蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

サマリー

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。

要約

細胞が感知し、そのような細胞外マトリックスや成長因子などの水溶性の手がかりの糖タンパク質などの接着手がかりの高い濃度に向かって移動することができます。ここでは、ライブセルイメージングと互換性のあるマイクロ流体チャンバー内に接着剤及び水溶性の手がかりの対向するグラデーションを作成する方法を概説しています。ポリ-L-リジンおよびポリエチレングリコール（PLL-PEG）の共重合体は、カバーガラスを不動態と生体分子と細胞の非特異的吸着を防止するために採用されている。次に、マイクロコンタクトプリンティングまたはディップペンリソグラフィーは、接着手がかりとしてビオチン化ペプチドアルギニン - グリシン - アスパラギン酸（RGD）のためのポイントをアンカーとして機能するように不動態化された表面にストレプトアビジンのトラックを作成するために使用されます。マイクロ流体デバイスは、修正された表面上に配置され、ストレプトアビジントラックに接着手がかり（100％、0％、RGDにRGD）の勾配を作成するために使用されます。最後に、同じマイクロ流体デバイスは、化学誘引成功のグラデーションを作成するために使用され接着剤手がかりの勾配の反対方向に可溶手がかりとしてウシ胎児血清（FBS）、hも付きます。

概要

監督細胞遊走は、多くの細胞の基本的な財産であり、胚発生、感染防御、創傷治癒を含む多くの正常な生理学的プロセスの重要な側面である。加えて、細胞遊走はまた、血管疾患、腫瘍細胞の転移および慢性炎症の^1,2のような多くの疾患において重要な役割を果たしている。古典的な細胞移動の状態が-偏光、突起伸展性、接着性、力発生とリア撤回の形成は-一般的に^3,4を受け入れており、信号の統合が調整されることによって時空のメカニズムを解明することは、より困難になっています。

細胞外マトリックス（ECM）は、細胞接着のための基質として機能し、固有の化学的および物理的な^{5 6}多様性を通じて、セルナビゲーション^7,8のための方向手がかりを提供しています。これらの接着剤の合図^9、可溶性因子^10月12日に加えて^、</ sup>のようなケモカインおよび増殖因子としては、化学誘引物質受容体とその下流motogenicシグナリングを介して導か細胞遊走を誘導することができる。現在、このような受容体チロシンキナーゼ（RTK）などの関与と接着受容体（ すなわち、インテグリン）または化学誘引物質受容体を介したシグナル伝達、かどうかは知られていない、支配的である。また、それは受容体系の階層は特定の細胞型であるかどうか知られています。

生細胞顕微鏡、バルクアッセイではアクセスできませんし、固定化された^13,14及び可溶性手がかり^{15 16}の勾配を生成するマイクロ流体デバイスと組み合わせることができる豊富な情報を提供します。ここで説明する方法は簡単に細胞生物学研究室（ 図1）で実施可能であることを細胞遊走のイメージングアッセイを作成するには、市販のマイクロ流体室と連携して、表面改質のためのシンプルで確立された一連の手順を利用しています。組み立てマイクロ流体デバイスは、ガラス¹⁷に匹敵すると拡散性分子の勾配は少なくとも16時間安定している光学特性を持っています。システムは、落射蛍光顕微鏡と高度な技術を使用することができます。他の走化性のセットアップ¹⁸とは異なり、このシステムは徐々に移行し、接着細胞を記録するのに適しています。重要なのは、システムがモジュール化されており、簡単に代替接着剤や水溶性遊走の手がかりと様々な種類の細胞の検査の導入が可能です。

プロトコル

1。 PLL-PEG-ビオチンとカバーガラスのパッシベーション

このステップは、細胞がmicrocontract印刷（ステップ2-3a）またはディップペンリソグラフィー（ステップ3b）で作成されたガラスカバースリップ上の特定の領域上に付着し、移行するように、表面を不動態化するために設計されています。不動態化のために、ポリ-L-リジン（PLL）とポリエチレングリコール（PEG）との共重合体は、PEG分子の20％がビオチン（PLL-PEG-ビオチン）にグラフトされた使用されています。

