虚血ラットの肺の血管新生

サマリー

肺は全身気管支動脈と肺動脈の両方によって灌流される。ほとんどの肺の病変では、堅牢な血管新生を示す小さい全身の血管系である。肺血流の停止は好調気管支血管新生を促進する。我々は気管支血管新生を促進し、左肺動脈の虚血を誘導手術の詳細を提供します。

要約

成人肺は全身気管支動脈と肺動脈を流れる全体の静脈還流の両方によって灌流される。ほとんどの肺の病変では、強化された肺血流の必要性に反応し、強固な血管新生を示す小さい全身の血管系である。肺動脈の閉塞によって誘発される肺血管虚血は人間にだけでなく、いくつかの動物モデルにおける急速な全身の動脈血管新生をもたらすことが示されている。ラットにおける気管支動脈増殖の経時変化の組織学的評価は慎重にウェイベル¹で説明したが、新造船のこの組織的な成長のための責任のメカニズムは明確ではありません。我々は気管支血管新生につながるラットに左肺動脈の虚血を誘発する手術の詳細を提供します。血管新生の程度の定量化は、肺内の二つの血管床の存在に起因する新たな課題が発生します。メソッド標識ミクロスフェアの注射に基づく機能血管新生を決定するために提供されています。

概要

肺における全身の血管新生は、よく認識されています。例えば、喘息^2、間質性肺線維症^3、癌^4、慢性肺血栓塞栓症⁵で全身血管系および肺実質肺増殖を取り囲み、侵入などの疾患の状態にあります。しかし、全身のこの差の活性化ではなく、肺循環を研究するための動物モデルがいくつかあります。おそらく成人哺乳類の肺における全身の血管新生の最も再現性のモデルは、慢性的な肺動脈虚血を誘発した後に発生するということです。 ^5月7日 、ヒトの左肺 ​​動脈閉塞に対する応答は^、8匹の犬、豚^9、10羊、モルモット¹¹匹のラット^{1、12、13、}およびマウス^14が気管支動脈と同様に肋間動脈の急速な増殖である。全身neovasculariの責任のメカニズム肺虚血後の肺のzationはほとんど不明であり、広く研究されていない。左肺動脈閉塞後のラットにおける気管支血管新生の時間経過を注意深くウェイベル¹の組織の仕事を説明してきた。ラットでこの仕事拡張、我々の研究室では、このプロセスの重要な成長因子ならびに肺におけるこの新生血管の生理学的結果の両方に焦点を当てている。結果は、CXCケモカインCINC-3は初期の虚血後の上昇とCXCR2に対する中和抗体を用いてラットを治療する、CINC-3受容体は、血管新生^13を減衰させます。されることを示す14日間肺虚血発症後新たに設立された気管支血管系が大幅に増加した蛋白質の透過性¹⁵で異常であることが示された。左肺機能が拡散能力と肺気量の減少が¹⁵減少し、通常の上映はありませんでした。新生血管は、共同があるかもしれませんが慢性肺虚血時の肺組織の保全にntributed、それは正常ではないと表示され、肺機能の持続的な減少に貢献するかもしれない。

おそらく、このモデルの最も奇妙な側面の一つは、血管増殖の空間分布に関するものである。虚血による肺実質内の成長因子の放出にもかかわらず、新生血管は比較的大きい上流の気管支動脈に由来する。通常の気管支動脈は、大動脈からの小さな枝のように発生し、気管分岐部における気道ツリーに侵入する。したがって、成長因子は動脈形成の初期段階を誘導するメカニズムは明らかではない。我々は、ラットは、ヒトに類似した血管解剖で、肺虚血時の全身の血管新生の責任のメカニズムを研究するためのユニークな機会を提供することを示唆している。左肺動脈の完全閉塞は、ヒト対象におけるまれなことですが、増加気管支血管分布は同様に何でも肺動脈閉塞¹⁶の部位と大きさの患者で誘導されることが表示されます。従って、我々は、ラットの左肺動脈と血管新生の大きさを定量化するための手段を連結するための外科的アプローチの詳細な説明を提供します。

