機械的に適応型ポリマーナノコンポジットの環境制御のMicrotensileテスト ex vivoでキャラ

Summary

方法が議論されていることで機械的挙動を時間の関数として監視される。サンプルがテストされ ex vivoで生理的環境をシミュレートするために、環境コントロールとmicrotensileテスターを用いて。この作品は、さらなる理解促進振る舞い。

Abstract

植込み型マイクロデバイスは^1-4いくつかの生物医学的なアプリケーションのために大きな注目を集めている。このようなデバイスは、材料、独自の利点と欠点^5,6を提供^する各々の範囲から作られている。最も顕著に、マイクロデバイスの寸法のために、高い弾性率は、生体組織への移植を容易にするために必要とされる。逆に、デバイスの剛性が誘発される局所的な歪み^7-9を最小限にするために周囲の組織と一致する必要があります。そこで、最近では機械的特性^10-14の変化に伴って環境刺激に応答することによって、これらの要件を満たすために、バイオ風材料の新しいクラスを開発した。水と高温（ 例えば体温）にさらされた場合具体的には、我々のポリ（酢酸ビニル）ベースナノコンポジットビニル（PVAc-NC）は、剛性の減少が表示されます。残念なことに、いくつかのメソッドは、in vivo ¹⁵ における材料の剛性、そしてメカを定量化するために存在生理的環境の外anicalテストはしばしば移植のための大規模なサンプルが不適切必要です。さらに、刺激応答材料はすぐに植後の初期剛性を回復することができる。そこで、シミュレートされた生理学的条件、水分及び温度制御^13,16,17を使用して保持を移植しmicrosamplesの機械的特性は、 生体外で測定することができる方法を開発した。

この目的のために、カスタムmicrotensileテスタが広く変化するヤング率（GPaの5〜10メガパスカルの範囲）でマイクロサンプル^13,17を収容するように設計された。私たちの利害が生物学的に適応神経プローブ基質としてたPVAc-NCのアプリケーションであるため、マイクロスケールでのサンプルの機械的特性評価することのできるツールが必要でした。このツールは、乾燥及び^17を冷却する試料を最小限に抑えた湿度および温度制御を提供するように適合させた。結果として、機械工植サンプルのアル特性は密接に植直前にサンプルのものを反映しています。

この方法の全体的な目標は、定量的刺激応答性、機械的に適応ポリマーベース材料のin vivoでの機械的特性、特にヤング率で評価することである。これは、第1注入から生じることに依存しない剛性の低減に寄与することなく外植後の試料の機械的特性の変化を最小限にする環境条件を確立することによって達成される。次いで、試料を注入処理、および試験（ 図1A）のために調製される。各サンプルを指定された期間外植ラット脳、（ 図1B）としてここに表されるラットの大脳皮質に注入される。この時点で、サンプル（ 図外植とすぐに読み込まmicrotensileテスターにした後、引張試験に供されている1C）。その後のデータ分析では、大脳皮質の環境でこれらの革新的な材料の機械的挙動への洞察を提供します。