1. カバーガラス（18ミリメートル×18ミリメートル）、100％エタノールでラック内の水没、それらをきれいにし、30分間超音波処理浴中にラックを配置します。空気中または窒素気流下でカバーガラスを乾かします。
2. 次に、1MのNaOHで30分間、カバーガラスを超音波洗浄します。その後慎重に1.5リットルのMilli-Q H _{2 O}を入れたビーカーにラックを浸漬することにより、ガラス表面をすすぐすすぎ工程に新鮮なのMilli-Q H ₂ Oの各時間を使って3回繰り返します。でカバーガラスを乾燥60℃のオーブン℃の
3. きれいなガラスの場所の半分が部分的にH _{2 O}に満ちた24ウェルプレートで作られている湿潤チャンバー内に個別にカバースリップ各ガラスカバースリップ上のPBS中のPLL-PEG-ビオチン（1 mg / ml）を15μlのドロップします。残りのきれいなガラスカバースリップの残りの半分を取り、慎重にサンドイッチPEG溶液を。湿潤チャンバーで1時間カバースリップのままにしておきます。 PEG-被覆表面をこすることなく、静かに互いから離れ挟まカバーガラスをスライドさせたMilli-Q H _{2 O}でそれらを洗い流す水は、PEG処理面上で容易にスライドさせて外してください。必要であれば、処理された表面とペーパータオルの上で空気乾燥したカバーガラスは上向き。さらに使用するまで真空デシケーター中でカバーガラスを格納します。

2。マイクロコンタクトプリント用のスタンプの作製

我々は、不動態化されたカバーガラス上にパターンストレプトトラックに2つのプロセスについて説明します。最初のものは、マイクrocontact印刷は、一般的にPDMSスタンプが鋳造されているからシリコンマスターの製作が必要になります。我々のケースでは、PDMSスタンプ上のパターンは、25μmの特徴高さが290μmの中心から中心までを離間さ100μmの幅の線である。以下に、我々は適切なシリコンマスター（ステップ2.1から2.3まで）とPDMSスタンプ（ステップ2.4​​）を製造する方法を簡単に説明します。しかし、カバーガラス上にタンパク質パターンを印刷するのに適している文献^19から23に記載のマイクロコンタクトプリンティングのための複数のプロトコルがあります。マスターズはまた、カスタムメイドや商業的供給源から購入することができます。

1. ミリQ、H _{2 O}で徹底的に10回、20分間ウェーハをすすぐ。：まず、ピラニア溶液（硫酸のvと30％過酸化水素3時01 v）中でインキュベートすることにより、シリコンウェハ（4 "直径）をきれいに150℃のオーブンでウェハを乾燥°CO / N
2. 100％イソプロピルアルコールに続いて、100％アセトンできれいにし、乾燥させたシリコンウェーハを洗浄します。次のGM1070 SU-8フォトレジスト（Gersteltec Sarlは）3,100 rpmでウェハ上にスピンコート2ミリリットル40秒間は、25μmの厚さの層を作成することができます。次いで、試料を95℃でさらに5分間続く5分間℃における65℃のホットプレート上で焼かれる
3. 所望のパターン（Quintel Q6000マスクアライナを使用するなどして）、フォトマスクの下で60秒間紫外線にSU-8フォトレジストを露出させ、ベーキング処理は2.2で説明する繰り返し。その後、サンプルを4分、100％のイソプロピルアルコールで洗浄し、窒素気流下で乾燥するため、SU-8の開発者（Gersteltec Sarlは）でウェーハを浸漬することにより開発されています。紫外線に露出していなかったSU-8フォトレジストの領域は、このようにPDMSスタンプの逆パターンを作成して、削除されます。
4. 次のステップは、シリコンマスターからPDMSスタンプをキャストすることです。まず、徹底的にエラストマーポリマー10部（シルガード184）と硬化剤1部（w / w）を混ぜます。任意の気泡、脱気真空ラインに接続されたデシケーター中に混合物を削除するには1時間。次に、高さが約1cmにシャーレ内のシリコンマスター上にPDMSエラストマーを注ぎ、1時間で70℃のオーブンで、マスターとPDMSの混合物を硬化させる。最後に、PDMSスタンプを、シリコンマスターから削除され、大きさにカットされています。

