内皮グリコカリックスの機械的特性は、AFMカンチレバー上にミクロンサイズの球を使用して、インデントによって測定した。内皮細胞は糖衣発現を誘導する生理的な流動条件下でカスタム室で培養した。データはグリコカリックス厚さと弾性率を決定するために、薄膜モデルを用いて分析した。
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この記事について
サマリー
要約
白血球と白血球キャプチャ時の血管壁の相互作用についての我々の理解は、内皮表面層の機械的特性の不完全な理解によってのみ制限されます。それは、白血球上の接着分子が表面トポグラフィー3に対して不均一に分布していることが知られており、その地形が他の表面9に接着結合の形成を制限し、その生理的な接触力（≈5.0 -微絨毛あたり10.0 PNが）と微絨毛を圧縮することができます対向面3,7に分子のアクセシビリティを増やし、彼らの休憩の長さの3分の少し。我々は2層構造と、比較的剛性の細胞体、プラス糖衣、腔面6に柔らかい保護糖コーティングなどの内皮を検討してください。それはグリコカリックスは内皮表面4への白血球の付着を低減するための障壁として作用し得ることが示されている。本稿では、内皮の機械剛性が結合形成に影響を与える可能性のある方法を理解する内皮表面の変形に対処するために開始されます。静置培養で増殖した内皮細胞は、堅牢な糖衣を発現しないが、生理的な流動条件下で培養した細胞は 、in vivo で観察された2近似糖衣し始める。内皮細胞体の弾性率は、約5〜20kPaで5であることが、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて測定されています。グリコカリックスの厚さや構造は電子顕微鏡8を使用して研究されており、グリコカリックスの弾性率は、間接的な方法を用いて近似されていますが、私たちの知る限りでは、生きた細胞で糖衣弾性率の直接測定は発表報告されていない。そこで本研究では、MAに彼らの糖衣式を最大化するための条件で培養した細胞上で小説AFMプローブで作られたインデントの実験を提示内皮グリコカリックスの弾性率と厚さのke直接測定。
プロトコル
1。メソッド
1.1セル·フローチャンバー
細胞は1.0 Paの（10ダイン/ cm 2）のせん断下で成長してから、アサイラムMFP3D AFM（サンタバーバラ、カリフォルニア州）に直接転送することができるように、図1に示すフローチャンバーは、構築した。
- 15分間、次いで蒸留水でそれらを洗濯：フローチャンバーは最初ピラニア溶液（H 2 O 2 3：01、H 2 SO 4）内にスライドガラスを洗浄することにより、実験のために用意された。彼らはその後に焼成した乾燥した真空蒸着チャンバー内のシランアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）で被覆した。
- シリコーンガスケットはシルエットSDの切削工具を用いて切断した。これは、私たちは細かく細胞増殖時の流速とせん断応力を制御するためのフローチャンバーの寸法を制御することができました。典型的には、チャネル、0.4 mmのシリコンのシートから長い19ミリメートルで幅の広い6.4ミリメートルを切断した。属に必要な流量TE 1.0 PA（10ダイン/ cm 2）のせん断応力は、次式を有する矩形チャネル内の層流を仮定して計算されます：
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結果
典型的な実験では、20力片対距離曲線は近くではなく、核（〜2μm以内）に、通常は核周辺領域で、セルの指定された領域から得られた。曲線は測定期間にわたって任意のサンプルのドリフトを考慮するために整列した後、図4に示すように、カンチレバーのノイズを除去するために平均化した。曲線を分析し、薄いポリマーフィルム1の弾性率と厚さを決定するために開発された2層モデルに適合させた。 25セルの曲線の発作から、我々は、内腔の層の弾性率は0.7±0.5 kPaであり、 図5に示すように、厚さは、380±50nmであることを決定した。細胞体の弾性率は、16±6 kPaです。これらの値は、細胞体と糖衣5,8の厚さの係数の前の測定値とよく一致している。
図1。私.......
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ディスカッション
我々は、2層モデルと内皮壁と血液中を循環する白血球の相互作用をモデル化するためのヘルツ理論から算出した値を使用していました。我々は、10 PN荷重下50nmの直径を持つ白血球上の微絨毛は糖衣に約150nmをインデントすることを全体の厚さのほんの一部を計算した。これは、この実験で測定された特性を持つグリコカリックスは、細胞間相互作用に大きな障害となり、細胞は白血球の接着時に接着カスケードの間に克服しなければならない大きな立体障害であることを示しています。
モデルでは、等方性弾性構造として糖衣我々はおおよそ、ここで使用される。我々は、これはそうではありませんを示すために、任意の機械的測定に気づいていながら、何のグリコカリックスの分子構造についてはほとんど知られていないと、これはおそらく過剰な単純化であることを示唆している。実際には、グリコカリックスは複雑かつ多様である細胞の表面上の構造。それは指向分子構造から構成され、明確に定義された外側の境界を欠いている、と思わ細胞表面に近いより密になります。ここで使用される2つの層の弾性モデルは、細胞を循環させることによって、観測されたグリコカリッ.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
著者は、このプロジェクトと彼らの支援のためのエレナLomakina、リチャードBauserman、マーガレットヤングマン、シェイVaknin、ジェシカ·スナイダー、クリスStriemer、Nakulナタラジ、鴻李鄭、テジャスKhire、エリックラムに感謝したいと思います。このプロジェクトは、NIH＃PO1 HL 018208によって賄われていた。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/材料の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| マッコイミディアム | ギブコ | 16600-082 | |
| ウシ胎仔血清 | Hyclone社 | SH30070 | |
| 内皮細胞増殖培地 | VEC Technologies社 | MCDB-131 | |
| プールしたヒト臍帯静脈内皮細胞 | VEC Technologies社 | PHUVEC/T-25 | |
| 硫酸 | JTベーカー | 9681から02 | |
| 過酸化水素 | VWR | BDH3742-1 | |
| （3 - アミノプロピル）トリエトキシシラン | アルドリッチ | 440140-100ML | |
| イソプロピルアルコール | VWR | BDH8999-4 | |
| トリプシン | Cellgro | 25から054-C1 | |
| ハンクス緩衝塩溶液 | ギブコ | 14175-095 | |
| スルホ-NHS-LC-ビオチン | サーモサイエンティフィック | 21335 | |
| Streptavadinビーズ | ダイナ | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | アサイラムリサーチ | ||
| チップレスカンチレバー | ナノワールド | ARROW-TL1-50 | |
| シルエットのSD | Quickutz | シルエット-SD | |
| シリコーンゴム | ストックウェルElastomerics | SE50-RS | |
| 30mlのシリンジ | ベントンディッキンソン | 309650 | |
| 18ゲージの針 | ベントンディッキンソン | 305196 | |
| 拡張セット | ホスピーラ | 4429から48 | |
| 4方弁 | Teleflexは | W21372 | |
| 男性/女性ポートキャップ | スミスの医療 | MX491B | |
| 蠕動ポンプ | ワトソン·マーロー | 401U / D | |
| 蠕動チューブ | ワトソン·マーロー | 903.0016.016 | |
| 滅菌フィルター | ポールライフサイエンス | 4652 |
参考文献
- Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios. Nanotechnology. , (2009).
- Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H.
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再版と許可
