方法論記事

LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

DOI：

10.3791/50028

⸱

2013年1月21日

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1Department of Plant Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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高スループットの葉測定のための主要なメソッドのデモンストレーション。葉の表現型によって多くの植物変異体または他の方法でスクリーニング植物を勉強したときにこれらの方法は、葉表現型解析を加速するために使用することができます。

要約

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ハイスループット表現型（フェノミクス）は（レビュー1と最近の例2-4を参照）、それらの機能に遺伝子を連結するための強力なツールです。葉は一次光合成器官であり、その大きさや形状は、工場内の発達や環境によって異なります。これらの理由から、葉の形態に関する研究は最高の半自動化ツールフェノミクス5,6によって行われ、多数の葉から、複数のパラメータの測定を必要とする。キャノピーシェードは、植物のアーキテクチャと生活史に影響を与える重要な環境合図です;応答一式を総称して日陰の忌避症候群（SAS）の7と呼ばれています。 SASの応答の中で、誘導された日陰の葉葉柄伸長およびブレード面積の変化は、インデックス8として特に有用である。現在までに、葉の形のプログラム（ 例えば 、SHAPE 9、ラミナ10 LeafAnalyzer 11 LEAFPROCESSOR 12）葉の輪郭を測定し、葉の形を分類することができますしかし、葉柄の長さを出力することはできません。葉の葉柄の大規模な計測システムの欠如は、SAS研究へフェノミクスアプローチを阻害してきた。本稿では、急速にモデル植物シロイヌナズナの葉柄長、葉身のパラメータを測定することができLeafJと呼ばれる新開発のImageJプラグインについて解説する。葉柄/リーフブレード境界の必要な手動補正は、我々はタッチスクリーンのタブレットを使用したことを時​​折葉のために。さらに、葉の細胞の形状及び葉の細胞数は葉の大きさ13の重要な決定要因である。 LeafJは別に我々はまた、セルの形状、面積、サイズを測定するためのタッチスクリーンのタブレットを使用するためのプロトコルを提示。私たちの葉の形質の測定システムは日陰回避の研究に限定されず、葉表現型解析により多くの変異体およびスクリーニング植物の葉の表現型解析を加速していきます。

プロトコル

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1。植物材料

この植物の成長プロトコルは日陰回避反応を検出するための目的としていることに注意してください。あなたの好きな条件の下で植物を育てることができます。

  1. 彼らは暗闇の中で4日間4℃（階層化）9センチメートルペトリ皿とストアに濾紙を浸した水でシロイヌナズナの種子は振りかける。
  2. シミュレートされた日の状態にこれらのペトリ皿を移す：1.86にFR比：80から100μE光合成有効放​​射（PAR）と遠赤サプリメントは、Rを持参する。長日条件（16時間明/ 8時間暗）、22℃の一定温度を使用する種子が発芽できるようにするために3日間この条件でインキュベートする。
  3. 土壌に発芽種子を移し、日条件下で植物を保つ。大規模な実験のために、私たちはラベルを作るためのMicrosoft Word 2004（またはそれ以降）でのデータマージマネージャを使用して各植物を標識するための小さなタグを準備することをお勧めします。
  4. 11日後のTR土壌へansferは、日陰の条件に対する植物の半分を移動：日としてではなく、0.52にR / FR比をもたらすために補足遠赤色光と同じ。
  5. 追加の12日後、植物は葉のイメージングのための準備が整いました。あなたは開発のスナップショットをキャプチャされるよう若い葉がまだ拡大しているのに対し、この段階では、古い葉が完全に成熟してきた。あなたのニーズに応じてさまざまな発達の時間を選択することもできます。

2。解剖葉の画像を取り込む

  1. 5長方形のフレームを持つ植物の遺伝子型と成長条件で標識された透明シートを準備します。一つのフレームは1から植物の葉に対応しています。 Microsoft Excelは、ラベルと一致してグリッドを印刷するために使用することができます。
  2. 二〇から六日目の植物の葉を解剖。
  3. スキャンは、フラットベッドスキャナで600dpiで残します。 1工場から出るノートは透明シートのサンドイッチに黒いウィンドウ内に垂直に配置する必要があります。葉に触れないようにしてください以下の手順でエラーを与える黒い窓枠と重複葉、へ。

