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方法論記事

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する

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DOI:

10.3791/50201

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2013年2月19日

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

この記事について

サマリー

私たちは、Xenopus卵子における酵素の不均一発現と、原子吸光分光光度法による個々の細胞へのRb+またはLi+の取り込みを測定することにより、K+逆輸送P型ATPaseの活性を定量化する方法を説明しています。この方法は、放射性同位元素フラックス実験に代わる高感度で安全な方法であり、複雑な速度論的研究を容易にします。

要約

電気膜トランスポーターNa+,K+-ATPaseによる陽イオン輸送は電気生理学で測定できますが、電気的に中立的に動作する胃H+,K+-ATPaseは調べるのが困難です。多くの輸送アッセイは、十分なS/N比を達成するために放射性同位元素を利用していますが、必要なセキュリティ対策により、ヒトへの曝露やアッセイ設計に関して厳しい制限が課せられます。さらに、細胞膜を横切るイオン輸送は、細胞培養やプロテオリポソーム調製物では直接制御されない膜電位に大きく影響されます。ここでは、原子吸光分光光度法(AAS)の微量元素に対する優れた感度を利用して、Na+、K+-、または胃H+、K+-ATPaseによる単一細胞のRb+またはLi+の輸送を測定します。Xenopus卵子を発現系として用い、オートサンプラーから負荷される横加熱グラファイトアトマイザー(THGA)炉を備えたAAS装置で単一卵子ホモジネートのサンプルを測定することにより、細胞内に輸送されるRb+(Li+)の量を決定します。制御卵子への非特異的なRb+取り込みやATPase特異的阻害剤の適用中のバックグラウンドは非常に小さいため、多数の実験条件を同時に含む複雑な速度論的アッセイスキームを実施したり、部位特異的に変異したトランスポーターの輸送容量と速度速度を高精度で比較することができます。さらに、陽イオンの取り込みは単一細胞で決定されるため、フラックス実験を2電極電圧クランプ(TEVC)と組み合わせて実行し、膜電位と電流の正確な制御を実現できます。これにより、例えば、Na+,K+-ATPaseの3Na+/2K+輸送化学量論を定量的に決定することが可能になり、電子中性的に動作する胃H+,K+-ATPaseによるカチオン輸送の電圧依存性を初めて調べることが可能になりました。原則として、このアッセイはK+輸送膜タンパク質に限定されませんが、重金属トランスポーターや遷移金属トランスポーターの活性、またはエンドサイトーシスプロセスによる化学元素の取り込みに対処するためにも同様にうまく機能する可能性があります。

概要

私たちは、アイソトープ研究所へのアクセス、安全要件、または高価な放射性同位元素の使用に関する制限を回避するために、イオントランスロケーション膜タンパク質の特定の輸送活性を調査するための放射性トレーサー実験に代わる、高感度で安全で安価な代替手段を開発したいと考えていました。これは、リチウムの場合のように、非常に短い崩壊時間のために利用できない可能性さえあります。私たちは、酵素が電流を発生せず、したがってその活性を電気生理学的方法で対処できないため、電気的に中立的に動作する胃H+、K +-ATPaseの活性を決定することに特に興味を持っていました。Na+、K+-およびH+,K+-ATPaseはK+(およびLi+)と同じくらい効率的にRb+を輸送するため、ルビジウムまたはリチウムに対するAAS技術の高感度は、輸送活性の高感度検出を容易にするはずです。原子吸光分光光度計は一般的な分析装置であり、化学実験室に広く配布されており、関心のある多数の科学者がアクセスできるはずです。さらに、直径約1.0〜1.5mmの大型単一細胞を利用するXenopus卵子発現システムにより、1つのバッチ内のタンパク質発現レベルに関する細胞間変動が非常に低いことを実現したいと考えました。簡単な計算はAASアッセイの実現可能性を示しています:THGA-AAS技術によるルビジウムの検出限界(特性質量)は10 pgまたは1.2.10-13 mol(Rb:85.47 g/mol)、リチウム5.5 pgまたは7.9.10-13 mol(Li:6.94 g / mol)です。Xenopus卵子にNa+,K+-ATPaseが不均一に発現すると、100 nAのポンプ電流(これは毎秒約6.2.1011の基本電荷、または1.03・10-12 mol s-1に相当)を達成でき、1分以内に6・10-6Cの電荷が輸送されます。1つの正味電荷の輸送は2つのRb+イオンの取り込みに対応するため(3Na+/2K+化学量論による)、100nAの電流が1分間の場合、1.2・10-10molのRb+の取り込みに相当します。したがって、1,000倍希釈(1 mLの水に約1 μlの容量の卵子を均質化)しても、一般的なTHGA-AASサンプル(20 μl)には2.4・10-12 mol Rb+(または204 pg)が含まれており、これは検出閾値をはるかに上回っています。したがって、輸送活性や原形質膜の発現が100倍以上低いトランスポーターであっても、実験のフラックス時間を適切に調整することで、この手法でアッセイすることができます。

