バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

1。マウス脾臓ナイーブCD4 T細胞の分離

1. インスティテューショナルアニマルケアと利用委員会（IACUC）プロトコルと一致して人道的な方法でマウスを生け贄に捧げる。脾臓を分析し、10％FBSを含むDMEMを10ml含むペトリ皿に入れてください。
2. 脾細胞を解放するために2つのスライドガラスのフロスト端部を用いて脾臓をつぶす。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。
3. 4℃で5分間、200×gで（典型的なローター直径の臨床遠心分離機用〜1,200 rpm）で遠心分離により細胞を回収
4. 室温（RT）で1分間、赤血球を溶解するために2ミリリットルACKバッファーで細胞を再懸濁する。 FBSを含むDMEM 8mlのを追加することにより、反応を停止させます。
5. 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収
6. DMEM含むFBS 5mlに細胞を再懸濁し、70ミクロンメッシュフィルター（BDファルコン、カタログ番号352350）を通過する。細胞をカウントして続行ナイーブCD4の分離にメーカーの指示を使用してCD4離キット（Miltenyi社、カタログ番号130-​​095-248）を用いて細胞は、T。 4で5分間200×gで遠心分離によってT細胞℃でナイーブCD4を収集FBSと10mlのDMEMで細胞を再懸濁する。

2。クロマチンの調製

1. タンパク質複合体：クロスリンクDNAに15分間DMEM中で細胞懸濁液に1％の最終濃度を37％ホルムアルデヒドを加え、穏やかにRTで岩（Nutatorを用いる）。
2. 125mMの最終濃度1 Mグリシンを添加することによって架橋を停止する。室温で5分間揺らし続けています。
3. 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収
4. 氷冷PBS含むプロテアーゼ阻害剤の5mlに再懸濁することにより細胞を洗浄。 3回合計氷冷PBSを含むプロテアーゼ阻害剤で洗浄し、4℃で遠心分離により細胞を回収℃に
5. 1ml中に細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷細胞溶解バッファー。 15分間、氷上でインキュベートする。細胞溶解の効率は0.4％トリパンブルー溶液（Sigma社、カタログ番号T8154）で細胞の小アリコートを再懸濁し、そして顕微鏡で観察することによって決定することができる。
6. 4℃で5分間、200×gで（通常〜1,200 rpm）で遠心分離により核を集める慎重に上清を捨てる。
7. プロテアーゼ阻害剤を含む核溶解緩衝液500μlの中の核を再懸濁し。 15分間、氷上でインキュベートする。
8. 出力レベル4、15秒バースト、氷の上で4回：Misonixソニケータ3,000、プローブの大きさ1.6ミリメートルを用いて細胞を超音波処理。各サンプルは、サンプルの過熱を防ぐために再度それを超音波処理する前に、1〜2分間氷上で冷却しなければならない。過熱は、クロスリンクの逆転を引き起こす可能性があります。
9. 4で5分間16,000 xgで（マイクロで〜13,200 rpm）で超音波処理クロマチンを遠心℃に
10. 明確なsupern20μlのアリコートを取りatant、DNAローディング染料を追加し、2％アガロースゲル（ほとんどのアプリケーションのために超音波処理したDNAの理想的な大きさが200-500 bpである）を通して電気泳動により超音波処理したDNAを確認してください。
11. UV分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。断片化クロマチンは℃のクロマチン免疫沈降反応を設定するためにすぐに使用されるか、または-80℃で保存することができます一般的に我々はマウス当たり2-3 X 10 ⁶精製したCD4 T細胞は7.5から10μgのDNAを得る。

