C. elegansの走化性アッセイ

サマリー

定量の走化性応答の評価方法線虫（Caenorhabditis elegans）記載されている。走化指数（CI）は正確に特定のターゲットへのワームの応答を評価し、興味のある株と化合物との間の比較のプラットフォームとしての役割を果たすための方法として採用されました。

要約

多くの生物は、食料源を模索有害物質を避け、仲間を見つけるために走化性を使用しています。 線虫（Caenorhabditis elegans）は、印象的な走化性行動を持っています。

着臭剤のワームの応答を試験後ろ前提領域に置き、臭剤に応答誘発動きを観察することである。でも、多くの利用可能なアッセイで、有意なサンプルサイズを維持しながら、互いにワームの相互作用を最小限に抑えながら、対照および試験領域の両方に対して開始位置ワームを最適化が進行^中1-10の作業のままである。ここで説明する方法は、Bargmann らによって開発されたアッセイ¹を変更することによってこれらの問題に対処することを目的とする。ペトリ皿を4つの象限に分割され、 "テスト"二マーク二つの対向する象限は "コントロール"を付している。麻酔薬は、すべてのテストおよび制御部位に配置される。ワームがcircl、プレートの中央に配置されているeは非運動ワームは無視されることを保証するために原点を中心となった。彼らは試験および対照試料から等距離にあるように、4つの象限システムを利用ではなく、1 2または2 1にかかわらず、それらが始まった起源の側の、ワームの動きにバイアスを排除します。これは、ワームを遅らせたり、彼らの意図されたパスの不正確な解釈をもたらし、多くの遠回りルートを取るように強制することができ匂い、に対応するために他のワームのクラスタを通過することを余儀なくされているワームの問題を回避します。また、このメソッドは、より大きなサンプルサイズを有する研究者が無人の検定を実行し、割り当てられた時間の有効期限が切れた後のワームを獲得できるようにすることで、実用的な利点を示しています。

概要

ウォードは、最初の1973年⁵で走化性アッセイを開発し、それ以来、それははるかに到達するアプリケーションを持っています。神経生物学は、走化性アッセイのさまざまな方法を使って恩恵を受けた一つのフィールドである。嗅覚適応、学習および記憶の単純な形式は、C.において実証されている走化性アッセイ^6を使用してエレガンス 。それらはまた、C.を示すために使用されているエレガンスは、エタノールワームの行動の可塑性を示していないだけ寛容結果を開発することができますが、それはまた、ワームは人間³でアルコール依存症の研究に非常に有用であることを示しています。アッセイは偶数℃の能力を実証するために開発されているelegansのアソシエーションが化学誘引物質と食品^（OP50）7間ワームによって作られていることを示すことによって、短期および長期記憶を保存する。さらに、C.に関する広範な情報は、現在入手可能な与えられたelegansのゲノム、chemotaxiC.のS振る舞いエレガンスは、変異^1,8を誘導することによって何度も変更されています。これは、Cの開発など多くのエキサイティングなエンジニアリングの可能性を、可能にバイオレメディエーションツールとしてエレガンス 。したがって、1973年に走化性アッセイの初期の開発以来、それが頻繁に変更され、さまざまな分野の中で謎を解明するために使用されています。

特定のアッセイは、標的に向かってワームが撮影した特定のルートを発見することを目的とした。この種の典型的アッセイはウォード⁵によって開発されました。三ワームを15分間溶かした寒天上に置いた。彼らの動きは、それらが、プレートの中央に誘引へ勾配アッププレートの周囲から旅し、彼らが残した痕跡によってトレースされた。プレート上のすべてのワームは、各試験の終了時にクロロホルムを使用して逮捕された。この方法の一つの子孫誘引し、コントロールとプレートの中央に単一のワームを置い起源²からT等しく反対の距離。

ピアース·下村ら 。走⁹に関わる動きの正確な性質を観察するアッセイ法を開発しました。個々のワームが誘引のソースで最高潮に達する、誘引または放射状の形の勾配の均一濃度を含むいずれかの9センチメートルペトリ皿に入れた。ワームを認識し、コンピュータ·ソフトウェア·プログラムが観察された挙動を記録した。アッセイは、ワームを確実にするために実行したとして自動的にシャーレを調整する段階と一緒に働いていた顕微鏡に取り付けられたビデオカメラの視野内に残った。このことから、より詳細な情報は、Cで表示されたピルエットの原因について、発見されましたエレガンス 。

