分を過ぎてO-リングを強制します。メークアップガス配管上に白い円錐形のプラスチック製の指摘細い方が上にピース、ネジを配置します。
  4. インストゥルメントのセットアップウィンドウのRFG Controllerタブで、 "プラズマを起動"を押します。ネブライザーがすでに挿入されているので、 "OK"を押します。ソフトウェアは、チラーの電源をオンにガスの流れを開始し、プラズマを点火します。検出器の電圧がランプアップします。終了したら "プラズマ起動シーケンスが正常に終了した"と言ってポップアップウィンドウがあるだろう。 "OK"を押します。新しいライトが（ 図2前面パネルの上で行う必要があります >）。

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プラズマ後の図2。CyTOF·パネル·ランプ点火して、起動が正常に完了しました。

  1. シリンジポンプの電源をオンにする。右上隅に、シリンジポンプを起動し、チューブを通して液体を流すとネブライザから出て噴霧を開始するには、緑色の "再生"ボタンを押してください。デフォルトの注射器の設定は、3mlの水のためのものです。それは水が​​不足したときにサンプルサンプルループを通って流れることができるようにするためには、シリンジポンプは定期的に変更する必要があります。画面の上部には、どのくらいの液体がシリンジポンプから流出したことを示すカウンターがあります。このカウンタの値が "3.000"に達するか、またはプランジャーがシリンジの端に当たったときに、シリンジポンプは停止します。シリンジを補充するときは、 "停止"のではなく、カウンターをリセットするには、青色の "一時停止"ボタンを押す必要があります。
マスメーターのe "> 2。毎日キャリブレーション
  1. 大量サイトメーターは、キャリブレーションの前に熱い、安定したプラズマを達成するために約20分が必要になります。高い値の3％以下に信号;チューニング手順の目的は、 "Gd155"（La139 + O16酸化物）を保ちながらTm169またはTb159の所望の信号を最大化することである。データ収集の設定]ウィンドウを開くには、新株予約設定]ボタンをクリックします。分析対象]タブでは、同位体の選択パネルを開くには、周期律表をクリックします。マニュアルに記載されたDVS科学チューニング溶液中の同位体を選択し、 "保存"をクリックします。
  2. 読取窓当たりの質量を（es）を開くためのボタンの読書パー同位体をクリックします。 "パルスカウント"して、新しい番号を入力し、 "入力"を押して再スケールy軸を選択します。
  3. チューニング溶液と緑の1ミリリットルNORM-ジェクト注射​​器を埋める。 "ロード"するために、サンプルポートセレクターを回して、チューニング溶液450μlを注入し、その後、 "注入"するためのセレクターを回す。データAcquisitの質量校正]タブでイオンSettingsウィンドウは、大衆によって流れているかを監視するために "Run"を押してください。右側は高い質量である間、ウィンドウの左側には、下の質量である。注：すでにアルゴンガス中のキセノン同位体（ 図3）によるTOF 9400から9800までの領域の信号が存在するであろう。チューニング溶液の同位体は、このディスプレイのすじ（ 図4）として表示を開始するまで待ちます。

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図3マスキャリブレーション]タブウィンドウを、洗浄溶液と水すすぎ後に種々の同位体のためのバックグラウンドレベルを示す。 TOF 9400-9800周辺地域には、アルゴンガス中のキセノン同位体に対応しており、必ず存在するはずです。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図4マスキャリブレーションタブウィンドウは、DVSチューニング溶液中で様々な同位体に対して縦スジを示すが。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

  1. ウィンドウを読む当たりの質量（es）に戻って、左上にある緑色の "再生"ボタンを押してください。ステップ2.1で選択した各同位体は、異なる色の線で表されます。デフォルトのx軸は秒で、 "時間"です。彼らは安定しているまで、異なる同位体のレベルを監視します。
  2. 現在のチューニング。データ収集の設定]ウィンドウの[パラメータ]タブで、ドロップダウンメニューから "現在"を選択します。 = 0、仕上げ= 10、ステップ値= 0.5、セトリング時間= 200を起動してみようと、 "保存"を押します。読み取り窓とヒットプレイ当たりの質量（ES）の戻るボタンをクリックします。 x軸は、今 "現在"です。どこ同位体ピーク（ 図5）、Rの信号に注意してください ECORD。インストゥルメントのセットアップウィンドウのDACチャネルの設定]タブの下で、 "現在"までスクロールダウンして、この新しい値を入力します。 "実際の電流値を設定します"を押し、次に "保存"。