3。非アクティブ化されたカバーガラス上にパターニングストレプトアビジンまたは接着手掛り

カバーガラスを不動態化した後、タンパク質パターンがマイクロコンタクトプリント（ステップ3a）またはディップペンナノリソグラフィー（ステップ3b）がプリントされています。我々のケースでは、ストレプトアビジンは、RGD勾配（ステップ4）の基礎を形成する線として印刷されます。同じ手順を、また、接着剤パターンを作成するためにマトリックスタンパク質を印刷するために使用することができます。

表面への生体分子のパターニングのためのマイクロコンタクトプリンティングに代わる方法は、ディップペンリソグラフィーです。ディップペンリソグラフィーでは、カンチレバーが表面に少量の溶液を転送するために使用されています。カンチレバーの大きさは、vソリューションのiscosityは、表面上にカンチレバーの接触時間、印刷室の表面や湿度の疎水性は、プリント機能のサイズを決定します。この方法の利点は、マスターと切手を製作する必要がないように、異なるパターンは、それぞれの実験のために印刷することができることである。欠点は、それが与えられたパターンをプリントし、ディップペンリソグラフィーは、多くの研究室では使用できない可能性が専門機器を必要とすることに時間を要することです。我々が使用したディップペンリソグラフィー機器はBioforceナノサイエンスからNanoeNablerだった。ここで、我々はSPT10カンチレバーを使用しているため、直径<10μmであった小さなドットを印刷した。

3A。マイクロコンタクトプリント（μCP）法

1. きれいにし、PDMSスタンプをより親水性にし、1.5時間のための紫外線とオゾン（Bioforceナノサイエンスから例えば、UVオゾンProcleaner）のPDMSスタンプのパターン化された側を治療する。別の方法として、プラズマを使用同じ目的のために短い時間のためのクリーナー。このプロセスは、印刷プロセスを改善し酸化PDMS表面^24を作成^します 。
2. ただちに、オゾンやプラズマ処理後、PDMSスタンプ上に10μlのストレプトアビジン（PBS中1 mg / ml）を広げ、湿潤チャンバーで1時間放置（そのような部分的に充填された6ウェルプレートのような、ステップ1.3を参照） 。トラックは、蛍光顕微鏡下で表示する必要がある場合、例えばストレプトアビジン-AlexaFluor350としてフルオロフォアにコンジュゲートしているストレプトアビジンを使用しています。
3. ティッシュペーパーと空気で約1分のスタンプを乾かすとスタンプから過剰ストレプトアビジンを削除します。軽くPLL-PEG-ビオチンでコーティングされたガラスカバースリップ上にスタンプを押します。
4. 蛍光ストレプトアビジンがステップ3.a2で使用された場合は、落射蛍光顕微鏡下で使用してパターンを調べます。デシケーターで印刷面を保管してください。

図3b。ディップペンリソグラフィー

1. まず、1 mg / mlのストレプトアビジンまたはSTREの1部を混ぜてグリセリン10部（v / v）でptavidin-AlexaFluor350とカンチレバーに混合液5μlをロードします。ディップペンリソグラフィー装置の取扱説明書で説明されるように、印刷プロセスを開始します。印刷速度を調整し、約5μmのスポットサイズを小さくするには、表面への表面やカンチレバーの垂直距離でカンチレバーの時間にお問い合わせください。 図2cに示す例では、ドットは行10〜15μmに設定カラム分離に沿って印刷されました。この距離は、お互いに併合からドットを防止するのに十分であるが、ほとんどの顕微鏡設定でビューの1つのフィールドに複数のドットを表示することができます。
2. デシケーターで印刷面を保管してください。

