ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

Jordan L. Cocchiaro; John F. Rawls

doi:10.3791/4434

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方法論記事

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

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DOI：

10.3791/4434

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2013年2月20日

Jordan L. Cocchiaro¹ , John F. Rawls¹

¹Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

本研究では、標準的な胚マイクロインジェクション装置および実体顕微鏡を用いた、ゼブラフィッシュ幼魚への新しいマイクロガバージュ（経管投与）法を提示します。マイクロガバージュが、多様な物質をゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔内へ特異的に、かつ制御された量で投与するための安全で効率的な手法であることを実証します。

要約

ゼブラフィッシュは、腸の発達^1-5、生理学^6-11、疾患^12-16、および宿主・微生物相互作用^17-25を研究するための強力なモデル生物として台頭しています。腸生物学を研究するための実験的アプローチでは、多くの場合、選択した物質を腸管腔内にin vivoで導入する必要があります。ゼブラフィッシュ幼魚モデルにおいて、これは通常、魚を選択した物質の溶液に浸すか、腹壁から注入することによって達成されます。浸漬法を用いると、物質が腸に届く経路やタイミングを正確に監視または制御することは困難です。このため、浸漬曝露は腸外組織に意図しない毒性やその他の影響を及ぼす可能性があり、腸内に導入できる物質量の潜在的な範囲を制限してしまいます。また、浸漬曝露中に摂取される物質量は、個々の幼魚間で大きく異なる場合があります²⁶。腹壁からの直接注入ではこれらの問題は発生しませんが、適切な注入は困難であり、実験結果に影響を及ぼしかねない組織損傷を引き起こします。本研究では、ゼブラフィッシュ幼魚のマイクロガバージュ（微量経管投与）法を紹介します。この手法の目的は、ゼブラフィッシュ幼魚の前腸管腔内に、タイミングを制御して物質を直接届けるための、安全で効果的かつ一貫した方法を提供することです。マイクロガバージュは、ゼブラフィッシュ研究を行うほとんどの研究室で一般的な、標準的な胚マイクロインジェクション装置および実体顕微鏡設備を利用します。魚をメチルセルロース中で適切に固定すれば、ガバージュは分あたり約7～10匹という速いペースで実行でき、投与後の生存率は投与物質に応じて100%に近づきます。また、マイクロガバージュを用いることで、浸漬曝露では魚にとって致死的な高濃度の物質であっても、腸管腔内に充填できることを示します。この手法の有用性を実証するために、腸管腔から腸外空間への移行を定量化できる蛍光デキストラン・マイクロガバージュアッセイを提示します。このテストは、マイクロガバージュ手順が適切に実行されたかを確認するために使用できるだけでなく、異なる実験条件（e.g. 遺伝子操作、薬剤処理、または環境要因への曝露）における腸上皮バリアの完全性を調べるための新しいゼブラフィッシュアッセイを提供します。さらに、蛍光マイクロスフィアを投与し、その後の移行をモニタリングすることで、ガバージュを用いて腸管運動を評価する方法を示します。マイクロガバージュは、生きた微生物、分泌された微生物因子/毒素、薬理学的薬剤、生理学的プローブなど、多様な物質の導入に適用できます。これらの能力により、ゼブラフィッシュ幼魚マイクロガバージュ法は、ゼブラフィッシュモデルシステムを用いた幅広い研究分野を強化する可能性を秘めています。

プロトコル

マイクロガバージュ用の幼魚を得るため、公表されている標準的なゼブラフィッシュの飼育および維持プロトコルに従った²⁷。魚の増殖には主に自然交配を用い、14時間明期/10時間暗期のサイクルで飼育した。本プロトコルは、受精後6～7日（dpf）のゼブラフィッシュ幼魚へのマイクロガバージュに最適化されている。これらの方法は、軽微な修正を加えることで、より若年または高齢の発達段階にも概して適用可能であると考えられる。特に断りのない限り、6 dpfの野生型TLゼブラフィッシュ系統を用い、魚には餌を与えなかった。すべての実験は、当施設の標準的なゼブラフィッシュ養殖施設から得られたシステム水中で行ったが、任意の適切なゼブラフィッシュ培地（e.g. 胚培地またはノトバイオティック・ゼブラフィッシュ培地 (GZM)²⁸）を使用することができる。本プロトコルでは、ユーザーが選択した培地を指して「ゼブラフィッシュ培地」と呼ぶ。

