鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

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方法論記事

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

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DOI:

10.3791/50305

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2013年3月18日

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

ここでは、神経と後脳における聴覚軸索線維の選択的なトレースのための初期のニワトリ胚の音響神経節への蛍光色素を注入し顕微解剖法を説明します。

要約

ニワトリ胚は、末梢および中枢神経節細胞の突起の研究のために広く使用されているモデルです。聴覚系では、VIIIth脳神経内聴覚軸索の選択的標識は、中枢聴覚回路発達の研究を強化するであろう。内耳の複数の感覚器官がVIIIth神経¹に貢献するため、この方法は困難である。また、確実に鳥VIIIth神経軸索内の前庭グループに対して聴覚を区別するマーカーが同定されていない。回路が形成される前に、感覚誘発反応が存在していないとして、聴覚と前庭の経路は、初期胚において機能的に区別することはできません。一元的に突出したVIIIth神経軸索は、いくつかの研究でトレースされているが、聴覚軸索標識は他のVIIIth神経コンポーネント^2,3からラベリングを伴っていた。ここでは、音響神経節から選択ラベへのトレースを順行するための方法を説明します開発VIIIth神経内のL聴覚軸索。まず、酸素人工脳脊髄液中に浸漬し、8日、ニワトリ胚の前頭部の部分切開した後、蝸牛管は、解剖学的なランドマークによって識別されます。次に、罰金引かガラスマイクロピペットは、音響神経節細胞が配置されているダクトと隣接深い領域にローダミンデキストランアミンを少量注入するように配置されている。注射後30分以内に、聴覚軸索は後脳に集中的に追跡され、後に、次の組織学的準備を可視化することができる。この方法では、中枢聴覚回路形成に周辺の発達研究のための便利なツールを提供します。

プロトコル

1。以下解剖ツールおよび試薬を準備

連続して95％Oを流し込んで、人工脳脊髄液（130mMのNaCl、3mMのKClを、1.2mMのKH ₂ PO _4、20mMのNaHCO _3を、3 mMのHEPES、10mMグルコース、2mMのCaCl _2、1.3mMのMgSO _4を ACSF）室温で_{2/5％CO 2で} 。点滴は、2月3日ふたに穴を開けた500ml広口ナルゲン瓶に記入してください。タンクは瓶のふたの穴に通しACSFを貫通ガラスステムバブラーにチューブで接続されます。液体の約1/3に達するが、リムの上に飛散引き起こすのに十分な説得力がありません泡の一定のストリームを取得するために圧力を調整します。互いから、ガス流の乱れから、個々のサンプルを分離するナルゲン瓶に沈める5ミリリットルガラスバイアル（最大6）。 ACSFは、どの組織のインキュベーションの前に少なくとも20分間酸素化されるべきである。
小さなシリコーン解剖皿（35ミリメートル×10小さな六角形のポリスチレンに配置された2つの解剖ピン付きシルガード弾性体キットを使用してmmペトリコーティング）（47ミリメートルの下）ボートの重量を量る。
二つ精密チップ·鉗子、1湾曲先端鉗子、50mlビーカー、および組織廃棄用のコンテナ。
ガラスマイクロピペット（1.2外径/ 0.9 ID）の先端の開口は約20から50程度に分割して0.4パーセントと6.25パーセント·ソリューションのトリトンX-100、PBS中におけるローダミンデキストランアミン（RDA、MW = 3000、Invitrogen社製）を充填した引っ張ら。マイクロマニピュレーターにpicospritzerして安定化する細かいチューブで取り付けます。