Protocol

1。試料調製

1. 溶液キャストと圧縮技術^を使用して^10-12 25から100ミクロンの範囲の厚さのたPVAc-NCフィルムを準備します。
2. 膜とウエハとの間の密接な接触を促進するために70°C（ガラス転移温度以上）少なくとも二つ分間ホットプレート上で加熱することによってシリコンウエハに膜を付着する。このステップでは、準備されたフィルムは、平面微細加工プロセスのために必要であるSiウエハにフラットと固定されたままであることが保証されます。
3. レーザー微細加工（VLS 3.50、VersaLASER）による試験サンプルジオメトリにパターンフィルム。 1.0％の電力（0.5 W）、4.0％の速度（56ミリメートル/秒）、およびインチ^13,16 1,000パルスにCO ₂直接書き込みレーザー微細加工パラメータを設定します。
4. 横方向パッド寸法1.5×1.5 mm ²であり、薄暗い横梁とドッグボーン状の構造に環境条件（ "初期サンプル"）を確立するために使用されるパターンサンプル厚さが一致するensions 300 X ^3,000μm2で、全体のフィルム（ 図2）のもの。
5. 厚さは、その映画のマッチングのパターンex vivoでの実験のためのサンプル（ "インプラントサンプル"）ビームには300μm×6 mmの、。
6. 慎重にカミソリの刃とピンセットを用いてウェハからサンプルを解放します。
7. 試料の取り扱いについては、microtensileテスターでグリップシステムの一部として機能するように設計されたカスタム加工アクリルホルダーを準備します。レーザーエッチングされたマーキングは、ホルダーと端から1.5mmの中心線を示す。アクリルホルダーの中心線上にシアノアクリレートゲル系接着剤の少量を置き、慎重にホルダーにインプラントサンプルの1.5ミリメートルの長さを遵守し、マークされた中心線（ 図3）と重なる。各インプラントサンプルは1アクリルホルダーが必要です。粘着ゲルがのみACRに付着されてたPVAc-NC 1.5ミリメートル長さに沿って残っていることを保証するために注意してくださいカルボンホルダー。それ以外の場合は、接着剤ゲルは、サンプルの機械的挙動に干渉することがあります。
8. 少なくとも24時間、デシケーターに配置することにより、すべてのサンプルから水分を除去する。
9. 長さ、幅、および光学顕微鏡を用いて試料の厚さ方向寸法を測定する。

2。環境条件を確立

1. 初のモバイルグリップの間に、その後一定のグリップ間クランプ、（ 図4を参照）microtensileテスターにドライのセットアップサンプルをロードします。
2. microtensileサンプル向けノズルを、固定された位置に水で満たされた貯水池でエアーブラシをマウントします。プラスチックチューブを経由して空気圧縮機にエアーブラシを接続します。エアーブラシノズルが完全に閉じた状態で、空気圧縮機の電源をオンにします。
3. 引っ張り歪み（正株）およびtに印加圧縮歪み（負株）交互に環状microtensile試験手順を開始する彼サンプルは、応力 - 歪みプロットの線形弾性領域内に残っている。たPVAc-NCについては、ひずみが2％未満に制限されている。その歪みを達成するために必要な力を測定しながら、これらの実験で使用されるカスタムmicrotensileテスターに​​おいて、歪み速度を制御した。また、別のセットアップが結果ひずみを測定しながら、加えられた力を制御する可能性が伴う。
4. 徐々にエアーブラシノズルからの流れを増加させ、エアーブラシからの流量の関数としての応力 - ひずみプロットの傾きを監視する。 60秒の期間にわたってヤング率の有意な（> 10％）減少を生じない最大流量は、ex vivoでの実験に使用するレベルである。この時点で、（したがって、ヤング率の低減に寄与する）乾燥試料を濡らすことはありません湿度条件、また、in vivoで生物学的流体にさらされた後の乾燥サンプルはエスタされている最小にするblished。
5. サンプル近傍の温度を測定します。理想的なセットアップでは、デジタル読み出しと熱電対を含んでいるでしょうし、エアブラシの動作中に実行される。試料温度を37°C、生理的条件と一致するまで保有されるように放射熱源の強度と距離を設定する。

3。非環境コントロールに環境管理の比較

1. リン酸には少なくとも30分間浸しセットアップサンプルは緩衝食塩水。この時間後、サンプルを完全に飽和され、所定の温度でその最小ヤング率まで減少した。
2. 迅速にサンプルが乾燥しながら、エアーブラシをオフにして、microtensileテスターに​​サンプルをロードし、巡回microtensileテストを開始します。これは、非制御された条件下でいかに早くサンプルが乾燥を決定します。
3. microtensileテスターに​​第二PBS-飽和セットアップサンプルのロード、および環状microtensileテストを開始のエアブラシで。これは、管理された環境条件下でいかに早くサンプルが乾燥を決定します。