3。クロマチン免疫沈降（すべてのステップが0-4℃で実施しなければならない）

1. プロテアーゼ阻害剤付きチップ希釈バッファーでμgの/ mlの5-10のDNA濃度（総容積= 1ミリリットル）に超音波処理クロマチンを希釈。
2. 入力として100μlの（10％）を保存します。氷の上に保管してください。
3. アリコート450μlの各アイソタイプコントロール（マウスまたはウサギIgG）及び目的の抗体としてラベル2 1.7ミリリットルマイクロチューブに。同じアイソタイプの複数の抗体が使用される場合、単一のアイソタイプCONTRオールは、この分析を実行するのに十分である。異なる動物源またはアイソタイプの抗体が使用されている場合は、複数のアイソタイプコントロールが必要になります。
4. それぞれのチューブに使用する抗体の特異性に応じて、特定の抗体、またはアイソタイプコントロールの2-5μgのを追加します。
5. °Cクロマチン - 抗体複合体の形成を可能にするために4℃で一晩Nutatorを使用してチューブを揺する。
6. 上記混合物にプロテインG磁気ビーズ（中断ビーズの1:1スラリー）を25μlを加え、4℃で少なくとも2時間揺することができ℃の我々のベンダーからビーズを直接使用することができる。
7. 磁気スタンドにマイクロチューブを置き、ビーズが磁化側に収集することができます。
8. 丁寧にビーズを乱すことなく吸引して溶液を除去。
9. 低塩洗浄溶液1mlを加え、穏やかにNutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。
10. 高塩洗浄溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。
11. 塩化リチウムの洗浄溶液1mlを加え、Nutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。塩化リチウムの使用は、ビーズと非特異的クロマチン相互作用の効果的な除去を改善する。
12. TE溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。
13. 溶出緩衝液を250μlを添加することによってビーズからDNAを溶出する。室温で15分間ロック。溶出液をオフにピペットして、新しい1.7ミリリットルのマイクロチューブでこの材料を保存します。もう一度繰り返し、溶出の両方を兼ね備えています。ビーズを捨てる。
14. クロスリンクは最終0.3 Mの濃度とのRNase Aを1μl（20メートルに5 M NaClを追加し逆転する溶出したDNAへグラム/ミリリットル）。容積500μlのように、ステップ3.2で保存した入力に溶出バッファー400μLを加える。入力に0.3 M、リボヌクレアーゼA、0.5 M EDTA、1Mトリス-HCl pH6.5の液20μlおよびプロテイナーゼK（20 mg / ml）で1μlの10μlの1μlのにNaClを加える。
15. 乾燥加熱ブロックで65℃で一晩チューブ℃でインキュベートする。 、サンプルの蒸発を避けるためにシールや開口部からそれらを保つためにチューブの重量を配置する。ハイブリダイゼーションオーブンを使用することもできる。
16. 室温に冷却管をしましょう​​。 1ミリリットルの100％エタノールを加え、-80℃で2時間、一晩インキュベート°C沈殿DNAへ。
17. ペレットに15分DNAに対して16,000 xgでチューブを遠心する。 70％エタノールと空気乾燥ペレットで一度DNAペレットを洗浄します。オートクレーブ蒸留水100μlのDNAペレットを再懸濁します。
18. 溶出緩衝液50μlの総容積でキアクイックスピンカラム及び溶出を用いてDNAを精製する。このDNAは、PCRのために使用する準備ができました。

1. チップと対応する入力サンプルから全DNAサンプルを収集します。また、ターゲットを絞った地域だけでなく、制御領域のすべてのPCR試薬とプライマーを集める。 "ホットスタート" Taq DNAポリメラーゼを使用してください。私たちは、この手順でDNA増幅を定量化するためにSYBRグリーンベースのアッセイを使用しますが、必要に応じて定量PCRマスターミックスキットを使用することができます。
2. 定量PCR分析における標準曲線を生成するための入力DNAの連続希釈を行う。例えば10％、1％、0.1％、溶出緩衝液中の0.01％は（ステップ3.18でキアクイックスピンカラムから）。この標準曲線テンプレートセットの濃度範囲と増分を96ウェルプレート（Genemate、カタログ番号T-3182から1の各ウェルにインプットDNAサンプルを10μl分注し等のChIP富化の予想されるレベルに基づいて変えることができる）、重複しています。
3. 10ミリリットルチップアイソタイプコントロールからのDNAと同様に、それぞれに特異的な抗体をディスペンス三重で井戸。
4. ターゲットプライマーまたはコントロールプライマー（各プライマー0.1μMの最終濃度）のいずれかを含む "マスターミックス"を作成し、各ウェルに10μLを分注する。たとえば、テンプレートで以下のマスターミックスを含有スペンスウェルに標的プライマーをウェルに緑色のマークが付けられ、コントロールプライマーを用いてマスターミックスを分配赤いマーク。
5. 井戸の底にすべてを収集するために、室温で1分間臨床遠心分離機（〜1,200 rpm）で、500×gで光学プラスチック封止膜と遠心分離機を用いたPCRプレートをカバーしています。
6. PCR反応を開始します。私たちは、ライトサイクラー480 II（Roche）をこの例では、定量PCRを実行するためのオペレーティングライトサイクラー480SW 1.5ソフトウェアを使用します。

