ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

Summary

技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital 2光子顕微鏡を用いた。このメソッドは、正常および病的両方の状態における高分子の透磁率特性を直接測定することができます。

Abstract

例えば、血清アルブミンなどの大型不可欠巨大分子の尿中損失を伴う腎疾患は、長い足細胞、血管内皮細胞、および一斉に作業基底膜からなる透過バリアの変化によって引き起こされると考えられてきた。生体2光子顕微鏡を用いた我々の研究室からのデータは、フィルタアルブミンの取得は、近位尿細管細胞^{（PTC）1,2、}と呼ばれる細胞の初期のサブセットに生じると、以前に生理的条件下では考えられていたよりも透過性の糸球体濾過障壁（GFB）を明らかにした^3。

腎臓のろ ​​過および流体内容と分析⁴のサンプリングでこれらの初期の管状セグメントの内腔の微小穿刺を関与ろ過障壁の特性を確立することを研究するために使用前のテクニック。密接に対応し、これらの研究は事実上存在しないことを腔液のアルブミン濃度を決定する通常は尿中に検出されるものである。しかし、この技術によって定義されたサイズを有するデキストランポリマーの特徴付けは、血清アルブミンと同様のサイズのものを明らかにした管状の管腔および尿中のより高いレベルを持っていた。透過性の増大^5を示唆している。

ここでは、直接生体内での糸球体蛍光アルブミン透過性を可視化し、定量化するために使用される技術の詳細な概要です。この方法は、ボーマンスペース（尿ろ過の初期室）にろ過関門フィルタリングアルブミンの検出を可能に、そしてまた近位尿細管およびその後アルブミントランス⁶の可視化により、アルブミン再吸収の定量が可能になります。膀胱への途中後で管状セグメントに沿って蛍光アルブミンが存​​在しないことは、以前の近位尿細管セグメントにおける検索経路の効率を強調しています。さらに、この技術を適用したときの浸透性を決定するアルブミン実質的に同一の透過性値に類似した大きさを有するデキストランの^2を報告した。これらの観​​察結果は、直接、近位尿細管細胞の埋め立てに含まれる改変には多くの蛋白尿腎疾患の焦点を拡大する必要性をサポートしています。

Protocol

1。スルホ-ローダミン101スルホニルクロリド（テキサスレッド）へアルブミンラット血清の結合

1. 50ミリリットルコニカルチューブ中の最終濃度15 mg / mlの、100mMの重炭酸ナトリウムのpHは9.0の6.667ミリリットルで（RSA）ラット血清アルブミン100mgを溶かす。
2. 場所の氷/水ビーカー内の溶液と0〜4℃の間にクール
3. テキサスレッド塩化スルホニル（TRSC）10mgのバイアルに高品質の無水ジメチルホルムアミド（DMF）を200μlを加え、15秒間媒体上渦。
4. 渦RSA媒体上の液と溶解TRSCを追加します。
5. ホイルでラップ50ミリリットルコニカル（形成されたパラフィルムは、密封を確実にするために使用することができます）、水平方向のw /アイスのみと場所（気泡の形成を避ける）をゆっくりとソリューションを撹拌するためのロッカー上の氷のバケツに場所は、反応は0で継続することができますに4℃で1時間。
6. 0.9％食塩水の5 Lを作成し、クリップ付きのいずれか）を透析膜することができます室カットオフ50 kDaの分子量、b）は、ジを濡らすフロート·アナライザ、またはc）のスライド·アナライザカセット（すべての非共役TRSCの除去に適しています）のようにalysisチューブ。
7. 5 Lコンテナのw / 0.9％生理食塩水で透析室と所定の位置に置く反応混合物は、攪​​拌棒を用いて穏やかに撹拌しながら4℃で一晩....

Results

図3は、ミュンヘンウィスター系ラットFrömterと蛍光アルブミンの浸透性を決定するために取られるステップの表面の糸球体から撮影画像の一例を示す図である。ミュンヘンWistarラットとき飼育条件³でのこの株で見られる範囲内で、この個々の糸球体の落下に対して導出0.0111のアルブミンためGSC値。これらのイメージで見られる安定性は、慎重な計画と、図1および図2に示されている命令の実行によるものです。前述のように、腎臓を視るに使用される切開の配置はモーションアーチファクトのない安定した画像を生成する中で最も重要なステップです。

.......

Discussion

手順はここで我々は、彼らが次の落とし穴を回避するため、一貫性のある正確な透過性値が生成されたものであると感じるものを表す強調：

1. 散乱：長い波長の光子が散乱しにくい傾向があるので、赤色発光蛍光体の使用は、光をより効率的に回収を可能にする。どちら緑色または青色発光蛍光団を使用するので、毛細血管ループとボーマン空間³からの強度値の増加変動GSC年代に大きな変化をご紹介します。
2. 画像の深さ：深い3Dデータセットが通常（しばしば総深さ30-45ミクロンの間）に収集されていますが、上位10〜15ミクロンGSC値を決定するために最も適切な焦点深度を表しています。再び深い深度と感度の低下と放出された光子の散乱に起因する変動性の増加が来る。さらに重要なことはしかし、dは発生毛細血管ループの混雑です糸球体内eeper。ここでは、毛細血管ループはボーマンスペースを取り囲むボーマン嚢の端に密接に押し上げている。これは、誤って直接毛細血管ループを囲む多数の足細胞の1以上の領域を選択する可能性が高くなります。フィルタリングアルブミンの真の、より高い強度が報告されませんので、これはGSCのの過小評価につ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
オリンパスFloview 1000 共焦点/多光子顕微鏡	オリンパスアメリカ		検出器用フィルター:ブルー 430/100、グリーン 525/50、レッド 605/90
モードロック Ti:サファイア マイタイ レーザー	スペクトル物理学		調整可能な励起波長:~750-1150 nm
ガリウムヒ素リン光検出器	浜松製作所		注:フロントまたはサイドマウント構成が利用可能です。
変身画像処理ソフトウェア	分子動力学		注: バージョン 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 バージョン
取り扱い 鉗子	電子顕微鏡科学	Cat# 78266-04
メイヨー 解剖ハサミ	電子顕微鏡科学	Cat# 72962
CA マイクロハサミ モデル 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank	Heater ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl	Chloride Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
ラット血清アルブミン	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
高品質無水DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line オートクレーブテープ	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07