バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Summary

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

Abstract

クロマチン免疫沈降（チップ）は、生きた細胞のクロマチン中のDNAと異なるタンパク質との相互作用を決定するために広く用いられている方法である。例としては、配列特異的DNA結合転写因子、ヒストンおよびそれらの異なる変形状態が、そのようなRNAポリメラーゼおよび補助因子として酵素およびDNA修復成分を含む。その普遍性にもかかわらず、最新の欠如、相互作用の定量的な評価指標を可能材のベンチの準備の両方の正確な分析のための詳細な方法論があります。この情報の欠如に起因し、また、任意の免疫沈降のように、条件は実験条件の新しいセットの再最適化する必要があり、あるため、ChIP解析が不正確又は不十分な定量結果を受けやすい。

我々のプロトコルは、最終的に転写因子で精液の仕事に由来する：DNA相互作用^1,2が、感作に多くの改良を組み込ん困難な得る細胞タイプに対するVITY及び再現。プロトコルは、DNAの濃縮を定量する定量PCRを用いて、以下のプロトコルの半定量的変異体を使用して両方が正常^3,4使用されている。

PCR増幅された材料のこの定量的な分析は、計算行い、アッセイにおける制限因子を表す。重要なコントロールやその他の考慮事項は、下に変更を表示しないようにこのような研究対象のタンパク質（または予想に拘束されることにしないと予測遺伝子間領域としてアイソタイプをマッチさせた抗体の使用だけでなく、ゲノムDNAの制御領域の評価を含んで実験条件）。さらに、すべてのChIPのサンプルの入力材料の標準曲線を実験材料で濃縮度の絶対レベルを導出するために使用される。標準曲線の使用は関係なく設計されているどのように慎重にの、プライマーセット間のアカウントの違いを考慮するのに役立ち、また、効率が異なる単一プライマーセット用のテンプレート濃度の範囲全体にわたってences。我々のプロトコルは、我々は広範囲に後で、分析フェーズをカバーするという点で^5-8利用可能な他のものとは異なっている。

Protocol

1。マウス脾臓ナイーブCD4 T細胞の分離

1. インスティテューショナルアニマルケアと利用委員会（IACUC）プロトコルと一致して人道的な方法でマウスを生け贄に捧げる。脾臓を分析し、10％FBSを含むDMEMを10ml含むペトリ皿に入れてください。
2. 脾細胞を解放するために2つのスライドガラスのフロスト端部を用いて脾臓をつぶす。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。
3. 4℃で5分間、200×gで（典型的なローター直径の臨床遠心分離機用〜1,200 rpm）で遠心分離により細胞を回収
4. 室温（RT）で1分間、赤血球を溶解するために2ミリリットルACKバッファーで細胞を再懸濁する。 FBSを含むDMEM 8mlのを追加することにより、反応を停止させます。
5. 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収
6. DMEM含むFBS 5mlに細胞を再懸濁し、70ミクロンメッシュフィルター（BDファルコン、カタログ番号352350）を通過する。細胞をカウントして続行ナイーブCD4の分離にメーカーの指示を使用してCD4離キット（Miltenyi社、カタログ番号130-​​095-248）を用いて細胞は、T。 4で5分間200×gで遠心分離によってT細胞℃でナイーブCD4を収集FBSと10mlのDMEMで細胞を再懸濁する。

