多分岐ポリグリセロールと赤血球（RBC）（HPG）の細胞膜修飾が提示される。修正された赤血球は、水性二相のパーティショニング、浸透圧抵抗と補体媒介細胞溶解を特徴としていた。表面タンパク質と抗原の迷彩は、フローサイトメトリーとマイクロタイピングシステム（MTS）の血液表現型カードを使用して評価した。
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この記事について
サマリー
要約
赤血球（RBC）輸血は、サラセミアメジャーおよび鎌状赤血球貧血の1から3のように、急性および慢性の医学的な問題の数の治療のために不可欠です。 RBC表面上の抗原の多数の存在（〜308既知の抗原4）のために、慢性的な輸血療法の患者は、輸血赤血球4,5のマイナー抗原のミス·マッチに起因する同種抗体を開発しています。ポリエチレングリコール（PEG）およびハイパーブランチポリ（HPG）などの親水性ポリマーのグラフト化することは、酸素、ブドウ糖、イオン3のような小さな分子の通過に影響を与えることなく、表面抗原と抗体の相互作用を防止するRBC膜上の除外層を形成する。現時点では方法だとRBC表面上の抗原の数が多い（タンパク質と炭水化物ベース）の存在とdによって提示された困難な課題の一部にユニバーサル赤血球ドナー細胞の生成のため利用できませんこのような方法のevelopmentが大幅に輸血の安全性を向上させ、飛躍的に赤血球の可用性および使用を改善します。本報告では、HPGとその評価のグラフト膜によって保護された官能赤血球抗原を開発するために使用されている実験が掲載されています。 HPGsは非常にコンパクトなポリマー6,7、生体適合性であり、脂質膜8,9とマスク赤血球表面抗原10,11を囲む細胞糖衣内に配置されると予想されます。
プロトコル
A.ハイパーブランチポリグリセリンの変更（SS-HPG）
- 場所は、丸底フラスコ中の60 kDaの（0.5グラム、0.0083 mmol）をHPG凍結乾燥させ、90℃で真空下で一晩乾かし℃に
- 室温にフラスコを冷蔵、無水ピリジン（3ml）中の乾燥HPGを溶かす。
- カルボキシル基とHPGで約8個のヒドロキシル基を官能基化するには、HPGの溶液に触媒量のジメチルアミノピリジン（ピリジン中5 mg / mlの溶液を1滴）を追加します。この混合物に、10分かけて0.5ミリリットルを滴下ピリジンに溶解し、無水コハク酸、（0.0067グラム、0.0664 mmol）を追加します。アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。
- 50 mlの遠心チューブに冷アセトン（4℃）40mlに混合物を沈殿させ、15分間27000×gでベックマンJ2-MCの遠心分離器を用いて遠心分離する。上清をデカントし、室温でアルゴンで洗浄することによって残留アセトンを除去する。
- カルボキシをアクティブにするにはスクシンイミジルスクシネート（SS）のグループとL基は、無水DMF（3ml）にカルボキシル官能HPGを溶かす。 HPG液にN-ヒドロキシスクシンイミド（0.0077グラム、0.0664 mmol）およびN、N'-ジイソプロピルカルボジイミド（0.0084グラム、0.0664 mmol）を追加し、アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。
- 冷アセトンで沈殿....
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結果
アカゲザルD抗原およびCD47 RBC表面タンパク質の迷彩は、蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって定量化した、代表的な結果を図1に示されている。 HPG-グラフト赤血球（灰色）の場合では、信号の強度は表面タンパク質のマスキングを示す細胞表面への抗体への結合の減少を示す制御赤血球（赤＆緑）に比べて（ピークが左にシフト）減少。
図1：フローサイトメトリーを用いた表面抗原およびタンパク質の迷彩の評価。 ）アカゲザルD（RHD）保護：ブラックシェーディングピークは陰性対照（非変性赤血球は、IgG1 PE標識で処理された）を表し、緑.......
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ディスカッション
ユニバーサルドナーの赤血球は輸血療法のための増強血液の可用性と安全性に大きな可能性を秘めている。 RBCはまた、彼らの長い循環と内在する生体適合性14、15に起因する有望な薬物送達ビヒクルと見なされます。本書で提示実験は、修正された赤血球をHPGのin vitroでの特性評価を行った。 in vitroでのプロパティと HPG修正赤血球の in vivoでの循環における最近8、11我々のグループで研究されてきた。 NaClおよびリン酸ナトリウムを補充Dextran500K/PEG8Kの水性二相系、赤血球内のパーティションには、赤血球の表面電荷にと表面糖タンパク質組成物16に依存します。 HPGsとRBC糖衣修飾の程度に応じて、修正されたRBCは低いデキストランから上部のPEG相にパーティションする傾向がある。二相系は赤血球表面改質の程度の安易な評価を提供します。溶解O自己血清のF赤血球は、細胞や生体表面に新しい材料を導入するので、彼らは外国人と免疫系媒介溶解およびクリアランス
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
この研究は、カナダ血液サービス（CBS）と健康科学（CIHR）研究パートナーシップ基金のカナダの協会によって資金を供給された。作者は彼らの研究施設の使用のために血の研究のためにUBCのセンターでLMB高分子ハブに感謝します。インフラ施設は、イノベーションのためのカナダの基礎（CFI）と健康研究のためのマイケル·スミス財団（MSFHR）によってサポートされています。 R. Chapanianは輸血科学MSFHR研究研修生ポスドクフェローシップのレシピエントにおける（CIHR / CBS）のポスドクの受賞者です。 JN KizhakkedathuはMSFHRキャリア調査官Scholarの賞の受賞者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グリシドール | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| トリメチロールプロパン | フルカ | （ON、カナダ） | |
| カリウムメチ | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| 無水ピリジン | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| 4 - ジメチルアミノピリジン | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| 無水コハク酸 | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| アセトン | フィッシャー·サイエンティフィック | （ON、カナダ） | |
| 無水ジメチルホルムアミド | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| N-ヒドロキシ | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| N、N'-ジイソプロピルカルボジイミド | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| MTSのカード | マイクロタイピングシステム（MTS）カード（フロリダ州、アメリカ） | ||
| デキストラン500kDaの | ファルマシア·ファインケミカル | （スウェーデン） | |
| PEG 8 kDaの | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| FITCモノクローナル抗アカゲザルD（RHD） | 商Biodiagnostics | （米国ペンシルバニア州） | |
| PEモノクローナル抗CD47 | BD Biosciences社 | （米国ニュージャージー州） | |
| Drabkinの試薬 | シグマアルドリッチ | （ON、カナダ） | |
| テーブル。赤血球膜とその分析にポリマーをHPGのグラフト化のために使用される化学薬品および試薬。 |
参考文献
- Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter. Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).
- Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D.
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再版と許可