2。顕微解剖E8 ^4,5で乳頭基部を明らかにする

湾曲したピンセットで、ボートの重量を量る内にシリコーン被覆解剖皿に直接頭を置いて、ちょうど脳幹下E8胚を切った。
興味のある側の耳が少し見えるように位置腹望むヘッドは、解剖のピンを使って、頭がわずかに背側に傾けて、CEから10から30度を指しているNTER（ 図2A）。すぐにピンと頭を固定します。二国間のトレースは、中心0度ヘッド、または両側がアクセスできるように、完全な腹ビューを希望する場合は。左側がアクセスしやすいように同様に、左サイド注入のために、中心から-30度〜-10で頭部を固定します。
50ミリリットルのビーカーを使用して、完全に組織を浸漬、皿に酸素化ACSFの30ミリリットルを転送します。
そっとつかんで、精密チップ·鉗子を用いて下顎ダウンはがし、次に興味のある側に下瞼を削除します。
残りの口蓋と食道を含め、上層の血管組織を削除します。これらの軟部組織が剥がれ、その表面に独特の椎骨動脈と軟骨頭蓋の開発の滑らかな表面を明らかにする必要があります。この時点では、特徴的な白いotoconial質量が見えるはずです。
に残したまま、慎重に外尿道口、顎関節の軟骨、中耳の周りの皮膚を切開NERの耳無傷。そっとこれらの軟骨構造を切り取るために鉗子を使用しています。
椎骨動脈を外し、細かい鉗子のヒントと穏やかな弧を描く動きを用いて血液をプール。血がビューと凝固がインジェクションピペットの開口部を塞ぐことが見えにくくなる場合があります。
隣接感覚上皮（乳頭基部）と聴神経節と蝸牛管は軟骨頭蓋⁶の直下に位置し、前方の近くの最も遠位の先端（頂点）で、腹側内耳から延びる細長い指状の突起として可視化することができる正中線^5。視覚化するのを助けることができる蝸牛管（ 図2B）の頂点に解離および/ またはotolithic石灰（白）から少量の血液プーリング（赤）があるかもしれません。頂点にlagenar黄斑ですが、感覚パッチは前庭機能^7,8であると思った。

3。 CN VIII聴覚繊維の選択的標識

蝸牛管と乳頭基部領域における胚の表面付近インジェクションピペットを置きます。
最初はゆっくり穿刺頭蓋にマイクロピペットを下げます。この頭蓋領域は、周辺地域よりも薄く、小さい力が浸透している必要があります。マイクロピペットは現在、蝸牛管の内側になければなりません。オプション：トレース染料の小さな注射は乳頭基部を視覚化するのを助けるためにここで行うことができます。
マイクロピペットの位置を変更せずに、単に侵害それまで蝸牛管（ 図1）の深い境界線を下げ続けている。ここに注射を行うと前庭つぼが置かれている最も近位チップを除く、乳頭基部（ 図2C、2D）の長さ方向に沿って複数の地域で繰り返す。 10から30 psiの間に設定picospritzerで、いくつかの注射が行われます。注入された色素の流体の体積は変化し、所望の標識の程度に依存する。各注射は蛍光色素ラをもたらすべきである約200のbeledスポット- 400μmの直径（ 図2D）。
注入が完了すると、脳幹上記サンプルを横断すると、継続的に95％O _{2/5％CO 2下}で灌流さACSFのコンテナ内に小さな瓶に尾部を配置するためにホールピペットを使用する鉗子を使用しています。
各胚については、目的の中央トレースの距離に応じて、移染のために20-30分を許可します。
組織を除去し、組織学的切片の準備をします。ここに示す例では、組織は4％パラホルムアルデヒド（1X PBS中）を一晩一晩、30％スクロース（1X PBS中）に浸漬されている。

4。対比と分析

対比は、解剖学的位置に向きをオブザーバを助けるだけでなく、関心のある特定の領域を識別するのに便利です。この製剤における有効対比を強くリットルニューロフィラメント免疫標識（ 図1、図3B、3E）であり、abelsは、軸索と中枢神経の軸索路の区分を可能にします。
予測はrostrocaudal軸に沿って数百ミクロン以上を拡張することができますように分析は、標識された地域全体で行うべきである。基本的な分析のいくつかの例は以下のとおりです。ターゲットエラーレート、タイミングおよび/または投影パターンの発散の変化。 RDA-標識軸索は、高解像度（ 図3A、3D）と末梢および中枢神経系において可視化される。