排気速度は温度に敏感に依存するため(Na+,K+-ATPaseの典型的な活性化エネルギーは90 kJ/molから130 kJ/mol1-3の範囲であり、20 °Cから22 °Cに変化すると回転率が約30%増加する)、精密な温度制御(空調)の下で、十分に平衡化された緩衝液を使用してフラックス測定を行うことが必須です。さらに、卵子は、イオントランスポーターの発現のための均質なサイズに関して慎重に選択する必要があります。これらの予防措置により、実験条件ごとに約10個の細胞で10%未満の実験標準誤差を日常的に達成することが可能です。この手法を用いて、例えば、陽イオン輸送4-6の見かけ上のRb+親和性、細胞外および細胞内pH7の影響、輸送中の陽イオン協調に関与する残基の突然変異の影響4,8を決定することができた。この技術の利点は、イオンフラックスを卵子の2電極電圧クランプと組み合わせて決定することもでき、これにより、一方では輸送中の膜電位の正確な制御を保証し、他方ではイオンフラックスと膜電流を相関させることができます。したがって、Na+,K+-ATPaseの3Na+/2K+化学量論を検証し(下記の例示的結果を参照)、胃H+/K+-ATPase7のカチオン輸送の電位依存性を決定することが可能であった。

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プロトコル

1. cDNA構築物およびXenopus卵母細胞におけるタンパク質発現

目的の膜タンパク質のcDNAを、pTLN9やpcDNA3.1X10など、Xenopus laevis（アフリカツメガエル）卵母細胞での発現に適したベクターにクローニングする必要があります。これらの最適化されたベクターは、マルチクローニングサイト（MCS）の両側にXenopus laevisのβ-グロビン遺伝子の5'および3'非翻訳領域（UTR）を備え、5' UTRの前にはRNAポリメラーゼプロモーター配列（pTLN：SP6、pcDNA3.1X：T7）が配置されています。また、細胞内でのcRNAの安定性を確保するためにMCSの3'方向にポリA配列を有し、さらにその下流には、in vitro cRNA転写のテンプレートとして用いるためにプラスミドを直線化するための単一切断制限エンドヌクレアーゼ部位の配列が含まれています。

過剰発現させたヒトNa+/K+-ATPase（α2サブユニット+β1-サブユニット）の活性を、卵母細胞の内在性Na+/K+-ATPaseと区別するため、Q116RおよびN127Dの変異を導入し、IC50がミリモル範囲にあるウアバイン耐性タンパク質を得た11。H+/K+-ATPaseの場合、Rb+フラックスがボルテージクランプ蛍光法（VCF）実験の速度論的データと相関したため、H+/K+-ATPase α-サブユニット変異体S806Cを用いてフラックス測定を行った。VCF法(https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12は、戦略的に導入したシステイン残基に蛍光標識を部位特異的に結合させ、酵素の構造変化を報告させる手法に基づいている。