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図5：現在のチューニングプロフィール。

  1. メイクアップガスのチューニング。ドロップダウンメニューに変更する "メイクアップガスを。" = 0.95、ステップ値= 0.05、セトリング時間= 200 = 0.55、終わりを始めよう。保存を押してください。読み取り窓とヒットプレイ当たりの質量（es）に戻ります。 x軸は "メイクアップガス"流量になりました。どこ同位体ピークの信号が記録されます。終わり近くの"Gd155"信号（ 図6）の急激な増加を観察します。 DACチャネルの設定]タブに戻り、 "ガスメイクアップ"までスクロールして、この新しい値を入力します。 "実際の電流値を設定します"を押し、次に "保存"。

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図6：メイクアップガスチューニングプロフィール。

  1. 所望の同位対酸化物の比率を記録。チューニング溶液の第二450μlの注射を行います。 [パラメータ]タブで、ドロップダウンメニューから "時間"を選択し、= 0、終了= 10、ステップ値= 1時間= 200、セトリング始めましょう。 "保存"を押してください読み取り窓あたりの質量での "遊び"（es）を打つ。線は（ 図7）が安定した後、Tm169またはTb159（高い値）の左上のボックスに値を読み込むには、カーソルを使用し、また"Gd155"値（価値の高い<3％）。また、これらの値は、今後の参考のためにチューニングファイルに保存することができます。

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図7電流とメイクアップガスを最適化した後チューニング溶液信号強度の測定。

  1. SAMのクリーニングPLEループ。 DVSのWash Solutionを500μlのに続いて、サンプルループを通ってMilliQ水3mlを注入します。質量校正]タブで "実行"を押してクリーニングの進行状況を監視します。縞の強度が（ 図4）バックグラウンドレベル（ 図3）にダウンするまでMilliQ水とモニタの3ミリリットルで従って、減少し始めるまで洗う。

3。実行中のサンプル

  1. アクイジション·ウィンドウを開きます。デフォルト設定：=デュアル、デュアルカウントキャリブレーションを分析するために、信号=データのオンザフライ分析=を行います。ノイズリダクションが選択されています。必要に応じてこれらのいずれかが変更される場合があります。ファイル名を入力します。すべてのファイルはE :/ /ドライブに保存しなければなりません。
  2. 買収の遅延を設定します。サンプルループと噴霧器の間の配管の長さのために約30秒のセルのイベントを登録することに若干の遅延が発生します。したがって、和 "取得の遅延"の合計と "検出器セント能力の遅れ "とは、少なくとも30秒でなければなりません。ディテクタ安定遅延は少なくとも20秒でなければなりません。
  3. データ収集時間を設定します。 "取得時間は"あなたはあなたのサンプルを実行する秒数です。全体450μlのサンプルループを充填すると、600秒が完了するのを必要とするでしょう。それは50から100秒がサンプルキャリーオーバーを最小限に抑えるために、実行時の最後に追加することをお勧めします。
  4. サンプルの再懸濁。機械の中の塩のビルドアップ最小限に抑えるには、MilliQ水での最終再懸濁し、続いて細胞染色の最後にMilliQ水で少なくとも2回の洗浄が行われることが示唆された。細胞ペレットを再懸濁するために使用されるMilliQ水の量は最初に使用したセルの数と全体の染色手順後の細胞回収に応じて異なります。手始めに、10 6（開始）細胞/ mlである。再懸濁した後、凝集物を除去するために、セルストレイナーでろ過する。
  5. サンプルの実行を開始しています。現在のサンプルのための新しいファイル名を入力してください。 "LOAD"にサンプルループバルブを切り替え、次に取得ウィンドウで "実行"を押し、 "注入"に切り替え、サンプルを注入します。
  6. 細胞イベントを登録する。細胞は、各垂直同位/マーカチャネル（ 図8）のマークの横のコレクションとして、スナップショットウィンドウに表示されます。大容量メーターが1,000細胞/秒を登録することができますが、セルのイベント間の良好な分解能は、通常300から500セル/秒で得られる。これは、〜1セル/画面リフレッシュの平均に対応する。セル·イベント·カウンタは登るを開始する前に、それは30秒程度かかることがあります。これは、 "オンザフライ"データ処理によるもので、全くセルのイベント情報が失われることはありません。