1. メチルセルロースの調製、経口投与用モールドの準備、およびマイクロガバージュ針の作製

実験の前日または当日の早い時間に、メチルセルロース、幼魚固定用のアガロースモールド、およびマイクロガバージュ用針を準備します。

3%溶液を作成するため、3 gのメチルセルロースを100 mlの滅菌脱イオン水またはゼブラフィッシュ用培地（用途に応じて選択）に溶解させる。ボトルにマグネチックスターラーバーを加え、水を沸騰直前まで加熱し、スターラープレートの上で強熱する。攪拌しながら、凝集を防ぐためにメチルセルロースをゆっくりと振り入れる。攪拌速度とスターラープレートの温度を、室温になるまで一日かけてゆっくりと下げていく。
メチルセルロースが完全に溶解するまで、一晩ゆっくりと攪拌を続ける。溶液は密閉容器に入れ、室温で数ヶ月間保存可能である。
メーカーの指示に従い、プラスチックキャスト（Adaptive Science Tools, TU-1）を用いて10 cmペトリ皿に3%アガロースゲルのモールドを準備する。乾燥を防ぐため、パラフィルムで密閉し、使用時まで4 °Cで保存する。実験前に室温または28 °Cまで温める。アガロースモールドは通常、数回再利用できる。
ホウケイ酸ガラスキャピラリーと、ワイドトラフ加熱フィラメントを備えたFlaming Brown Micropipette Puller (FT330B) を使用して、ガバージュ用針を数本作成する。針の作製に使用したプログラムは以下の通りである。

針の種類	圧力	加熱	プル（引張力）	速度	時間
胚用	500	315	100	50	200
ガバージュ用	500	315	125	75	200

フィラメントは装置によって異なる可能性があるため、ランプ時間（有効加熱時間）を記録してください。本プログラムにおけるランプ時間は8.57-8.79 msの範囲内です。このプログラムでは、従来のマイクロインジェクション針よりも短く、太い針が作成されます（図1）。これらの設定は、使用するマイクロピペットプラーに応じて最適化が必要な場合があります。

2. マイクロガバージュ針の切断、充填および校正

注記*：ニードルのクリッピングはこのプロトコルにおける極めて重要なステップです。また、ニードルの充填および校正の方法は、使用するマイクロインジェクション装置の種類によって異なります。本プロトコルはDrummond IIマイクロインジェクターを用いて最適化していますが、軽微な修正を加えることで、他のマイクロインジェクション装置にも適用可能であると考えています。インジェクションリグやニードルプラーは研究室によって異なるため、注入量を測定・校正することが重要です（セクション2.8を参照）。