2. DNAテンプレートの線状化および精製

  1. DNAテンプレートを直線化するため、3 μgのプラスミドDNAを、制限酵素に適した10x濃縮バッファー5 μlおよび制限酵素10 Uと共に、反応容量50 μlで37 °Cで1時間消化する。
  2. High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science)を用いて、直線化DNAを精製する。まず、消化後のバイアルに350 μlのバインディングバッファー（グアニジンイソチオシアネート含有）を加える。グアニジンイソチオシアネートは効率的なタンパク質変性剤であり、特に分子生物学研究室で頻繁に混入するRNAseを破壊するため、この精製ステップ後の直線化DNAテンプレートは「RNAグレード」となる。
  3. スピンカラムを回収チューブにセットし、ステップ2のDNA溶液をカラムにロードし、13,000 x gで30秒間遠心分離して、ろ液を捨てる。
  4. 500 μlの洗浄バッファーをカラムに加える。13,000 x gで1分間遠心分離し、ろ液を捨てる。
  5. 200 μlの洗浄バッファーをカラムに加える。13,000 x gで1分間遠心分離し、カラムを完全に乾燥させる。
  6. スピンカラムを新しい1.5 ml Eppendorfチューブに移し、50 μlのヌクレアーゼフリー水 (Ambion Product # AM9937) をカラムに加える。最大速度で1分間遠心分離して溶出させる。
  7. 溶出後、DNA含有溶液を約15 μlまで濃縮する。このステップにより、溶液中に3 μlあたり0.5 μgの直線化DNAが含まれることが保証され、これは次に行うin vitro cRNA転写反応の推奨濃度である。

3. In Vitro cRNA合成

  1. プラスミド上のプロモーター配列（SP6、T7）に応じて、適切なmMessage mMachine Kit（Ambion Product #1340, #1344）を選択する。あらかじめ分注しておいた5 μlのNTP-cap mixに、前ステップで得られた線状DNA 3 μlと転写バッファー1 μlを加え、全反応容量を10 μlにする。ヌクレオシド三リン酸の分解を防ぐため、頻繁な凍結融解サイクルを避けるよう、NTP-cap mixをあらかじめ分注しておく必要がある。最後に、適切なRNAポリメラーゼを1 μl加え、軽く混ぜてから反応液をスピンダウンさせる。
  2. 反応液を37 °Cで1〜2時間インキュベートする。cRNAの収量や品質が低下する可能性があるため、インキュベーション時間は2時間を超えないようにする。
  3. キットに含まれる氷冷した3 M LiCl溶液15 μlと、冷えたヌクレアーゼフリー水15 μlを加え、軽く混ぜる（ボルテックスはしない）。サンプルを11,000 x gで10秒間短時間スピンダウンし、cRNAを沈殿させるために-20 °Cで少なくとも30分間保存する。
  4. 遠心分離機を4 °Cに予冷し、沈殿後、13,000 x gで少なくとも15分間遠心分離を行う。
  5. チューブ底部の淡褐色のペレットから上清を慎重に完全に除去し、-20 °Cに冷却した70% RNAグレードエタノール150 μlを加える。4 °C、13,000 x gで5分間遠心分離する。
  6. 上清を完全に除去し、残ったcRNAペレットを遠心濃縮機（例：Eppendorf Concentrator model 5301）を用いて室温で短時間（1〜2分）乾燥させる。
  7. ペレットを12 μlの冷えたヌクレアーゼフリー水に溶解させる。注意：以降のすべてのステップは、cRNAサンプルを氷上で保持した状態で実施すること。
  8. 分光光度計（例：Eppendorf BioPhotometer）を用いてcRNA濃度を測定する。
  9. アガロースゲル電気泳動によりcRNAの完全性を確認する。注意：部分的に分解したRNAであってもUV吸収値は検出されるため、このクロスチェックは不可欠である。cRNAの電気泳動には、TAEバッファーを新しく満たし、十分に洗浄した電気泳動槽と、調製直後の1%アガロースゲルを使用する。電気泳動槽やバッファーにRNase汚染が疑われる場合は、洗浄のために0.1 M HClを槽に満たして1時間放置し、TAEバッファーはヌクレアーゼフリー水を用いて調製する。
  10. cRNAを使用時まで-20 °Cで保存する。cRNAは-20 °Cで少なくとも1年間保存可能である。