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図8実行中のサンプル中に取得ウィンドウは、3つの別々のセルのイベントに関連付けられている要素に対応するスポットの横の行を示す。ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 細胞イベントの質。各同位体チャネルだけでなく、セルのイベントレートでストリーキング任意の背景に注目してください。大量サイトメーターは、バックグラウンドを超える信号に一定の増加など "細胞イベント"なので、遊離金属または非結合抗体 "とは、細胞イベント"カウントを変更することができるからバックグラウンド信号を認識しています。また、高すぎる濃度で細胞を実行すると、ダブレットイベント数の増加を引き起こす可能性があります。背景は、追加の洗浄またはそれ以上の細胞希釈することによって減少させることができます。ダブレットは増加し、実行時のコストで、高い細胞希釈によって最小限に抑えることができます。
  2. サンプルデータ収集を終えた。アクイジション時間に達したときに、データの収集が終了します。とポップアップウィンドウの前に遅延のビットが存在します "OK"ボタンが表示され、再び、これは、 "オンザフライ"のデータ処理によるものです。サンプル集録は、premat停止することができます"Stop"ボタンを押すことでurely。この場合、既に登録されているすべてのセルのイベントが出力ファイルにカウントされ、処理されます。
  3. 各サンプル間のMilliQ水の少なくとも500μlの注射はまた、試料のキャリーオーバーを最小限に抑えることができます。

4。使用後に洗浄機

  1. ソリューションを洗う。最終サンプルが実行され、サンプルループは、水で洗い流された後、サンプルループに洗浄液450μlを注入します。ステップ2.8のように、データ収集の設定]ウィンドウ（ 図9）の質量校正]タブの遊離金属の放出を監視します。遊離金属信号が低下し始めたら、MilliQ水3mlで洗い流して、バックグラウンドレベルが達成されるまで監視します。

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図9マスキャリブレーションタブウィンドウ、DVSの洗浄溶液で実行後の洗浄中。 TOFの領域9800から11000で縦スジは、マシンから消去されている抗体ラベルの同位体です。 TOF 11500周りの縦筋が2つのIRインターカレー同位体に対応しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

5。マシンのシャットダウン

  1. インストゥルメントのセットアップウィンドウのRFG Controllerタブで、 "プラズマの停止"を選択します。手順が完了したら、ネブライザーを削除するかどうかを確認するポップアップウィンドウがあるでしょう。 "OK"を押します。カードケージのタブでは、ヒーターをオフにします。アルゴン供給のバルブを閉じます。
  2. 噴霧器の除去。慎重に後方に引いて、スプレイチャンバからネブライザを取り外します。ネジを外し、試料導入ステップ1.6からチューブと脇に置きます。少し緩めるために緩めてメークアップガス導入接続は、その後ネブライザーをやってのける。螺フィッティングにしておくと、lのチャンスを減らします黒いゴム製のO-リングと白い円錐形のプラスチック片をosing。
  3. ネブライザーのクリーニング。ステップ1.3のように、注射器とチューブを使用し、5％citranoxと噴霧器の両方のポートをバックフラッシュ。ストア、次回使用するまで5％citranoxで、覆われている。