実体顕微鏡下で針をカットします。ここでは、倍率を2.5倍に設定したLeica S6E実体顕微鏡を使用します。この設定では、100等分された接眼マイクロメーターの全長は2 mmとなります。
針の先端をマイクロメーターの端（目盛100）に合わせ、精密時計用ピンセットを用いて、先端から約1 mmの点（目盛48-50）で針をカットします（Figure 1A）。
針の直径は約27-30 μmで、鈍端である必要があります。100倍の倍率で針先を確認してください。鋭利な針やギザギザした針は、ガバージュ（経管投与）中の損傷確率を高めるため、可能な限り避けてください。
あるいは、利用可能な場合はマイクロフォージを使用することで、針のカット位置をより正確に制御し、火炎研磨によって針先の鋭いエッジを除去することができます（Figure 1B）。
ガバージュ溶液を調製します。ほとんどの用途では、マイクロインジェクターの正常な動作および前球へのガバージュ溶液の配置を実体顕微鏡下で確認できるよう、Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich) で0.5% フェノールレッド溶液を1:10に希釈したものを添加して溶液を調製します。フェノールレッド以外のロード染料については評価していませんが、使用可能です。
25G 5/8インチ針を装着した1 mlシリンジを用いてミネラルオイルを満たし、ガバージュ針を準備します。これをNanoject IIマイクロインジェクションユニットに取り付けます。
10 cmプラスチック製ペトリ皿をパラフィルムで包んで平坦で防水の表面を作り、そこにガバージュ溶液を約2 μl分注します。ミネラルオイル内に気泡が入らないように注意しながら、手動でガバージュ針をバックフィルします。
マイクロインジェクターの機能をテストし、吐出量を校正するために、3 cmペトリ皿にミネラルオイルを満たし、液滴のサイズが一定になるまでオイル中に注入します。マイクロメーターまたは実体顕微鏡の測定機能（利用可能な場合）を用いて液滴の直径を測定します。液滴の体積を算出します（計算式：V=4/3πr³ ）。針間の体積の一貫性をプロットしたものがこちらです（Figure 1C）。
ガバージュを開始する前に、針先を清潔なゼブラフィッシュ用培地で繰り返し浸し、残留したミネラルオイルを洗い流します。ミネラルオイルは非常に密度が高いため、針先から洗浄されていない場合、上皮組織に損傷を与える可能性があります。

3. ゼブラフィッシュ幼魚の麻酔、固定、および経口投与

実験前に、アガロースモールドを室温または28 °Cで温めておく。
3% メチルセルロースで3つの溝を覆い、ガバージュ（強制経口投与）用のアガロースモールドを準備する。メチルセルロースの量は、溝を覆い魚を固定するのに十分な量とし、すぐに乾燥してしまうほど少なすぎないようにする。
清潔な6ウェルプレートに、各実験群のゼブラフィッシュ幼魚を、3.5-4.0 mlのゼブラフィッシュ培地を含む別々のウェルに分注する。
適切なゼブラフィッシュ培地を用いて3x トリカイン溶液（0.05% w/v）を調製する。幼魚が入ったウェルに3x トリカインを等量加え、最終濃度を1.5x (0.025%) として、緩やかに旋回させて1ウェルずつ魚を麻酔する。
ゼブラフィッシュの動きが止まり次第、広口のガラス製パステールピペットとピペットポンプを使用してウェルから取り出し、頭を溝の45°の角度に、尾を溝の90°の方向に向けて、メチルセルロースの上に1匹ずつ配置する。鈍端の解剖プローブで軽く押し付け、位置を安定させる。
Nanoject II マイクロインジェクション装置を調整し、針がアガロースモールドの45°の角度とほぼ平行になるよう浅い角度に傾ける。魚を配置した後の調整回数を減らすため、針の伸展範囲がモールドウェルの底を越えて届くことを確認しておく。
マイクロインジェクションユニットを、低速注入設定（23 nl/sec）で最大4.6 nlを放出するように設定する。この設定では、注入量が腸の前球をちょうど満たし、食道や総排泄腔から漏れ出さないはずである。実験目的に応じて、より少量の液量を使用する場合もある。
片手で固定された幼魚が入ったプレートを微調整しながら、同時にもう一方の手でマイクロインジェクションユニットのマニピュレーターを操作する。
麻酔された魚の口からガバージュ針を慎重に進め、食道を通り、食道括約筋をわずかに押し下げて、ガバージュ針の先端を腸の前球のすぐ内側に導入する（Figure 2、ステップ1-2、a&b）。
前球に入ったら、フットペダルまたは注入ボタンを軽く押し、物質を投与する。食道に大量の物質が放出されないよう注意しながら、針を素早くスムーズに引き抜く（Figure 2、ステップ3-4）。
ガバージュ後、広口のガラス製パステールピペットとピペットポンプを使用して、ゼブラフィッシュ幼魚を慎重に新鮮な培地へ移動させる。ピペットに、ネックの曲がり部分から約1インチ上の高さまで水を満たし、幼魚の頭付近のメチルセルロースに小さな水溜まりを作って固定を解除し、頭をゆっくりとピペットの口に持ち上げて、幼魚をメチルセルロースから吸い出す。魚とすべての水を、新鮮な培地を入れたディッシュにゆっくりと排出する。
新鮮な培地の中でピペッティングをゆっくりと繰り返すか、培地を数回振りかけて幼魚をすすぎ、メチルセルロースを除去して麻酔から回復させる。その後のイメージングおよび解析に使用するまで、幼魚をペトリ皿または6ウェルプレートに移しておく。