4. 部分的な卵巣切除術によるXenopus laevis雌からの卵巣組織の採取

本プロトコルは、管轄州当局（ドイツ、ベルリン州政府、ベルリン保健社会局）によって承認されています。

  1. 嘔吐を防ぐため、手術前少なくとも 12 hr はカエルに餌を与えないでください。
  2. 局所麻酔薬のトリカイン（MS-222）2 g を、5 mM HEPES 緩衝液で pH 7.0 に調整した 1 L の水に溶解して溶液を調製します。注意：MS-222 を扱う際は常にニトリル手袋を着用し、溶液の調製は化学薬品用安全キャビネット内で行ってください。
  3. カエルをトリカイン溶液に浸し（最大 10 min）、動物に正位反射が見られなくなるまで待ちます。反応がないことを確認するために、手でカエルを仰向けにし、防御動作があるかを確認してください。
  4. カエルをトリカイン溶液から手で取り出し、冷たい水道水ですすいで麻酔薬を取り除きます。
  5. 氷に直接触れて皮膚を傷つけないよう、濡れたペーパータオルを敷いた氷の上に、カエルを背中側にして置きます。乾燥を防ぐため、手術中は常に動物の皮膚を濡らしておいてください。氷上に配置することで麻酔時間が延長されます。
  6. 鋭い鋏を用いて、カエルの中線から左右どちらか一方で腹部に小さな切開（長さ 8-10 mm）を加えます。注意：側線に傷をつけないよう注意してください。下層の卵巣組織を十分に回復させるため、次回以降の手術は側を交互に変えて行ってください。通常、3 層の組織（外皮、白い結合組織の薄い層である筋膜、および筋肉層）を貫通させる必要があります。
  7. 腹部を開いた後、卵巣葉の一部を鈍端鉗子で掴み、ゆっくりと体外に引き出します。目安として、切開によって卵巣から約 3-5 cm の卵巣組織を採取します。小血管を損傷し出血した場合は、滅菌プラスチック棒で圧迫するか、止血するまで氷で冷却してください。
  8. 4.0 Ethicon Vicryl 縫合糸（Johnson & Johnson #V633H）を用い、結節縫合で切開部を外科的に閉鎖します。縫合には手術器具を使用し、切開に沿って 2〜3 回個別に結紮します。注意：各結紮において、3 つの組織層を一度に縫い合わせることが重要です。
  9. 手術後、カエルをわずかに傾斜させた水槽（30 L）に入れます。水量は底面を覆う程度にし、呼吸ができるよう動物の鼻孔が水面より上にあるようにしてください。覚醒期間中（約 1-2 hr）は、敏感な皮膚の乾燥を防ぐため、濡れたペーパータオルで動物を覆ってください。
  10. 動物が再び活動的になったら、水槽に水を満たし、回復と傷の治癒を観察するため、他の個体から離して 3-4 日間飼育してください。
  11. 動物および卵巣組織を完全に回復させるため、手術後、少なくとも 3 か月は次の手術まで間隔を空けてください。目安として、1 匹のカエルに対して行える手術は最大 6-8 回までとします。

5. 個々の卵母細胞の酵素的単離

  1. 卵巣組織をハサミで小さく切り分け、組織を〜に移します。 （～を含まない）卵母細胞用リンガー液 カルシウム2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2)2、5 mM HEPES、pH 7.4）に、コラゲナーゼ（20 mg/ml、type 1A、〜社製）を含む *Clostridium hystolyticum*, Sigma #C9891) およびトリプシンインヒビター（10 mg/ml, 鶏卵白由来 Type III-O, Sigma #T2011）。
  2. 消化液を2.5時間、緩やかに振盪し、 18 °Cその後、ほとんどの卵細胞が卵胞組織から分離されるまで、15分おきに消化の進行状況を確認します。
  3. 50 mlのFalconチューブ内で、卵母細胞を～で数回洗浄します。 Ca不含卵母細胞リンガー液2+ 溶液から組織の破片が十分に除去されるまで。
  4. 卵母細胞を～に保存する Ca含有卵母細胞リンゲル液2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2)2, 2 mM CaCl22、5 mM HEPES、pH 7.4)、ゲンタマイシンを含む（50 μg/ml) で 18 °C.