4。プローブ注入及び植

1. マイクロマニピュレータクランプと皮質組織に直​​交する位置にインプラントのサンプルを添付します。
2. 挿入の前に、組織の力学の均一性を確保するために生理食塩水で組織が十分に湿った保つ。
3. マイクロマニピュレータのハンドコントロールを使用して皮質にポリマー試料を下げます。一般的には1〜30分の間、ターゲットインプラント時まで皮質組織のサンプルのままにしておきます。軽く5分、軽くかけ時点の乾燥から組織を防止するために組織生理食塩水に浸した綿棒を使用して5分​​毎。
4. プローブが皮質に移植されている間、静止サンプルクランプから3.0ミリメートルのゼロ変位位置に駆動ロッドを設定することにより、現在注入したサンプルをロードするためmicrotensileテスターを準備します。また、エアーブラシノズルを設定する流量設定と放射熱源への適切な強度にステップ2.4​​に決定。
5. 指定されたインプラントの時間の終わりに、マイクロマニピュレータハンドコントロールを使用して大脳皮質のプローブを上げる。すぐに、慎重に、ステップ5.2で詳細に説明されているように、microtensileテスターに​​マイクロマニピュレータクランプと負荷からサンプルを削除します。

5。インプラントのサンプルのMicrotensileテスト

1. 植後の時間を節約するために、ステップ4.4で説明したようにmicrotensileテスターは、移植前にインプラントのサンプルを受け入れることは完全に準備ができていることを確認してください。
2. 直ちに植後、microtensileテスタークランプの2セットの間のサンプルをロードします。サンプルは1クランプの上半分として機能するように設計されたアクリルホルダーに装着されているので、ダウンしてモバイルグリップ、サンプル側のインプラントサンプルアセンブリを配置します。これは、試料がマウントされていることを確認することが重要であるように歪みがあるAPPLテスト中にサンプルにトルクを加えないようにだけ 、プローブの長さに沿ってiedを。このように、試料を各クランプの中央に装着する必要があり、クランプは、互いにレベルでなければならない。
3. クランプ間の距離が3.0 mmであり、プローブの端部が固定されたクランプ内に配置されるように試料位置を調整する。クランプ間のこの3.0ミリメートルの長さは、サンプル用のゲージ長であり、試料上の歪みを決定するために後で計算に使用される。
4. すぐに両方のクランプ間にサンプルを確保した後、同時に測定し、記録しながら、そして神経組織からの外植の2分以内に、一定の割合（ここで使用さ10μm/秒）でサンプルを長くするための引張方向にモーターを作動させるサンプルの伸長とサンプルを負担するために必要な関連する力（ロードセル、トランスデューサテクニックMDB-2.5を使用して）（変位インジケーター、Mitutoyu 543から561を使用する）。
6. 各サンプルおよび/ ​​または条件（ すなわち挿入時間 ）のセットごとにmicrotensileテストを繰り返します。