プレインキュベーション：1サイクル：95℃/ 5分。

増幅：40-45サイクル：94℃/ 5​​秒、60℃/ 5秒、72°C/10秒（温度が融点TEMPERATUR未満2-3°CであるべきアニーリングプライマーのE）。

融解曲線：1サイクル。

冷却：1サイクル。

緑：ターゲット地域のプライマーを使用してください。

赤：制御領域のプライマーを使用してください。

5。分析

1. DNAの絶対量の定量化のためのプログラムのqPCRソフトウェア。重要なのは、未知の特定及びアイソタイプ試料における補間DNA量に標準曲線を使用することは、すべてのプライマーの品質と効率の評価とのマッチングは、サンプルで見つかった濃度範囲にわたって設定可能。さらに、それはまた、モルを提供する電子usingΔΔCqおよび関連の方法よりも最終的な相対倍濃縮結果にCQ（C _tまたはC _p）の値を変換するための信頼できる方法。
2. サンプルエディターに移動​​し、それらの標準曲線の値と種々の希釈の入力サンプルを（10％、1％、0.1％と0.01％）含むウェルをマーク。また、PCRプレートがレイアウトされているとおりに、未知のChIPサンプルを井戸にラベルを付ける。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、それに応じて各プライマーペアの反応は、標準曲線の値と実験およびアイソタイプ対照サンプルに対応する部分集合を指定する。
3. ライトサイクラーソフトウェアでは、サブセットエディタに移動し、入力サンプルと井戸と同様未知のChIPサンプルを含むサブセットをマーク。未知試料を分析のために、入力サンプルの既知濃度から生成された標準曲線を用いて定量することができる。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェア、指名サブセットcorrespで各プライマーペアのすべての反応にとめどなく流れ出ること。
4. PCR増幅が完了したら、 "絶対Quant/2ndデリバティブマックス"との分析を行い、分析し、Enterキーを押しOKためのサブセットを選択します。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、各サブセット中のDN​​A量にCqの値を変換します。
5. 入力サンプルの既知の濃度を用いて標準曲線を生成し、未知試料中に存在するDNAの絶対量が表示される "計算"を押してください。
6. せん断DN​​Aの品質が良好であれば、とプライマーは、標的部位に特異的に結合する場合には、PCR効率に近い2〜でなければならない。
7. 可能であれば、同じサブセットに対して "呼び出しのTm"と融解曲線分析を行います。単一のピークは、1つの特定の製品が増幅されたことを示します。特定のDNAの増幅はまた、アガロースゲルを介してDNAラダーと共にPCR産物を電気泳動することにより試験することができる。
8. としてデータをエクスポートタブさらなる分析のためにMicrosoft Excelで開くことができます区切りのテキストフ​​ァイル、。
9. Microsoft Excelを使用して、標的プライマー用アイソタイプコントロールで特定の抗体のためのDNA量を割ります。制御領域のプライマーに対して、この手順を繰り返します。同じアイソタイプの抗体は、複数の異なる免​​疫沈降に使用した場合、同じアイソタイプコントロールからの値が、これらのそれぞれを正規化する。複数の標的プライマー対が使用される場合、また、単一の制御プライマー対のセットからのDNA量は、各ターゲット（ 図1および2）の正規化のために使用されるべきである。出力値は、非特異的抗体の背景免疫沈降に対する各位置における特異的抗体免疫沈降倍濃縮を表す。
10. に対して相対的濃縮を取得するために制御領域プライマー倍濃縮（制御アイソタイプ）とターゲットプライマー倍濃縮を（制御アイソタイプ）割りバインドされていない領域（ 図1）を制御する。重要なのは、なぜなら各サンプルの総入力DNAと標準曲線の発生上記の免疫沈降値のそれぞれが、標準曲線から既にに正規化され、補間、およびように発現していることに注意して、マシンソフトウェアによって総入力の割合。
11. 免疫沈降または洗浄に使用されるバッファのストリンジェンシーが高すぎる場合には、アイソタイプ対照の増幅がサンプルが観察されない免疫沈降させながら、特異的な抗体で免疫沈降サンプルから堅牢な増幅が、観察されることが可能である。そのようなシナリオでは、標的領域と非結合領域の両方に特異的な抗体チップからのアイソタイプコントロールチップの量を減算する方がよい。相対的濃縮は、非結合領域（ 図3）差による標的領域に対する差を割ることによって算出することができる。