ここで説明したものに類似の他のアッセイは、試験化合物へのワームの大規模な人口の応答をテストした。 2象限走化性アッセイはあったC.様々な神経細胞、受容体、およびシグナル伝達分子がでるという役割を探索するために使用される線虫は、種々の化合物¹に曝した。 20-50の間に洗浄したワームが麻酔、アジ化ナトリウム（NaN ₃を）と一緒に極両端誘引とコントロールとのプレートの中央付近に配置した。 60分後、-1.0から+1.0までの値を有する走化性インデックスが誘引またはコントロールに貼付されたどのくらいのワームの差に基づいて生成した。以前のアッセイは厳密に非運動ワームを評価するために失敗したものの、同じような走化インデックスは、この記事で報告されたアッセイで使用されていました。このアッセイは、さらに走化性に神経切除の効果を試験に適用した。

100-200ワームは、4つの象限^3を含むプレートの中央に配置した場合に前述のアッセイの別の変形を行った。隣接象限のいずれかのテストが含まれていたり、物質を制御します。前のアッセイと同様に、ワームがスコアリングされる前に、アジ化ナトリウムの作用により固定化した。同様の方法は、C.の応答を評価する方法として、ここで説明されている種々の化合物に虫 。しかし、以下の方法は、唯一不動ワームから携帯分離閾値距離に合格したワームを評価するという利点を持っています。

他のアッセイは、不動のワームを無視するための同様のガイドラインを取り入れています。 Frøkjær·ジェンセンら 。揮発性および水溶性化合物¹⁰の両方をテストするために使用できる汎用性の高いアッセイを開発した。ペトリ皿を、4つの象限に分割した。上部と下部の象限は、溶媒を含まなかった。水を含んでいた左象限、右は誘引が含まれていました。水溶性化合物がAGAに直接配置されたのに対し、揮発性の匂い物質をテストする場合、分析物は、適切な象限にわたって、シャーレの蓋の上に置いたR。

Cの走化性応答を評価するための現在の存在のメソッド線虫は常に使用効率と精度の容易さを最適化するために洗練されている。アッセイは、ここで説明しながら、だから、ワームの最大数（最大スループット：Lee らによって実証スループットよりわずかに大きいプレート当たり250ワーム/時間^、3）を評価する機能があり、この方法の本当の強さはある以前アッセイ（ 表1）の属性の多くの簡潔集大成。

プロトコル

1。ワームの準備/洗濯

1. 若い成人¹¹にワームを同期させます。
2. ただOP50 E.の芝生をクリアした段階的なワーム5センチメートル走プレート上にSの基底のピペット2ミリリットル大腸菌 。ワームがバッファにプレート表面から洗浄されていることを確認するために、必要に応じてプレートを傾けて。
3. マイクロ遠心チューブにワーム-S基底解のピペット1ミリリットル。
4. 10秒は6,600 rpmでPicoFugeを使用するために遠心分離します。
5. 邪魔されずにワームのペレットを残して、Sの基礎を吸引。
6. ワームを洗浄するために数回反転、マイクロ遠心チューブに1ミリリットルS基礎溶液を加える。
7. 手順1.4から1.6、さらに3回繰り返します。
8. CAの最終体積に上清を吸引10秒5回目、今回のために遠心。 100μlの。
9. 各2μlのサンプルでは50〜250ワームが存在することを確認するためのNGMプレート上にワームのピペット2μlの。調整するSの基礎の小さいまたは大きい音量でワームを再懸濁することにより、必要に応じてSの基底におけるワームの濃度。
10. 1までの時間ワームを洗浄した後すぐにアッセイでワームを使用してください。

2。テストプレートを準備

1. 4等しい象限に皿を分ける5センチメートルプレートの下側​​をマーキング。走化性寒天又はNGMを使用することができる。 3試験の最小値は、テストされている遺伝的系統ごとに必要とされています。
2. 原点を中心半径0.5センチメートル（ 図1）の円をマークします。
3. サイトが起源と互いに等距離にあることを確認し、 "コントロール"のどちらか "テスト"のための "T"または "C"と各象限内のポイントをマークします。点が原点から少なくとも2cm離れてなければなりません。テスト象限と右上やコントロールなどの左下の象限（ 図1）のように左上と右下の象限をマーク。