4. 経口投与の安全性および腸管バリア機能の完全性を検証するためのデキストランアッセイ

マイクロガバージュ（経口強制投与）を用いて、さまざまな物質を腸管内に届けることができます。例として、腸上皮のバリア機能の完全性を分析するために、Texas Redを結合させた10 kDデキストランを投与するプロトコルを以下に示します。パラセルラー透過性には、溶質の電荷とサイズに基づいて選択性が異なる、少なくとも2つの潜在的な経路が存在し、これらは「ポア（pore）」経路または「リーク（leak）」経路と呼ばれています²⁹。このデキストランは、パラセルラーポア経路を通じて腸上皮を吸収されるには大きすぎるため（サイズ制限〜4Å、10kDデキストラン〜23Å）^9,30-32、腸管バリアの完全性が損なわれていなければ、管腔内に保持されるはずです。10 kDデキストランはパラセルラーリーク経路を介して輸送される可能性がありますが、この経路は容量が小さくキネティクスが遅いため^29,33、本アッセイの時間枠内では起こる可能性は低いです。バリア機能の完全性を破壊するための「ポジティブコントロール」処理として、上皮のタイトジャンクションを破壊するEDTAの添加が提供されます^34,35。このデキストランガバージュアッセイは、ガバージュの手順が意図しない組織損傷なく安全に行われていることを示す品質管理テストとして使用できます。さらに、このアッセイは、遺伝子型や処置に応じた腸管バリアの完全性をテストするためにも使用できます。

以下の経口投与溶液を調製する：1% dextran/1x PBS/0.05% phenol red、および1% dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0.05% phenol red（陽性対照）。ddH₂Oで調製した5% dextranストック溶液は、凍結融解回数を減らすため、50 μlずつ分注して-20 °Cで保存する。また、1x PBS/0.05% phenol redの模擬投与溶液も調製する。

				陽性対照（EDTA）	EDTA不含
	ストック溶液	最終	希釈倍率	10 μl	10 μl
EDTA, pH 8	200 mM	20 mM	10	1	0
デキストラン	5%	1%	5	2	2
リン酸緩衝生理食塩水	10倍	1倍	10	1	1
フェノールレッド	0.50%	0.05%	10	1	1
			小計：	5	4
			二重蒸留水₂本ビデオでは、マウスの坐骨神経において、大腿神経の分枝を介して坐骨神経を刺激するための外科的手法を説明します。本手法により、坐骨神経に直接的な物理的損傷を与えることなく、神経活動を誘導することが可能となります。	5	6
			合計：	10	10

セクション3のプロトコルに従い、各実験条件につき10〜20匹のゼブラフィッシュ幼魚にガバージュを行う。可能であれば、これを2群または3群の重複群で繰り返す。
ガバージュ後、幼魚を麻酔から回復させ、新鮮な培地中で自由に泳がせる。
ガバージュ後18〜20分に、ステップ3.3と同様に幼魚を再麻酔する。3%アガロースブロックの上に、3%メチルセルロースを用いて幼魚を配置する（これにより、イメージング中の背景の反射を抑えることができる）。
蛍光実体顕微鏡（例：Leica M205C）とTexas Redフィルターセットを用い、吻端から総排泄孔の直後までが収まる倍率で幼魚を撮影する。
後で定量化および比較ができるよう、すべての画像を同一の露光設定で取得する。デキストランを注入したすべての幼魚の腸管腔内では強い蛍光が見られるが、バリア機能は腸管外組織（すなわち、体幹および血管）に現れるデキストランのレベルによって評価する（図5）。管腔内の蛍光が露出オーバーになっても構わないので、体幹の蛍光を可視化できる設定に露光を調整する。
各群がガバージュ後の回復に費やす時間およびガバージュ後のイメージングまでの時間がほぼ同一になるよう、ガバージュの時間をずらして行う。本実験では、1人の作業者が1群を完了させるのに約1時間かかる。魚はガバージュ後18〜20分に麻酔し、イメージングには1匹あたり約1〜2分を要する。
ImageJなどの画像解析プログラムを使用し、腸の直上の体幹領域における相対的な平均蛍光強度を定量化する。魚以外の画像領域で測定した背景値を差し引くことで、これらの値を正規化する。
GraphPad Prismまたは同様の統計ソフトウェアを用いて、画像解析から得られたデータをグラフ化し、解析する。