6. cRNA注入

  1. Naの発現について+,K+- または H+,K+-ATPaseについて、電気駆動式Nanoject II注入ポンプ（Drummond Scientific Inc.）および3.5インチヘマトクリット管（Drummond #3 000-203-G/X）を用い、αサブユニット25 ngおよびβサブユニット5 ngを含む50 nlのcRNA溶液を卵細胞に注入する。注意：mRNAの量は標的タンパク質によって異なり、最大発現を得るためにウェスタンブロッティングによる調整が必要な場合がある。
  2. 各フラックス条件下で（例： 特定のRbにおいて+ 濃度）、18〜22個の卵母細胞を注入します。これらのうち50%を「+flux」条件下で解析します（例： あるRb+ 濃度）、および「-flux」条件下で50%（例： 選択したRbを用いて+ 濃度、および飽和濃度の特定の酵素阻害剤（Na+K+-ATPaseに対する10 mMのouabainなど）+,K+-ATPaseまたは 10 μM Hに対するpH 5.5でのSCH28080+,K+-ATPase).
  3. 注入後、Ca含有Oocyte Ringer Solutionを半分まで満たした96ウェルプレートに、卵母細胞を個別に移します。2+ および 50 μg/ml ゲンタマイシン（濃度：） 18 °C.
  4. 過剰な蒸発を防ぐため、96ウェルプレートをParafilmで密閉する。
  5. 目的のタンパク質に応じて、卵母細胞を2～7日間、以下の条件でインキュベートします。 18 °C卵子を3日を超えて保存する必要がある場合は、3日ごとにマイクロウェル内のインキュベーションバッファーを交換することが推奨されます。
  6. 各フラックスデータのセットについて（例： [Rb+ ]+（滴定実験などの場合）、約10個の非注入（または50 nlのヌクレアーゼフリー水を注入した）コントロール卵母細胞を、「+flux」および「-flux」の条件下で測定してください。したがって、フラックス分析の前に、cRNAを注入した卵母細胞と同様の方法で十分な数のコントロール細胞をインキュベートしてください。

異種 ATPase 発現卵母細胞の前処理

Na+チャージ手順

Na+/K+-ATPaseの機能測定においては、以下のように細胞内Na+濃度を上昇させることが重要です13：

  1. 卵細胞をNa+ Loading Buffer（110 mM NaCl, 2.5 mM Na-citrate, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4）に移し、氷上で45分間静置する。
  2. その後の回復のため、卵細胞をPost Loading Buffer "PLB"（100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2 および 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4）中で、氷上で少なくとも30分間インキュベートする。
  3. 使用時まで卵細胞をPLBに入れ、氷上で保存する。

7. 内在性Na+,K+-ATPaseの事前ブロッキング

注意：Xenopus卵細胞は内因性のNa+,K+-ATPaseを発現しているため、Rb+フラックス実験の前に、以下のようにこの内因性ポンプを阻害させることが重要です。

  1. 次に、100 μM の ouabain を含む Post Loading Buffer 中で、卵母細胞を室温で 15 分間インキュベートし、内因性の Na+,K+-ATPase をブロックします。