2。クロマチンの調製

1. タンパク質複合体：クロスリンクDNAに15分間DMEM中で細胞懸濁液に1％の最終濃度を37％ホルムアルデヒドを加え、穏やかにRTで岩（Nutatorを用いる）。
2. 125mMの最終濃度1 Mグリシンを添加することによって架橋を停止する。室温で5分間揺らし続けています。
3. 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収
4. 氷冷PBS含むプロテアーゼ阻害剤の5mlに再懸濁することにより細胞を洗浄。 3回合計氷冷PBSを含むプロテアーゼ阻害剤で洗浄し、4℃で遠心分離により細胞を回収℃に
5. 1ml中に細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷細胞溶解バッファー。 15分間、氷上でインキュベートする。細胞溶解の効率は0.4％トリパンブルー溶液（Sigma社、カタログ番号T8154）で細胞の小アリコートを再懸濁し、そして顕微鏡で観察することによって決定することができる。
6. 4℃で5分間、200×gで（通常〜1,200 rpm）で遠心分離により核を集める慎重に上清を捨てる。
7. プロテアーゼ阻害剤を含む核溶解緩衝液500μlの中の核を再懸濁し。 15分間、氷上でインキュベートする。
8. 出力レベル4、15秒バースト、氷の上で4回：Misonixソニケータ3,000、プローブの大きさ1.6ミリメートルを用いて細胞を超音波処理。各サンプルは、サンプルの過熱を防ぐために再度それを超音波処理する前に、1〜2分間氷上で冷却しなければならない。過熱は、クロスリンクの逆転を引き起こす可能性があります。
9. 4で5分間16,000 xgで（マイクロで〜13,200 rpm）で超音波処理クロマチンを遠心℃に
10. 明確なsupern20μlのアリコートを取りatant、DNAローディング染料を追加し、2％アガロースゲル（ほとんどのアプリケーションのために超音波処理したDNAの理想的な大きさが200-500 bpである）を通して電気泳動により超音波処理したDNAを確認してください。
11. UV分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。断片化クロマチンは℃のクロマチン免疫沈降反応を設定するためにすぐに使用されるか、または-80℃で保存することができます一般的に我々はマウス当たり2-3 X 10 ⁶精製したCD4 T細胞は7.5から10μgのDNAを得る。

3。クロマチン免疫沈降（すべてのステップが0-4℃で実施しなければならない）

1. プロテアーゼ阻害剤付きチップ希釈バッファーでμgの/ mlの5-10のDNA濃度（総容積= 1ミリリットル）に超音波処理クロマチンを希釈。
2. 入力として100μlの（10％）を保存します。氷の上に保管してください。
3. アリコート450μlの各アイソタイプコントロール（マウスまたはウサギIgG）及び目的の抗体としてラベル2 1.7ミリリットルマイクロチューブに。同じアイソタイプの複数の抗体が使用される場合、単一のアイソタイプCONTRオールは、この分析を実行するのに十分である。異なる動物源またはアイソタイプの抗体が使用されている場合は、複数のアイソタイプコントロールが必要になります。
4. それぞれのチューブに使用する抗体の特異性に応じて、特定の抗体、またはアイソタイプコントロールの2-5μgのを追加します。
5. °Cクロマチン - 抗体複合体の形成を可能にするために4℃で一晩Nutatorを使用してチューブを揺する。
6. 上記混合物にプロテインG磁気ビーズ（中断ビーズの1:1スラリー）を25μlを加え、4℃で少なくとも2時間揺することができ℃の我々のベンダーからビーズを直接使用することができる。
7. 磁気スタンドにマイクロチューブを置き、ビーズが磁化側に収集することができます。
8. 丁寧にビーズを乱すことなく吸引して溶液を除去。
9. 低塩洗浄溶液1mlを加え、穏やかにNutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。
10. 高塩洗浄溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。
11. 塩化リチウムの洗浄溶液1mlを加え、Nutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。塩化リチウムの使用は、ビーズと非特異的クロマチン相互作用の効果的な除去を改善する。
12. TE溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。
13. 溶出緩衝液を250μlを添加することによってビーズからDNAを溶出する。室温で15分間ロック。溶出液をオフにピペットして、新しい1.7ミリリットルのマイクロチューブでこの材料を保存します。もう一度繰り返し、溶出の両方を兼ね備えています。ビーズを捨てる。
14. クロスリンクは最終0.3 Mの濃度とのRNase Aを1μl（20メートルに5 M NaClを追加し逆転する溶出したDNAへグラム/ミリリットル）。容積500μlのように、ステップ3.2で保存した入力に溶出バッファー400μLを加える。入力に0.3 M、リボヌクレアーゼA、0.5 M EDTA、1Mトリス-HCl pH6.5の液20μlおよびプロテイナーゼK（20 mg / ml）で1μlの10μlの1μlのにNaClを加える。
15. 乾燥加熱ブロックで65℃で一晩チューブ℃でインキュベートする。 、サンプルの蒸発を避けるためにシールや開口部からそれらを保つためにチューブの重量を配置する。ハイブリダイゼーションオーブンを使用することもできる。
16. 室温に冷却管をしましょう​​。 1ミリリットルの100％エタノールを加え、-80℃で2時間、一晩インキュベート°C沈殿DNAへ。
17. ペレットに15分DNAに対して16,000 xgでチューブを遠心する。 70％エタノールと空気乾燥ペレットで一度DNAペレットを洗浄します。オートクレーブ蒸留水100μlのDNAペレットを再懸濁します。
18. 溶出緩衝液50μlの総容積でキアクイックスピンカラム及び溶出を用いてDNAを精製する。このDNAは、PCRのために使用する準備ができました。