4。ストレプトアビジン - パターン表面上に接着剤グラデーションを作成する

我々は、ストレプトアビジン（ 図3）または共同で被覆されたカバーガラス上にビオチン-RGDの接着グラデーションを作成する不動態化されたカバーガラス上ntainストレプトパターン（ 図5）。表面のグラデーションを作成するために、我々は受動拡散によって安定したソリューションのグラデーションを作成し、市販のマイクロ流体デバイスを（Ibidiからスティッキスライド走^3Dと呼ばれる）を使用しました。ストレプトアビジンの結合部位に対して競合するために、我々は（ 図1を参照）のRGDに共役ではありませんでしたビオチン-RGDとビオチンの対向する2つのグラデーションを採用。

1. スティッキスライド走^3Dデバイスの粘着面上にストレプトアビジン被覆またはパターン化されたカバーガラスを接着。数時間のために漏れがないことを確認するには、デバイスのエッジは温めワセリンの薄い層で、パラフィンワックス1部（w / w）であるワセリン1部の混合物の第2層で封止されている。
2. チャンネル内の6μlのPBSで機器のチャンネルを埋める。その後PBSと70＆mの0.03μg/μLのビオチン-4-フルオレセインの70μlの2つのリザーバを埋めるU; 0.03μg/μLのそれぞれPBSにビオチン-RGDのリットル。 1時間暗所でRTでサンプルをインキュベートする。
3. ビオチンソリューションを外し、まだPBSで二回マイクロ流体デバイスに接続されている間、慎重に表面をすすいでください。接着剤グラデーションの方向をマークし、必要に応じて、4℃でPBSで記入した装置を格納しますが、デバイスが乾燥しないようにしてください。必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて接着剤勾配を分析します。

5。ライブセルイメージングのための蛍光団を有する細胞のラベリング

細胞を蛍光顕微鏡下で細胞の追跡を支援する蛍光色素で標識されています。一般的なプローブは、蛍光オルガネラマーカー、細胞核にラベルを付けるようSYTO 64レッドです。そうするためには、細胞をまず45分間培養培地中の1μMのSYTO 64レッドと一緒にインキュベートし、PBSで3回洗浄し、最後にPBSでさらに3回洗浄する。細胞はすべきではないことに注意してください長時間のPBS中に維持した。

細胞追跡のための代替染料は細胞質を染色CellTrackerシリーズであり、細胞遊走と分裂の際に保持されます。蛍光融合タンパク質を用いた細胞のトランスフェクションは、移行時には、目的のタンパク質の細胞内分布を記録する場合に特に便利です。有機色素よりしかし、蛍光タンパク質は、典型的に、光漂白剤より速く、長期的な観測ができないことがありますので。

6。マイクロ流体デバイスに可溶性グラデーションを持つ細胞のロード

1. 蛍光標識された細胞数を数えると等しいセルの数値の2管に分割。例えば、10％ウシ胎児血清（FBS）で、低血糖ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）等の化学誘引物質を含有する培地で細胞の一つのチューブを洗浄し、再懸濁します。 0パーセントFBSを含むDMEM すなわち 、化学誘引せずにメディア内のセルの他のチューブを洗浄し、再懸濁します。最終濃度各チューブ内の細胞の5×10 ⁵細胞/ mlである必要があります。
2. マイクロ流体デバイス（ステップ4.3）からのすべてのソリューションを外し、顕微鏡ステージ上に置きます（ステップ7を参照）。 1貯水池と別のものにHeLa細胞を70μlの（10％FBSを含むDMEM中に^5×10 5細胞/ ml）に細胞の70μlを（0％FBSを含むDMEM中に^5×10 5細胞/ ml）を読み込みます。緩く蒸発を避けるために、貯水池の上にテープを配置します。表面の細胞は事前イメージングにプレインキュベートされる場合、それは細胞が勾配ない増殖培地中のデバイスにロードされることをお勧めします。次に、このデバイスを顕微鏡のステージ上に配置され、メディアは他の中で、10％FBSを1リザーバーとDMEMでFBSを含まない勾配メディアすなわち DMEMに置き換えられます。