8. 電気生理学

  1. 2段階マイクロピペットプラー（Model PC-10, Narishige）を用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（GB150F-8P, Science Products GmbH）を延伸し、マイクロ電極を作製する。
  2. ガラス電極の後方から3 M KClを充填する。H+,K+-ATPaseを用いたTEVC実験では、より安定した電流記録が得られるため、代わりに3M NaClを使用することを推奨する。2電極電位固定（TEVC）セットアップのマイクロ電極ホルダーにあるAg/AgCl線の上にピペットを固定する。
  3. ガラスマイクロ電極と、Ag/AgCl参照電極をバス溶液に接続する2本のアガーブリッジ（一般的に使用されるKCl/アガーではなく、NaCl/アガーで作製すること）を、測定バッファー（例：Na+,K+-ATPase用には10 μM ouabainを含むPLB）であらかじめ満たした記録チャンバー（Warner Instr., model RC-10）内に挿入する。
  4. 電位固定アンプ（Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany）を「OFF」モードに切り替える。
  5. 各ガラス電極の抵抗を個別に確認する（両方とも0.5-2 MΩの範囲内である必要がある）。
  6. 適切なTEVCアンプのディスプレイで、電圧電極および電流電極のオフセット電位を確認する。ゼロから乖離している場合は、アンプの対応するオフセットレギュレーターでオフセットを調整する。
  7. チャンバーの中央に卵母細胞を配置し、電流電極と電圧電極で膜を緩やかに貫通させる。
  8. アンプの電位読み取り値を確認する。電圧電極の電位読み取り値が、細胞の静止膜電位の値となる。
  9. アンプをVC（電位固定）モードに切り替える。
  10. pCLAMPソフトウェア（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を用いて、細胞をあらかじめ定義した膜電位に固定する。これは、以前に測定した静止膜電位の値（膜電流ゼロ条件下での記録用）、または任意のテスト電位値のいずれかとする。リーク電流（K+/Rb+/Li+不在時）の振幅と安定性に注意し、一般的なガイドラインとして、-30 mVで-200 nAを超えないようにする。
  11. Rb+含有溶液で卵母細胞を一定時間灌流し（例：Na+,K+-ATPaseの場合は3分。最大電流を得るには、非固定条件下でのフラックス測定から得られた飽和濃度を使用する）、pCLAMPソフトウェアの連続記録モードでポンプ電流を記録する。その後、Rb+不含溶液で30秒間細胞を灌流し、Rb+の取り込みが完全に停止していることを確認する。
    1. 2電極電位固定実験を終了し、卵母細胞を記録チャンバーから取り出し、「Rb+ uptake experiments」の項の洗浄ステップ4に進み、原子吸光光度法でRb+の取り込みを分析する。
  12. pCLAMPパッケージのClampfitプログラムを用いて、オフセット電流の減算を行い、ポンプ電流の時間積分値を評価する。

9. Rb+取り込み測定

  1. 200 μlピペットの黄色いピペットチップをカットし、直径約2 mmになるまで加熱して溶かします。このようなチップを使用することで、卵細胞をインキュベーション皿や洗浄皿の間で移動させる際の溶液の転移を最小限に抑えることができます。ポケットライターの炎でチップを短時間加熱して溶かしてください。この研磨工程により、卵細胞へのダメージを防ぎます。
  2. 測定する卵細胞1個につき、1 mlのMillipore waterを満たした1.5 ml Eppendorfチューブを用意します。Rb+フリーの洗浄緩衝液（例：PLB）を入れたペトリ皿3枚と、Millipore waterを入れたペトリ皿1枚を準備します。
  3. 前インキュベーション済みの卵細胞5個を、Rb+フラックス緩衝液（Rb+濃度 0から15 mM）を満たした3.5 cmペトリ皿に同時に移し、温度制御下（例：エアコン完備の室内で21 °C、またはヒーティングプレート上）で3分間（Na+,K+-ATPaseの場合）または15分間（H+,K+-ATPaseの場合）インキュベートします。
  4. 卵細胞を、Rb+フリーの洗浄緩衝液を入れた1枚目の皿に同時に移します（Na+,K+-ATPaseの場合はPLBを使用可能です）。インキュベーション時間の偏差を5 sec未満に抑えることが不可欠です。穏やかに洗浄します。
  5. 卵細胞を、Rb+フリーの洗浄緩衝液を入れた2枚目および3枚目の皿に順次移し、穏やかに洗浄します。
  6. 卵細胞をMillipore waterを入れた皿に移し、穏やかに洗浄します。
  7. 個々の卵細胞を、1 mlのMillipore waterを満たして用意しておいたEppendorfチューブに1個ずつ移します。
  8. 溶液が均一に濁るまで、200 μlピペットチップでピペッティング（吸い上げと吐き出し）を行い、卵細胞を均質化します。