プロトコル

ラット上で実行されるすべてのプロトコルは、ジョンズ·ホプキンス大学の動物実験委員会及びNIHガイドラインに従って承認されている。可能な限り、動物を外科手術部位の汚染を最小限に抑えるために手術領域から別の領域に整形処理されるべきである。

1。麻酔/鎮痛

1. イソフルラン3パーセントを注入誘導チャンバー内の、場所のラット（ハーラン、インディアナポリス、インディアナ州のSprague Dawley雄ラット、125〜150グラム）。
2. 3パーセントイソフルラン麻酔とノーズコーンと人工呼吸器に接続されている手術·ボード上に麻酔をかけたラットを置きます。すべてのプロシージャのための無菌技術を使用しています。無菌手術領域を確保するためにラットをドレープ。

2。挿管

1. 外科用テープを使用して仰臥位で肢を固定。
2. ノーズコーンからラットを外し、パッドを入れられた鉗子で舌を伸ばす。
3. ガイドとして鈍い金属スタイレットと14ゲージintracathを使用しています。に後ろにスライドさせます気管にngue、。
4. 気管内に白いプラスチックintracathを残し金属スタイレットを取り外します。ラットが呼吸していると空気が管を通って流れていることを確認します。
5. カテーテルに直接アダプタにノーズコーンを交換して、人工呼吸器（; 8ミリリットル/ kgを一回換気量、齧歯ベンチレーターモデル683、ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州90回/分）にラットを接続します。
6. Puralube（シャインバトラー、オハイオ州ダブリン）目に獣医軟膏を塗る。

3。開胸術

1. 場所ラット右側を下には、外科用テープを使用して付属物を固定する。
2. 左側胸郭領域を剃る。
3. 小型真空で過剰毛皮を取り外します。
4. ポビドンヨードswabstick（Dynarex株式会社Orangebur、NY）に続いてアルコールで拭くことによって無菌領域を作成します。このプロセスを2回以上（3スクラブの合計）を繰り返します。
5. フィールドの中央に無菌の解剖ハサミまたは滅菌メスで横切開を加えます。
6. リットルを通して解剖鈍ダウンリブに対する組織と脂肪のエアーズ（最後の層は肋骨を覆う薄い膜です）。
7. 第³肋間を決定するために肋骨を数える。
8. 無菌の45°グレーフェ鉗子を用いて^、3回目と4 ^回目のリブの間に鈍い切開を行います。
9. リブの区切りを挿入して、開いたままにして縫合糸で、肺の完全な可視化機能を備えたオープン·ボイドが優しく場所テープを引き出します。