5. 腸管運動性を評価するための蛍光マイクロスフィアアッセイ

ガバージュ（経管投与）は、腸管への物質投与のタイミングと量をより精密に制御できるため、腸管運動研究における理想的な代替手法となります。ゼブラフィッシュ幼魚の腸管運動を測定するために、これまで報告されている手法には、顕微鏡による腸管の収縮や波状運動の直接観察^1,21,36や、黄緑色蛍光ポリスチレン微小球を混合した餌の投与²⁶があります。一部の研究では、食紅を含む培地に幼魚を浸漬させること³⁷や、時空間マッピングと呼ばれる特殊なビデオ解析技術^38,39を用いることで、腸管運動パターンの定量化が強化されています。本研究では、蛍光微小球を腸管の前球にガバージュ投与することが可能であり、微小球の移動を追跡することで腸管運動を評価できることを示す概念実証研究を提示します（Figure 6）。本手法とFieldら²⁶のアプローチとの主な違いは、ビーズを単独で導入する点であり、ガバージュ針の外径の制限により、ビーズを餌に混ぜて投与することはできない点にあります。

ゼブラフィッシュ稚魚を、受精後7日目（7 dpf）に実験を行うまで、35 mlの培地を入れた10 cmプレートで飼育する。5 dpfから、毎朝1回、約0.6 mgの粉末飼料（既報の稚魚用飼料⁴⁰；滅菌済みの1 mm接種ループを用いて投与）を給餌し始める。
Fluoresbrite YG 2.0 μm ポリスチレンマイクロスフィア（約2.5%水懸濁液）のボトルを静かに振って懸濁液を混ぜる。ピペッティングで特定の量を測定できるよう、ボトルからパラフィルム上に1滴分分注する。
エッペンドルフチューブに入れ、ベンチトップマイクロ遠心機で低速でビーズを遠心分離し、上清を除去して元の体積の1x PBSに置換する。この工程を繰り返し、マイクロスフィアを2回洗浄する。
0.25%マイクロスフィア（ストック懸濁液を1:10に希釈）/1x PBS/0.05%フェノールレッドを含むガバージュ懸濁液を調製する。稚魚1匹あたりに投与される4.6 nlのガバージュ量には、約2.6x10³個のマイクロスフィアが含まれている。
セクション3のプロトコルに従い、任意の数の稚魚にガバージュを行う。マイクロスフィアはある程度の浮力を持つため、懸濁液の均一性を最大限に高めるために、ガバージュは可能な限り迅速に行う必要がある。
本実験では、個体ごとの移行を追跡するため、15匹の稚魚にガバージュを行い、麻酔からの回復後、12ウェルプレートの単一ウェルで飼育した。ただし、より大きなグループにガバージュを行い、個体別ではなく集団として移行を評価することも可能である。標準的な手法についてはField et al.を参照すること²⁶。
蛍光実体顕微鏡を用い、異なる時間における生存稚魚内の蛍光マイクロスフィアの最も吻側（または前方）の位置をスコアリングして、腸管運動性を評価する。稚魚を1x (0.017%) トリカインで短時間麻酔し、マイクロスフィアの位置するゾーンをスコアリングするか、後でスコアリングするために画像をキャプチャする。
特定の腸管領域にマイクロスフィアが存在する全稚魚の割合を時間経過とともにグラフ化し、比較する。