6。データ解析

1. εが適用された株である（式1）に記載の初期ゲージ長による伸長の距離を除算することにより、インプラント試料に照射工学歪み生伸びデータを変換、tは時間であり、dはマイクロメータにより測定変位であるインジケータ、およびL _0は、サンプルの初期ゲージ長である：
   （1）
2. TRAで、力（ニュートン）で割ることにより、試料上のエンジニアリングストレス生力のデータを変換する、式2に記載nsverse断面積：
   （2）
   試料に応力σここで、Fはロードセル（ニュートン）で測定された力であり、w _0は、サンプルの初期の幅であり、t _0は、サンプルの初期厚さである。
3. ストレスをプロットします（[T]をσ）対ひずみ（ε[T]）、Microsoft Excelなどのコンピュータプログラムを使用して、各サンプルのカーブ。
4. プロットの線形弾性部分を分離し、この部分にベストフィットラインを見つけるために、ソフトウェアベースのカーブフィッティングツールを使用します。ベストフィットラインの傾きは、試料のヤング率に相当する。プロットの隔離部分は、少なくとも10の応力 - ひずみ点を含むべきであり、勾配が最大となるプロットの部分から採取されるべきである。
5. 環状のテストでは、ヤング率が各サイクルに対して決定される必要がある。これは、自動または手動で実行することができる。
6. 時間に対する各サイクルのサイクリック試験のため、プロットはヤング率。これは、セットアップサンプルが湿潤または乾燥される速さの指標となる時間とともにどのように測定された弾性の変化を示している。
7. インプラントのサンプルについては、インプラントの各サンプルと時間が環状試験の単一サイクルに対応する。各インプラントサンプルについて上述した手順を使用してヤング率を測定する。
8. ヤング率に対するインプラント時間をプロットします。この時点では、比較はベンチトップ調査等を行うことができる

Results

私たちたPVAc-NCを含むほぼ全てのポリマー材料の機械的特性は、環境条件への暴露に依存している。最も顕著なのは、これらは、熱や湿気への露出を含む。材料は、水分の吸収により可塑化、または熱転移を起こしている場合には、ヤング率の低下を表示する。湿気とex vivoでの試料の機械的特性解析のための温度制御された環境を準備するには、機械的なテスト中microtensileテスター、並びにに試料を装填しながら、試料の水分含有量の最小の変化があることを確認することが重要である。これは、試料を空気ブラシで発生する水分の影響を受けない、またそれはすぐに外部環境に乾燥しないように制御の設定サンプル実験を用いて評価する。 図5は、乾燥初期の機械的挙動を示す例示的なプロットを示すCYCL時のサンプル適切なエアーブラシ水分設​​定用のiCal引張試験。エアーブラシが入った状態でヤング率の変化は最小である。外部環境の剛性の減少または増加に寄与してはならないので、これは重要である。エアーブラシからの流れがあまりにも高く設定されると、試料のヤング率は有意に約60秒以内に減少する。

Discussion

生物学的システムと対話するための移植可能な生物医学微小電気機械システム（バイオMEMS）の進歩は非常に合わせた特性を持つ新素材の開発を動機づけている。これらの材料のいくつかは、生理的環境において見出さ刺激に応答して材料特性の変化を示すように設計されている。材料の一つ、最近開発されたクラスには、水素結合形成の液体（ 例えば 、水）と大きさ^10,11,18の3桁によってヤング率、材料剛性の測定を、減らすために高温の存在に応答します。これらのポリマーナノコンポジット材料は、ナノフィラー相としてセルロースナノファイバーと軟質ポリマーマトリックス（ すなわち、ポリ（ビニルアセテート））を有する。セルロースナノファイバーの間の相互作用は、全体として、材料の機械的特性を決定し、乾燥時に "オン"になったときに、ウェット "オフ"になっている。また、水がポリマーを可塑ナnocompositeことにより、ヤング率が低減するさらなる結果として、（37°C）体温より下にガラス転移温度を低下させる。材料のこのクラスの1つの用途は、個々のニューロン^13,1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
シリコンウェーハ	大学ウェーハ		グレード
押出アクリルシート	専門プラスチック	SACR 062EF	厚さ0.062 "
カミソリの刃	McMaster-Carr	3962A3
セット	McMaster-Carr	8384A47	#5チップ
瞬間接着剤ジェル	ロックタイト	130380
空気ブラシ	スナップオン インダストリアル	BF175TA
エアコンプレッサー	Paasche	B002YKN8YO	D500
熱電対	オメガ	HH12A
ホット プレート	Cimarec	SP131325Q
CO2 ダイレクトライト レーザー	VersaLaser	3.5
デシケーター	フィッシャー サイエンティフィック	08-595
ランプ			オーダーメイド
マイクロテンシャルテスター			オーダーメイド