3。 LeafJによる葉の画像解析

  1. ImageJのダウンロードImageJのプラグインフォルダにLeafJ.jarファイルをドラッグします。
  2. ImageJは1.45s以降14で画像ファイルを開きます。
  3. "イメージ>カラー>スプリットチャネル"による三色チャンネル（赤、緑、青）に画像を分割し、青チャンネルの画像にしきい値を適用します。
  4. 長方形ツール（ 図1A）で1植物から葉をすべて選択します。
  5. プラグインメニューから "LeafJ"を選択します。
  6. 表示されるダイアログボックスから、この植物のアノテーション情報を選択します。あなたができる"これらのオプションを編集"をクリックしてここに表示されるデフォルト値を編集します。
  7. LeafJプラグインを実行した後、 "OK"ボタンをクリックする前に、関心領域（ROI）のマネージャのウィンドウ（; 図1B必要な場合）の領域からトレース行を編集します。タッチスクリーンのタブレットは（iPadなど）は、この手順のために有用である。 iPadではエアディスプレイ·ソフトウェアを使用して外部モニタとしてコンピュータに接続することができます。
  8. 測定結果およびMicrosoft Excelまたは同等のソフトウェアに関連する情報（ファイル名、開花時期によって、解剖により測定など）をエクスポートします。

4。 ImageJの中で葉の細胞画像解析

  1. 切開修正する（ステップ2）スキャンした後にリファレンス15に記載のように残します。 FAA固定葉は少なくとも6ヶ月間、4℃に保つことができる。
  2. 顕微鏡観察15日までに1〜2時間抱水クロラール水溶液とインキュベート葉にFAAの固定を変更することにより、葉をクリアします。
  3. マウントはマイルの葉croscopeは毛を上に向けてスライドします。毛や静脈の近くに細胞を避け、主静脈のいずれかの側のそれぞれの葉の中心の肉層画像、複式顕微鏡で40倍の倍率を使用しています。
  4. タッチスクリーンタブレットとスタイラス（手順3で説明）の助けを借りて、ImageJのROI Managerツールで葉細胞の輪郭をトレースします。細胞画像解析はImageJの組み込み機能を使用しますが、LeafJを必要としません。

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結果

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1。葉柄と葉身の境界の推定値を示し、葉画像、およびその計測ウィンドウ

LeafJの最も便利な機能の一つは、葉身/葉柄境界（ 図1）の自動検出である。 LeafJアルゴリズムは次のように動作します。ビルトインImageJのParticleAnalyzer機能は、ユーザーの選択の内側の葉の向きを見つけて、決定するために使用されます。それぞれの葉のために葉の幅は葉の全体の軸に沿って決定されます。その後、軸に沿った各位置での幅の変更は、実行中のウィンドウを（焦点位置に近接した7つの位置の平均幅が焦点位置から遠位の7つの位置の平均幅から差し引かれる）を用いて決定される。葉柄/ブレード境界は幅の変化は、すべて計算された幅の差の90％よりも大きい葉基部を越えた最初の位置として定義されています。 LeafJは追加チェックがreliabiを高めるために行いますこの呼び出しのlity、具体LeafJも1）幅は長さの位置の狭い5％（これは葉柄基部に異常な呼び出しを防ぎます）を超えている必要があり、2）焦点位置に近接した地域は、大きな変化はありません幅で、3）焦点位置から遠位...

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ディスカッション

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私たちの "LeafJ"プラグインは手動測定のスループット約6倍に増加し、半自動的に葉柄の長さの測定を可能にします。葉柄の長さは、SASの重要な指標であり、またそのような冠水抵抗とhyponastic成長17のような他の現象のランドマークとなっています。したがって、このプラグインは、植物の研究者の広い範囲に役に立つかもしれません。

我々のプラグインは、十分に確立されたJavaベースのフリーソフトウェアはImageJで実装されています。これは簡単なクロスプラットフォームのインストールを行うことができます。 ImageJはすでにJavaと、ImageJマクロ言語（で書かれたプラグインの大規模なライブラリを持っているので、プログラムの修正のしやすさもLeafJプラグインの利点であるhttp://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial ：開始...

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開示事項

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特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

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彼はグラッドストーン研究所の博士がキャサリン·ポラードの研究室でサバティカルを入れたままLeafJはJNMによって書かれました。

この作品は、全米科学財団（助成番号のIOS-0923752）からの助成金によって支えられている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号
LEDは遠赤色光 Orbitec カスタムメード
透明性 IKON社 HSCA / 5
スキャナーエプソンエプソンパーフェクV700 PHOTO
画像J NIHの http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ カスタム http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
エアディスプレイ Avatronソフトウェア株式会社ブランク "> http://avatron.com/
iPad2のたApple Inc。 http://www.apple.com/

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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