もしあればクロマチン免疫沈降（ChIPの）プロトコルは、このように "ローディングコントロール"として、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマー対を使用してPCRで使用されるDNAの量で、相違のためにここコントロールを提示した。 図3に示す例では、標的領域としてマウスIL2プロモーターの利息および転写因子NFAT結合部位の我々のタンパク質に結合していない領域としてマウスACTB遺伝子のコード領域を使用している。あるいは、目的のタンパク質の結合を全く持たないことが知られている標的領域の上流または下流領域数キロベースは、この目的のために選択することができる。標的領域に対するプライマー対を設計する際には、PCR産物の理想的なサイズは、約100〜200 bpである。計算的にこれらのプライマーは、ゲノムのどこにも結合しないことを確認するためにも重要である。

デフに結合したタンパク質の相対濃縮アイソタイプ対照と特異的抗体の同一のセットが選択される場合は、ゲノムのerent領域を比較することができる。同じ標的領域上の様々なタンパク質の濃縮は、DNAに結合した特定のタンパク質の量と同様に使用される抗体の特異性および親和性に依存するであろう。例えば、ヒストンを行っチップの場合の相対的な濃縮度は、典型的には、様々な細胞シグナルに応答して、DNAに結合し得る転写因子と比較して、より高い濃縮度値を返す。抗体の特異性が良好であれば、我々は通常、非連結コントロールの領域（ 図3、図4）を介して2-10倍濃縮を観察します。

図1。 relatを得るための計算を記述する実験的なレイアウトIVEは標的部位での特定の抗体のChIPの濃縮。定量的PCRは、特定の抗体およびそのアイソタイプ対照を用いて免疫沈降ChIPサンプル中のDNA量を得るために使用される。定量的PCRは、標的配列とゲノムの非連結コントロール領域にまたがるプライマーを用いて行われる。技術的には、bおよびcを複製し、プロトコルで説明したように、相対的濃縮は、各反復について算出された各ChIPの試料については、PCRが示さ、トリプリケートで実施されている。平均テクニカル出力値の計算が実行されます。分散は、この段階で分析することができ、理想的に低くなければならない。技術的なエラーの計算は、しかし、生物学的レプリケートの間の誤差を計算するための最後の式には含まれていない。むしろ、測定された生物学的な変化自体も、本質的に技術的な変化を含んでいます。 3つの実験複製は（色のついた、黄色、緑と紫のボックス内）のAVを入手するChIPの実験ごとに使用されているerageチップ信号とその標準偏差（SD） より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。のChIP富化の計算の代替方法は、DNAの量がアイソタイプ抗体から免疫沈降のケースでは非常に低く、定量PCR amplicationある悪く、DNAのこの量はDNA量から差し引くことができる折り目を得るために、特異的な抗体を用いて免疫沈降すべての技術的な複製のための濃縮。この計算方法は、すべての3つの実験で使用する必要があり、図1で説明したように、平均のChIP信号とその標準偏差（SD）を得るために複製する。

図4。 IL2におけるNFAT転写因子の相対的な濃縮プロモーター。従来のCD4 T細胞（TCON）と規制CD4 T細胞（Tregの）Foxp3EGFPマウスから単離した。TCON細胞の小画分を30分間PMA及びイオノマイシンで刺激した。チップは、実験プロトコルで説明したように実施した。 3つの技術は、それぞれを複製して、ここで提示されたデータには、3つの実験の繰り返しからのものである。これらの細胞型でマウスIL2プロモーター上の転写因子NFATc1およびNFATc2の相対的濃縮は、非結合領域3倍以上濃縮として示されている。

利害の衝突は宣言されていない。