7。細胞イメージングとデータ解析を生きる

1. 顕微鏡（ニコンのTi-E）をオンにして、実験を開始する前に、少なくとも1時間のステージを温める。
2. MICRのそのチャンネルを確認してくださいofluidicデバイスが視野にあり、細胞がフォーカスされている。このような露光時間と蛍光フィルター、細胞やトラックをキャプチャ明視野と蛍光の画像シーケンスだけでなく、時間ポイントと記録の長さ（ 例えば 、16時間毎に15分間）として画像収集パラメータを選択します。
3. そのようなImageJのマニュアルトラッキングまたはIbidi走化および移行ツールとして適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。

結果

セルは渡り鳥の信号^25を統合^する方法を理解するために、我々は競合する接着剤と水溶性の勾配（ 図1）を使用する環境で移行することを蛍光顕微鏡での画像セルにメソッドを開発しました。蛍光ストレプトアビジンとビオチン化RGDが含まれていた接着剤のトラックがマイクロプリントトラックとディップペンリソグラフィー（ 図2）で作成されました。成功したマイクロコンタクトプリントは、接着トラックと防汚領域がはっきりと（ 図2b）を区別することができるトラックにわたる蛍光強度のラインプロファイルで示されます。ディップペンリソグラフィーと印刷されたドットは、丸みを帯びた、成功した印刷工程を示す形破れないように見える。表面の化学的性質と湿度は、印刷処理の結果に影響を与えます。一般的に言えば、より疎水性の表面は、より良い印刷結果です。

接着剤手がかりの勾配印刷されたトラックにビオチン-4 -フルオレセインをロードすることによって、単純なマイクロ流体デバイスで作成され...

ディスカッション

このプロトコルでは、化学的に修飾された表面および細胞遊走に対する誘引物質勾配の影響を調査するために、市販のマイクロ流体デバイス（Ibidiからスティッキスライド走^3D）を使用^しました 。勾配は、チャネルの長さに沿って拡散することによって確立されるので、この設定では、マイクロ流体の流れを必要としません。流れは差ような安定した接着斑と小焦点複合体とシナプス^26を形成^するほとんどの白血球のような高速の遊走細胞を形成する繊維芽細胞のようにゆっくりと移行する細胞に影響を与える可能性があるため、これは重要です。層流からせん断応力は、可溶性手がかり^27,28に向かって接着手がかりと細胞走化性への細胞接着の安定性に影響を与える可能性があります。そこで、本稿では、低速移動HeLa細胞およびそれによってマイクロ流体セットアップは両方の付着が少なく、接着細胞のタイプに適用可能であることを示す動きの速いJ774細胞との間の移行挙動の違いを発見した。このような比較はまたreveale接着剤キュー（RGDペプチドまたはフィブロネクチン）と防汚領域（PEG領...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カバーガラス染色衣装	トーマスサイエンティフィック	8542 E40	カバースリップラック
オーブン	バイン	ダーED53
シリコンウェーハ	シリコンクエスト	708-007	ホウ素ドープ<100名以上ウェーハ、直径4インチ、500 μm、片面研磨
GM1070 SU-8 フォトレジスト	Gersteltec Sarl
SU-8 現像液	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 硬化剤	ダウ コーニング
Sylgard 184 エラストマー プレポリマー	ダウ コーニング
PLL-PEG-ビオチン (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-ビオチン (20%)	1 mg/ml in PBS
フルオレセイン	Sigma	46955	1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein	Invitrogen	B-1370	0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD	GenScript	SC1208	0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μPBSのM
スティッキースライド走化性3D	同上	80328
200 μl Greiner 黄色の面取りチップ	Greiner Bio-One	739261
ワセリン	Sigma	16415
パラフィンワックス、mp 55-57 >C	シグマ	327204
ナノ エナブラー 10 μm カンチレバー	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin	Fabrice Cordelières		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
走化性および移行ツール	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html