4。左肺動脈結紮

1. 90°グレーフェ鉗子で、右手で背中左肺に移動します。
2. デュモンパターン＃5ストレートピンセットを用いて、左手で左肺動脈と気道をつかむ。左肺動脈は気道の上に横たわっています。鉗子は、テーブルに直接垂直であることを確認します。さらに、それは最も遠位の位置（実質に近い）で左肺動脈/左主気管支を拾うために最も効果的である。この左側の操縦にして脇に置いておき換気左肺を押してください。
3. デュモンを使用パターン＃5 45°彼らの自然な境界で左主気管支から左肺動脈を分離するための湾曲したピンセット。この区切り線は、2つの個々の構造の間に薄いと白で表示されます。
4. 血管を経由せずに動脈の直下区切ります。スムーズ分離に沿って一緒に開催された鉗子先端をスライドさせます。
5. 鉗子の先端が目に見えて左肺動脈と左主気管支を分離するまで続行します。先端のわずかな点は完全にスルーする必要があります。血液は、鉗子の先端に可視化することができるなら、それは完全に通っていないとライゲーションは試みられるべきではありません。一度スペースを通って、左肺動脈は、鉗子の曲線上に横たわっています。この位置で保持します。
6. 優しくまっすぐ鈍鉗子グリップ（左手）を放してプレカット縫合（〜2-3インチ、ポリプロピレン縫合サイズ6から0、マイコ医療、ノースカロライナ州ケアリー）の部分をつかむ。
7. 左肺動脈とgをあやし湾曲鉗子を開くRABの縫合。優しく鉗子の曲線に対して上方運動で左肺動脈と左主気管支の間の空間を縫合糸を引き出します。
8. 慎重小間結び、縫合糸のスニップ、残りは左肺を閉塞縛り付ける。
9. （青モノフィラメント）ポリプロピレンで二回リブ及び縫合糸を保持するために鈍鉗子を使用して閉じるリブ大きさないように注意されて、19ミリメートル、止血に針を（マイコ医療、Cary、NC）を切断3月8日サークル逆に接続されている4から0縫合スキン（のみリブ）。
10. 緩い本結びを完成させ、肺を膨らませて、呼気終末陽圧（PEEP、2月5日CMH ₂ O）の上に置き、安全な結び目を肺をしっかりと超インフレにすると、縫合糸の残りの部分を切り取る前に、別の完全な結び目を作る。 PEEPから取り外し、肺が崩れないようにするために30秒間可視化する。 5滴BupivicaineをAPP（医薬品、Schaumbur、IL）を適用します。
11. 傷口に組織接着剤を配置することによって、皮膚を​​閉じて、途中で戻って使用して一緒に肌をプッシュ綿の先端アプリケータのd。その後、切開部位で24時間毎に8時間で、または動物が正常な活動を再開するまでBupivicaine（2.0 mg / kgの皮下）を得た。このエリアの皮下層が非常に薄いように、それは自分自身で縫合することは容易ではない。組織接着剤が適用されると皮膚が一緒に押されたとき、それはまた、皮下層を閉じます。
12. イソフルランガスをオフにして自主的な動きが戻ってくるまで部屋の空気で1〜2分間ラットを換気し続けています。人工呼吸器から気管チューブを外して、ネズミがそれを削除する前に、自発的に呼吸していることを確認してください。
13. 綿棒とモニタの移動およびリカバリに対応した目からPuralubeを拭き取ってください。ブプレノルフィン塩酸塩（0.05 mg / kgを腹腔内、バトラーシャイン、ダブリンOH）を注入します。手術後48時間ごとに12時間の鎮痛薬の配達を続けている。

5。左頸動脈にカニューレ

気管支perfusの大きさを評価するために、左肺動脈結紮後の所望の時点で虚血性左肺のイオンは、大動脈弓に左頸動脈を介して標識した微小球を注入します。 1月2日、上記のようにラットを準備します。

1. 首に沿って正中線をカットし、気管と左頸動脈（マイクロスフェア注射部位）を明らかにするために解剖鈍らせる。
2. 25グラムの針、4ウェイストップコック、1mlシリンジに接続して、容器内にPE20チューブ（Becton Dickinson社製、MDをスパークス）のヘパリン化生理食塩水、鈍先端で満たさカテーテルを挿入します。
3. 30秒間水を超音波処理で、ミクロスフェアの代わりボトル（インビトロジェン社、ユージーン、オレゴン州15μmで深紅のポリスチレン蛍光ミクロスフェア、1×10 ⁶球/ mlとなる）。
4. ボトル、渦を取り外して、20グラムの針を介して1ミリリットルハミルトンガラスシリンジ（ハミルトン社、リノ、ネバダ州）に0.5ミリリットル（500,000マイクロスフェア）を策定する。
5. 4方活栓にハミルトンシリンジを取り付け、シリンジポンプを用いて微小球を吹き込む（速度：500μL/分;魔神プラス、​​ケント·サイエンティフィック、Torringt）CT、上の。
6. を500μl/分でheparized生理食塩水1mlでハミルトンシリンジとフラッシュ装置を取り外します。
7. 完全な胸の開胸を行い、下大静脈を切断することによってラットを放血させる。
8. 左肺および関心のある他の組織を削除します。
9. 組織からミクロスを抽出するには、放血後のラットの左肺全体を取ると2M KOH（4-6 ml）に入れてください。 55℃の水浴中でプレイスと組織消化のために一晩のままにしておきます。ビーズ、ボルテックス（10秒）、遠心（; 20℃で10分間2000 rpm）を洗浄するためにTween80を（0.25％）を追加します。上清を取り除き、2 - エトキシエチル（1ml）を追加し、ボルテックスし、1時間放置する。渦サスペンション、遠心（2,000 rpmで、（20℃10分間）日立F-2500蛍光分光光度計を用いて測定キュベットで蛍光、場所を含む2 - エトキシエチルアセテート、水層（励起612/emission 618を削除します。 ; DIGILAB、ホリストン、マサチューセッツ州）。