3。アッセイを実行する

1. 試験化合物および0.5 Mアジド（麻酔が象限に到達するとワームを逮捕するために使用される）の同等のボリュームを組み合わせることにより、試験液を混ぜる。 0.5 Mアジ化試験化合物を希釈するために使用される溶媒を組み合わせることにより、対照溶液を混ぜる。
2. 起源へのペレットからワーム溶液（1.8で調製した）（2線が交差）のピペット2μlの。
3. 2 "T"のサイト上に試験溶液の直後に、ピペット2μlの。同様に、二つの "C"のサイト上に対照溶液と同じ量をピペット。
4. ワームと匂い滴が寒天に吸収された後、蓋を交換して、プレートを反転。
5. 60分後、4℃のインキュベーターにワームを配置。それはカウントすることができた場合にのみインキュベーターからプレートを取り外します。室温でワームのままにしておくと、彼らは再び結集することを可能にする。
6. 完全に内部のCIRCを越え各象限におけるワームの数を記録ル。
7. 試験および制御象限の両方で制御ソリューションを使って手順3.2から3.6を繰り返します。これは、制御板として機能します。そのような3つのプレートは適切なコントロールとして機能するように作られており、実行する必要があります。

4。スコアの解釈/走指数の決定

1. 式（1）を使用して走化性指数を計算します。これは、-1.0と+1.0の間で走指数が得られます。

（1）

走化性指数=（テスト象限の両方で＃ワーム - 両方のコントロール象限＃ワーム）/（得点ワームの＃合計）

+1.0スコアが目標に向かって最大限の魅力を示しており、化学的な目標を含む象限に到着ワームの100％を表します。 -1.0のインデックスは、最大反発力の証拠である。同様のアッセイ法は、既に^3（ 表1）を用いてきた。

2. 平均Chemotaxiを報告のインデックス（CI）及び平均値の標準誤差（SEM）。試験および対照プレートからのデータを比較するスチューデントのt検定を実行します。

結果

野生型（N2）C.を比較するODR-10（KY10）変異にエレガンス 。

私たちは、知られているCをジアセチル使用エレガンスは化学誘引物質、ジアセチル^1,12の受容体を欠いた変異のそれに野生型ワームを比較する。 野生型（N2）ワームを走化指数は、エタノール、および0.839から0.100±0.066であった±0.031から0.5パーセントジアセチル。予想通り、ジアセチル、野生型ワーム（P <0.003）より有意な化学誘引性応答を誘発する。これとは対照的にジアセチル受容体を欠いODR-10（KY10）変異体はコントロール（ 図3）から、有意差は認められなかったジアセチルCIを持っていた。

筆者

＃ワーム/プレート

ディスカッション

走化性は、神経細胞及び細胞機構の複雑なセットによって制御されているが、容易にかつ客観的に走化性アッセイを用いて定量することができる。アッセイから最良の結果を得るためには、特定の重要なステップを払わなければなりません。まず、ワームをステージングすると、一貫性のある実験結果をもたらすに不可欠である。異なるライフステージでのワームは¹³異なる振る舞い;ので混合ステージワームスキュー実験結果をすることがあります。第二に、すべてのE.を確保コリワーム洗い流す残留細菌がアッセイを妨害する可能性があるので、非常に重要です。麻酔薬、0.5-1 M-アジ化ナトリウムは、それが置かれた場所から1cmの半径内のワームを逮捕することに注意することも重要である。このことを考えれば、アジは少なくとも2cm原点から配置することが最も重要です。アジ、原点より1.5 cm以下を発見された場合、ワームは、内側の円内に麻痺され、いずれも得点されません。さらにアジドに、さらに配置され象限は、ワームが移動することができます。プレートはまた、試験間の一貫性を確保するために、結果が重力バイアスによって混乱されないようにレベル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
S Basal (- コレステロール) [5.8 g NaCl; 1 M K リン酸緩衝液、pH 6.0; dH2O を1リットルまで。] オートクレーブ
PicoFuge	Stratagene	400552
顕微鏡	Leica
解剖用	Leica
P1000ピペット	Gilson
P10ピペット	Gilson
0.5 M ナトリウムアジド
ケモタキサスアガー [1.6% BBL-アガー（ベントン・ディキンソン）または2% Difco-アガー。オートクレーブ。5 mM カリウムリン酸、pH 6.0; 1 mM CaCl2、1 mM MgSO4を加える]
エタノール/蒸留水
テスト化合物 (例: 0.5% ジアセチル)
アガー	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531