PCR反応の "> 4。準備（すべてのステップを氷上で実施しなければならない）

1. チップと対応する入力サンプルから全DNAサンプルを収集します。また、ターゲットを絞った地域だけでなく、制御領域のすべてのPCR試薬とプライマーを集める。 "ホットスタート" Taq DNAポリメラーゼを使用してください。私たちは、この手順でDNA増幅を定量化するためにSYBRグリーンベースのアッセイを使用しますが、必要に応じて定量PCRマスターミックスキットを使用することができます。
2. 定量PCR分析における標準曲線を生成するための入力DNAの連続希釈を行う。例えば10％、1％、0.1％、溶出緩衝液中の0.01％は（ステップ3.18でキアクイックスピンカラムから）。この標準曲線テンプレートセットの濃度範囲と増分を96ウェルプレート（Genemate、カタログ番号T-3182から1の各ウェルにインプットDNAサンプルを10μl分注し等のChIP富化の予想されるレベルに基づいて変えることができる）、重複しています。
3. 10ミリリットルチップアイソタイプコントロールからのDNAと同様に、それぞれに特異的な抗体をディスペンス三重で井戸。
4. ターゲットプライマーまたはコントロールプライマー（各プライマー0.1μMの最終濃度）のいずれかを含む "マスターミックス"を作成し、各ウェルに10μLを分注する。たとえば、テンプレートで以下のマスターミックスを含有スペンスウェルに標的プライマーをウェルに緑色のマークが付けられ、コントロールプライマーを用いてマスターミックスを分配赤いマーク。
5. 井戸の底にすべてを収集するために、室温で1分間臨床遠心分離機（〜1,200 rpm）で、500×gで光学プラスチック封止膜と遠心分離機を用いたPCRプレートをカバーしています。
6. PCR反応を開始します。私たちは、ライトサイクラー480 II（Roche）をこの例では、定量PCRを実行するためのオペレーティングライトサイクラー480SW 1.5ソフトウェアを使用します。

プレインキュベーション：1サイクル：95℃/ 5分。

増幅：40-45サイクル：94℃/ 5​​秒、60℃/ 5秒、72°C/10秒（温度が融点TEMPERATUR未満2-3°CであるべきアニーリングプライマーのE）。