10. THGAファーネスシステムを用いたAAnalyst 800の準備

  1. 必要な不活性ガス（アルゴン）のバルブを開き、適切な中空陰極ランプ（Li用の単一元素HCL）を挿入する+ またはRb+（Photron社、オーストラリア、メルボルン）を任意のソケット位置に配置する。
  2. WinLab32制御ソフトウェア（Perkin Elmer）を起動し、適切な中空陰極ランプを点灯させます。Perkin Elmer Luminaの中空陰極ランプは自動的に認識され、選択リストに表示されます。互換性のない中空陰極ランプについては、手動で入力する必要があります。
  3. ランプを安定させるため、約10〜15分間のウォームアップ時間を設けてください。
  4. THGAチューブ（横加熱グラファイトアトマイザーチューブ、Perkin Elmer、#B3000641）が良好な状態であるか、目視で確認してください。THGA加熱炉は300回射撃（メーカーによる平均寿命）ごとに交換する必要がありますが、より多くのサンプル数に耐えられる場合もあります。
  5. WinLab32で「THGA furnace」テクニックを選択します。
  6. Rbを用いて、少なくとも5つの校正試料を調製する。+/Li+ 10から（の間）の濃度 50 μg/L (例： （1 M RbClまたはLiCl溶液を適切に希釈して調製し）、および超純水（Millipore water）のみを用いたブランクプローブを用意する。注意：塩は、入手可能な最高純度（「puriss.」またはAAS用として市販されている校正標準物質）のものを使用すること。
  7. 適切な初期化ファイル（校正パラメータへの参照を提供し、装置設定をロードする「メソッド」ファイルと呼ばれるもの）を選択し、 例： AAS検出波長、Rbの波長+ および Li+ （それぞれ780 nmおよび670.8 nmである）後、検量線用サンプルの位置と濃度を入力します。この際、適切なオートサンプラー（AAnalyst 800装置で88または148のサンプリングポジションを持つサンプルラック）を選択してください。
  8. 検量線を測定する。
  9. 次に、各卵母細胞ホモジネートを個別の1.2 mlポリプロピレンサンプルカップ（Perkin Elmer、#B0510397）に移し、これらの試験管をオートサンプラー用トレイに配置します。
  10. オートサンプラーのポジションにあるプローブを識別するためのサンプル情報ファイルを作成し、次にサンプル量を調整します。 20 μl、そして装置を起動します。
  11. ランが完了した後（または、大量のサンプルを連続して測定する場合、1時間ごとの目視点検時に）、Rbの測定量において以下の点を確認してください。+ 検量線の最大値を超える場合は、該当するサンプルを適切に希釈して再測定してください。

11. 大量サンプル（50個以上）を測定する際の留意点

  • 装置を夜間に動作させる場合は、試験管内のホモジネートの蒸発を防ぐため、オートサンプラーのリザーバーにMillipore水を満たすことが推奨されます。
  • オートサンプラーの注入キャピラリーの詰まりを防ぐため、20サンプルごとに2% HNO3を入れた試験管を配置することが推奨されます。

ルビジウムのための推奨されるTHGA-AAS温度プロトコル

ステップ温度（°C)ランプ時間（秒）保持時間 (秒)アルゴンガス流量 (ml/min)
乾燥 1110120250
乾燥 2130530250
熱分解300-6001020250
アトマイゼーション（微粒化）1700-1800050
クリーンアウト240012250

リチウムに対する推奨THGA-AAS温度プロトコル

ステップ温度（°C)昇温時間 (秒)保持時間 (秒)アルゴンガス流量 (ml/min)
乾燥 1110130250
乾燥 21301530250
熱分解9001020250
霧化2200050
クリーンアウト245013250

データ解析

  1. 各測定条件について、平均Rb+取り込み量を算出する。AAS分光光度計で得られる値はμg/Lであるため、これをpmol/oocyte/minに変換する必要がある。
  2. 速度論的解析（見かけのKM値）を行う場合は、同じバッチの未注入コントロール卵細胞を用いて、当該RbCl濃度で測定したバックグラウンドのRb+取り込み量を差し引く。
  3. Originソフトウェアを用いてプロットし、データにヒル方程式 ヒル方程式の公式；生化学的キネティクス図；結合親和性分析；酵素基質。 またはミカエリス・メンテン式 酵素速度論方程式；公式 A = Amax[S]/(K0.5 + [S])；生化学的概念。 を適用してフィッティングを行う。これらの式において、[S]は基質濃度、nHはヒル係数、K0.5は最大活性の半分に必要な基質濃度を示す。