結果

血管キャスト：ラットにおける左肺動脈の虚血の影響の結果を図1に描かれている。示す気管支血管系及び28日後に左LPAL気道ツリーの広範な血管のメタクリレートキャストです。このキャストを取得するには、全身の血管系は、下行大動脈への逆行、メタクリル酸混合物（赤）を注射したと気管カニューレを挿入し、白のシリコン系材料を注入した。この血管のキャストは、肺の気管支、血管新生の顕著な可視化を提供します。特に注目すべきは左肺の大規模な、曲がりくねったアップストリーム気管支血管があります。この画像には示されていないが、右気管支は通常、孤独、右気管支動脈を除いて大型船の本質的に欠いている。

組織学：左肺組織切片で可視化気道血管新生の変化を図2に示す。 BronchIAL船はLPALが示されている3日間、14日後に観察した。 図2Aは 3日LPAL後に左肺から気道の断面を示している。気道壁内に位置する著名な気管支血管に注意してください。挿入図は、PCNA（増殖細胞核抗原）に対して染色2Aの連続切片からの...

ディスカッション

試験したすべての種で左肺動脈の結紮は、虚血性の肺の堅牢な全身性血管新生につながる。我々はラットモデルにおける外科的アプローチの詳細を提示している。我々の結果は、血管の鋳造、病理組織によって作り出され、in vivo標識に気管支動脈が増殖し、肺実質を灌流することを示す。したがって、気管支血管新生のメカニズムが慢性肺血栓塞栓症の人間の条件に匹敵する動物モデルで検討することができます。さらに、この臨床的に関連する小さな動​​物モデルは、人体実験が批判に耐えない血管新生の形と機能を研究する機会を提供しています。

記載されている外科的処置は、手術経験を持つ動物技術者はすぐにこれらの技術を習得することができる必要がありますように十分な詳細を提供します。我々の観察では、Sprague Dawleyラットの雄で主にされてきたがラット（75〜g）は、他の株は、研究のために均等に適しています。私たちは、体系的に気管支血管新生の程度の年齢依存性の評価を行っていない。我々はまた、左頸動脈のカニュレーションの詳細を提供してきました。私たちは逆行左頸動脈に注入蛍光ミクロスフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬：	会社
塩酸ブプレノルフィン、Puralube	バトラーシャイン
bupivicaine	APPファーマシューティカル
ポビドンヨードswabstick	Dynarex株式会社
ポリプロピレン縫合サイズ6-0、3月8日サークルリバースカッティング針	マイコメディカル
PE20チューブ	ベクトン·ディッキンソン
15μmで深紅ポリスチレン標準粒子	インビトロジェン
1ミリリットルガラスハミルトンシリンジ	ハミルトン株式会社
機器：
魔神プラスシリンジポンプ	ケント·サイエンティフィック
蛍光分光光度計	DIGILAB
齧歯類ベンチレーターモデル683	ハーバード装置
			表1特定の試薬 ​​や機器の表。