融解曲線：1サイクル。

冷却：1サイクル。

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

10％入力

10％入力

アイソタイプ

特定

B

1％入力

1％入力

アイソタイプ

特定

C言語

0.1％入力

0.1％入力

アイソタイプ

特定

D

0.01％入力

0.01％入力

E

10％入力

10％入力

アイソタイプ

特定

F

1％入力

1％入力

アイソタイプ

特定

G

0.1％入力

0.1％入力

アイソタイプ

特定

H

0.01％入力

0.01％入力

緑：ターゲット地域のプライマーを使用してください。

赤：制御領域のプライマーを使用してください。

5。分析

1. DNAの絶対量の定量化のためのプログラムのqPCRソフトウェア。重要なのは、未知の特定及びアイソタイプ試料における補間DNA量に標準曲線を使用することは、すべてのプライマーの品質と効率の評価とのマッチングは、サンプルで見つかった濃度範囲にわたって設定可能。さらに、それはまた、モルを提供する電子usingΔΔCqおよび関連の方法よりも最終的な相対倍濃縮結果にCQ（C _tまたはC _p）の値を変換するための信頼できる方法。
2. サンプルエディターに移動​​し、それらの標準曲線の値と種々の希釈の入力サンプルを（10％、1％、0.1％と0.01％）含むウェルをマーク。また、PCRプレートがレイアウトされているとおりに、未知のChIPサンプルを井戸にラベルを付ける。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、それに応じて各プライマーペアの反応は、標準曲線の値と実験およびアイソタイプ対照サンプルに対応する部分集合を指定する。
3. ライトサイクラーソフトウェアでは、サブセットエディタに移動し、入力サンプルと井戸と同様未知のChIPサンプルを含むサブセットをマーク。未知試料を分析のために、入力サンプルの既知濃度から生成された標準曲線を用いて定量することができる。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェア、指名サブセットcorrespで各プライマーペアのすべての反応にとめどなく流れ出ること。
4. PCR増幅が完了したら、 "絶対Quant/2ndデリバティブマックス"との分析を行い、分析し、Enterキーを押しOKためのサブセットを選択します。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、各サブセット中のDN​​A量にCqの値を変換します。
5. 入力サンプルの既知の濃度を用いて標準曲線を生成し、未知試料中に存在するDNAの絶対量が表示される "計算"を押してください。
6. せん断DN​​Aの品質が良好であれば、とプライマーは、標的部位に特異的に結合する場合には、PCR効率に近い2〜でなければならない。
7. 可能であれば、同じサブセットに対して "呼び出しのTm"と融解曲線分析を行います。単一のピークは、1つの特定の製品が増幅されたことを示します。特定のDNAの増幅はまた、アガロースゲルを介してDNAラダーと共にPCR産物を電気泳動することにより試験することができる。
8. としてデータをエクスポートタブさらなる分析のためにMicrosoft Excelで開くことができます区切りのテキストフ​​ァイル、。
9. Microsoft Excelを使用して、標的プライマー用アイソタイプコントロールで特定の抗体のためのDNA量を割ります。制御領域のプライマーに対して、この手順を繰り返します。同じアイソタイプの抗体は、複数の異なる免​​疫沈降に使用した場合、同じアイソタイプコントロールからの値が、これらのそれぞれを正規化する。複数の標的プライマー対が使用される場合、また、単一の制御プライマー対のセットからのDNA量は、各ターゲット（ 図1および2）の正規化のために使用されるべきである。出力値は、非特異的抗体の背景免疫沈降に対する各位置における特異的抗体免疫沈降倍濃縮を表す。
10. に対して相対的濃縮を取得するために制御領域プライマー倍濃縮（制御アイソタイプ）とターゲットプライマー倍濃縮を（制御アイソタイプ）割りバインドされていない領域（ 図1）を制御する。重要なのは、なぜなら各サンプルの総入力DNAと標準曲線の発生上記の免疫沈降値のそれぞれが、標準曲線から既にに正規化され、補間、およびように発現していることに注意して、マシンソフトウェアによって総入力の割合。
11. 免疫沈降または洗浄に使用されるバッファのストリンジェンシーが高すぎる場合には、アイソタイプ対照の増幅がサンプルが観察されない免疫沈降させながら、特異的な抗体で免疫沈降サンプルから堅牢な増幅が、観察されることが可能である。そのようなシナリオでは、標的領域と非結合領域の両方に特異的な抗体チップからのアイソタイプコントロールチップの量を減算する方がよい。相対的濃縮は、非結合領域（ 図3）差による標的領域に対する差を割ることによって算出することができる。