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結果

Xenopus卵母細胞発現系におけるAASによるK+（またはRb+）対向輸送P型ATPaseによるRb+取り込みの定量化により、酵素動力学的パラメータを信頼性高く決定することが可能です。

Na+/K+-ATPaseの輸送化学量論の決定

電原性Na+/K+-ATPaseにおいて、Rb+フラックスは、正味の電荷輸送（ポンプ電流の時間積分）とRb+輸送との相関を目的とした2電極電圧クランプ実験によって決定できます。Figure 1Aは、Na+,K+-ATPaseを発現させた卵母細胞に1 mM Rb+を含む溶液を灌流することで誘発されたポンプ電流（定常電流振幅は約40 nA）の記録を示しています。電流信号の積分（電流トレース下の灰...

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ディスカッション

Na+、K+-またはH+、K+-ATPアーゼを発現する個々のアフリカツメガエル卵母細胞に取り込まれるRb+(またはLi+)の量を測定する説明された方法は、陽イオン逆輸送P型ATPアーゼ1,4,5,7,8の輸送の速度論的または熱力学的パラメーターを決定するための多用途で柔軟かつ正確な技術であることが証明されています.これは、放射性トレーサーフラックスアッセイの安全で信頼性の高い代替手段であり、かなり短時間で広範囲の実験問題に対処することができます。これに応じて、放射性トレーサー24〜27で取得されたデータは非常に限られています。AAS法は、電気中性輸送活性のために標準的な電気生理学では分析できないH +,K +-ATPaseに特に有用です。しかし、このプロトコルに示されている例示的なデータは、磁束測定と電圧クランプの組み合わせが、電気中性トランスポーターの電圧依存性を解決することさえできることを示していま...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、メソッド開発の初期段階で寛大なサポートを提供してくださったErnst Bamberg氏(マックスプランク生物物理学研究所、フランクフルト、ドイツ)、多くの有意義な議論をいただいた阿部和弘氏(京都大学、日本)、技術サポートを提供してくださったMichael Kohl博士(Analytik-Service、ヴォルタースドルフ、ドイツ)に感謝します。著者らは、Perkin Elmer AAnalyst 800装置(SFB 498)にも資金を提供したドイツ研究財団DFG(Cluster of Excellence "Unifying Concepts in Catalysis")からの資金提供

に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4.0 Ethicon Vicryl 縫合材料Johnson JohnsonV633H
コラゲナーゼ 1A 型 Clostridium hystolyticumSigma AldrichC9891
高純度 PCR 製品精製キットRoche Applied Science11732676001
Nuclease-free waterAmbionAM9937
mMessage mMachine Kit SP6/T7Ambion1340, 1344
Ouabain octahydrateSigma AldrichO3125
Tricain (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)Sigma AldrichA5040
トリプシン阻害剤 III-O 鶏卵白Sigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
BioPhotometerEppendorf6131 000.012
ホウケイ酸毛細血管科学製品GB150F-8P
ヘマトクリット管 3.5インチドラモンド サイエンティフィック3 000-203-G/X
中空カソード ランプ 光電リチウムP929LL
中空陰極ランプ ルビジウムフォトロンP945
マイクロピペットプーラー 成重モデル PC-10
卵子記録室 RC-10ワーナー研究所W4 64-0306
Nanoject IIインジェクションポンプDrummond Scientific3-000-204
pCLAMPソフトウェア分子デバイス
ポリプロピレンサンプルカップ(1.2 ml)Perkin ElmerB0510397
Speedvac-コンセントレータモデル5301ッペンドルフ5301 000.210
THGAチューブPerkin ElmerB3000641
ターボTEC-10CXアンプNPIエレクトロニクスTEC-10CX
エ

参考文献

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