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結果

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上記のプロトコルに従うことで、4つのことを達成する必要があります。まず、大量のメーターのための十分なウォームアップ時間を許容するのに最適な信号と最小限の酸化物形成のために必要な熱い、安定したプラズマが生成されます。 MilliQ水とDVSウォッシュ溶液（ 図9）で質量メーターの第二に、十分な洗浄は、サンプルの取得（ 図8）の間にバックグラウンドを低減するために貢献し、チューブとマシンの他の部分に金属吸着のレベルを減らすのに役立ちます。また、マシンで立ち往生し、それによってサンプルからサンプルへのキャリーオーバーを最小限にする恐れがあります任意の細胞を除去するのに役立ちます。酸化物の質量M 16でバックグラウンドを最小限に抑えながら、大容量メーター（ 図5-7）の第三に、酸化物の形成を完全に防止することはできませんが、適切なチューニングは、所望の質量Mに最適化全信号を助けるでしょう。 図10に 、不適切なチューニング（マゼンタ）で有意に増加した酸化物の形成に見られるようにM 16は、適切にチューニングされ...

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ディスカッション

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過去数十年では、蛍光フローサイトメトリーは、表面発現の観点および機能アッセイの両方において、単一細胞を解析するための馬車馬方法であった。しかし、蛍光色素のスペクトルの重複の問題が同時マーカーの数を制限している。 12以上の同時マーカーを用いた実験が報告されているが、必要な補償金の額は、これは技術的に困難になります。

代わりにフルオロフォアの、質量サイトメトリーは、抗体のラベルのような金属のためのキレート部位を有するポリマーを使用したDVS科学によって開拓1-3金属の純度とICP-MSの質量分解能により、効果的には"スペクトルの重なりが"ありません使用されている要素のほとんどが生物学的に関連していないので、原因となるために少し背景もある "autofluoresenceは。"これらの事実は、単一の実験内の30以上の同時マーカーの使用を許可します。6,7広いDYもあります典型的な蛍光実験より、ICP-MSにおける信号のダイナミックレンジ。

しかし、...

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開示事項

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著者ヒト免疫監視センターでの仕事の両方、大量メトリーを含めて、アッセイのコストを回収するためだけに利用料をチャージスタンフォード大学のサービス·センターに配送します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、フィードバックのために博士エヴァン·ニューウェル博士とショーンBendallに感謝したいと思います。我々はまた、マルチランタニド含有のポリスチレンビーズのサンプルについては、DVS科学と博士はショーンBendallに感謝したいと思います。我々は、NIHの助成金2 U19 AI057229からの資金のために感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 注釈
CyTOF TMマスメーター DVS科学
洗浄液 DVS科学 201071 水に0.05％のフッ化水素酸
ソリューションのチューニング DVS科学 201072 0.5ppmのラ、CS、Tbは、Tm値、IR、トレース硝酸
Euを含有ポリスチレンビーズ DVS科学 201073 自然豊かEuの同位体が含まれ、約1万個/ mLで供給ビーズを
マルチランタノイド含有（ラ/ PR / TB / TM /呂） - ポリスチレンビーズ DVS科学まだ市販されている上場ランタニドの自然豊か同位体が含まれています
硝酸（濃） フィッシャー·サイエンティフィック A467-500 オプティマ微量金属純粋なICP-MSのグレード
セルストレーナーキャップ5mLを有するポリスチレン丸底チューブ BD 352235 注入前の細胞サンプルをフィルタリングするために使用
ノルムジェクトtuberkulinシリンジ1mLのヘンケサスウルフ 4010-200V0 シリコンフリー、ラテックスフリー
ノルムジェクトシリンジを3mL ヘンケサスウルフ 4010.000V0 シリコンフリー、ラテックスフリー
MilliQ水 18MΩの純水は、市販の洗剤（バリウム現在の彼らの高いレベルのために）で洗浄されたガラスやプラスチックのボトルに格納してはいけません。
CITranox シグマアルドリッチ Z273236 酸性洗剤
アルゴンガス Praxair社 AR 5.0UH-T 99.999パーセント超高純度

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
  2. Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
  3. Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
  4. Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
  5. Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).

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