Results

もしあればクロマチン免疫沈降（ChIPの）プロトコルは、このように "ローディングコントロール"として、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマー対を使用してPCRで使用されるDNAの量で、相違のためにここコントロールを提示した。 図3に示す例では、標的領域としてマウスIL2プロモーターの利息および転写因子NFAT結合部位の我々のタンパク質に結合していない領域としてマウスACTB遺伝子のコード領域を使用している。あるいは、目的のタンパク質の結合を全く持たないことが知られている標的領域の上流または下流領域数キロベースは、この目的のために選択することができる。標的領域に対するプライマー対を設計する際には、PCR産物の理想的なサイズは、約100〜200 bpである。計算的にこれらのプライマーは、ゲノムのどこにも結合しないことを確認するためにも重要である。

デフに結合したタンパク質の相対濃縮アイソタイプ対照と特異的抗体の同一のセットが選択される場合は、ゲノムのerent領域を比較することができる。同じ標的領...

Discussion

上記プロトコルが正確にチップを用いた主要リンパ球からDNAの濃縮を定量化する堅牢な方法を提供します。このプロトコルで堅牢性のために一つの大きな理由は、生物学的には複製が含まれていることです。上記のプロトコルは3が、独立して計算される濃縮を複製し使用しています。出力は、変動性の尺度を提供するために、計算された濃縮および標準偏差の程度を提供するために平均化される。各試料について、3つの技術はまた、サンプル処理のばらつき、PCR増幅などの技術的な反復の変動量が異なる生物学的サンプル間で観察されるものよりはるかに小さい場合を排除するために行われる複製する。堅牢性のための第二の理由は、アイソタイプ適合コントロール抗体を含む複数の技術的コントロールの包含、標準入力DNA曲線の使用、及び非特異的なゲノム領域に対応する制御アンプリコンの使用である。

上記の方法の制限は、チップを使用して、一般的に遭遇するものに似ています。この方法は、制限要因は、超音波処理によるDNA断片のせん断され、やや貧弱な空間分解能に苦しんでいる。したがって、本方法の分解能は、DNAのわずか約500...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ホルムアルデヒド	シグマ	F-8775RT
リン酸緩衝生理食塩水	Hyclone	SH30256.01	°Cで保存。C
プロテアーゼ阻害剤錠剤	ロシュ	04693116001	4°Cで保存します。C
Protein G 磁気ビーズ	Active Motif	101945	4 °C;C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	-20°Cで保存してください。C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	-20 °C;C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	-20 °Cで保存。C
1 M Glycine			RT
Cell Lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			4 °C;C
核溶解バッファー (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			RT
ChIP 希釈バッファー (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			C
低塩洗浄バッファー (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			4 °C;C
高塩分洗浄バッファー (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			4 °C;C
LiCl洗浄バッファー(0.25 M LiCl、1% NP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM EDTA、10 mM Tris pH 8.0)			4°Cで保存。C
TEバッファー(10 mM Tris、pH 7.4、1 mM EDTA)			4°Cで保存します。C
溶出バッファー (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			新鮮な
5 M NaCl			RT で保存
0.5 M EDTA			RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	モデル: 421105
磁気スタンド	Promega	Z5342
Qiaquick PCR 精製キット	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	モデル: S3000
UV 分光光度計	NanoDrop Technologies	ND-1000
加熱ブロック	VWR	13259-030
ローテーター	VWR	80085-692
ベンチトップ遠心分離機	ベックマンコールター	モデル:アレグラX-12R
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5415 D
機器のテーブル