トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Yali Zhao; Nancy L. Wayne

doi:10.3791/50312

方法論記事

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

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DOI：

10.3791/50312

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2013年4月30日

Yali Zhao¹ , Nancy L. Wayne¹

¹Department of Physiology, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

このビデオでは、複雑な神経回路を維持し、脳全体の準備、で識別される単一のニューロンからの電気的活動を記録する方法を説明します。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳の準備の識別のための蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。

要約

複雑な行動を調節する神経回路の細胞生理学を理解することは、この作業はCNSの神経回路は無傷のままで無傷の脳の調製において実行可能なモデルシステムを使用して、大幅に高められる。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳内の識別のための緑色蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。魚のGnRHニューロンの複数の集団があり、その機能は、脳内の場所と、彼らは^1を表現することのGnRH遺伝子に依存しています。我々は、トランスジェニックメダカの無傷の脳（ 図1BおよびC）を使用して、嗅球に関連付けられているターミナル·神経（TN）に位置GnRH3ニューロンに私たちのデモを当てている。研究はメダカTN-GnRH3ニューロンは外部環境から中枢神経系への情報の送信器として作用する、神経調節であることを示唆している。トンちょっとなどのよく知られた視床下部GnRH1ニューロン^2、3を実行します。TN-GnRH3ニューロンの自発活動電位の発火のトニックパターンが固有の特性^4-6、周波数であり、下垂体-性腺機能の調節に直接的な役割を果たしていない同種²と神経ペプチドキスペプチン1 ⁵からの視覚的な手がかりによって変調となっている。このビデオでは、TN-GnRH3のニューロンは神経細胞を識別し、脳全体での電気的活動を監視する方法をお見せするために強化された緑色蛍光タンパク質⁷にリンクGnrh3のプロモーター領域を含む導入遺伝子を発現するトランスジェニックメダカの安定したラインを使用準備^6。

プロトコル

1。大人のメダカから脳の解剖

に浸漬することにより（ 図1A）、男性または女性成人を麻酔5ミリリットルMS-222（150 mg / Lで、pHは7.4）、エラの動きがdecapitating前に中止した後、数分待ってください。すべての手順は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の制度動物実験委員会によって承認された。
60 mmの直径のペトリ皿にハサミで蓋の尾側端で魚の生理食塩水で魚の首を刈る。
脳の解剖のために頭を置き、保護するためにその中にうつ病を持っている35 mmの直径ペトリ皿、半魚の生理食塩水で満たされ、シルガードが並んへの転送魚の頭を。位置や虫ピンと背側の頭を固定します。
注意深く細かいハサミでその周囲に頭蓋骨の背の部分をカットし、静かに脊髄の前方部分を含む完全に脳の背の部分を露出させ、ピンセットでそれを削除します。
魚の生理食塩水で満たされた新鮮なペトリ皿に完全に解剖脳を置き、全体の脳は、任意の切り傷や刺し傷なし（下垂体を含む）を無傷であることを確認するために、顕微鏡下で慎重に確認してください。損傷した脳を実験のために使用されていません。

2。録音室における脳の取り付け

記録室の中心に針を持つシアノアクリレートまたはいくつかの他の速効性接着剤の小滴を置き、1cm ^2の約のりを広げた。
迅速に腹側を上位置に脳とのり、それを下に移す。
それは録音室を埋め、脳を覆うように、魚の生理食塩水1 mlを加える。連続灌流少なくとも200μL/分の速度で通気魚の生理食塩水で脳。
微先端鉗子を使用すると、慎重に脳の記録領域の表面上髄膜を除去します。

3。電気生理学

活動電位の発火の緩いパッチ記録
1. ガラス微小電極（MΩ6-10）は、電極プラー（ 例えばサッターP-87）を使用して、ホウケイ酸ガラスピペット（1B150F-4、世界の精密機器）から構成され、バックアップルーズパッチ録音ソリューション中途半端で満たされている電極。
2. 次いで、40×水浸対物レンズ（ 図1C）、冷却された電荷結合素子（CCD）カメラで直立蛍光顕微鏡を用いて、GFPを発現する10倍（ 図1B）を介してTN-GnRH3ニューロンを見つける。彼らは終脳のすぐ前方嗅球の腹面内または付近に位置しています。
3. 提供しているビデオモニターに切り替え顕微鏡からリアルタイム画像TN-GnRH3ニューロンクラスター（ 図1C）を検索する。
4. 電極の先端がニューロン目標を超えているように、お風呂に微小電極を配置します。それが目詰まりしないように、微小電極に一定の若干正圧を適用し、ゆっくりと電極の先端とターゲットニューロンに近づく。
5. AxoGraphソフトウェアとAxographソフトウェア（アクソン·インスツルメンツ）のアンプAxoclamp 200Bを使用して電圧クランプモードで電極抵抗を確認し、監視する。あなたは、電極の先端が神経細胞の表面上に、抵抗が若干変化することAxoGraph表示からであると、ビデオモニタから見ることができる場合には、低オン抵抗のシールを作るために正圧を解放し、必要に応じてわずかな負圧を適用するニューロン（<100MΩ）。
6. 電流クランプモードに切り替えて、スケールを調整し、任意の現在の入力なしで連続して膜電位を記録電圧と記録速度の必要に応じ。データは、パワーラブソフトウエア（ADInstruments社製）により回収し、分析する。
7. 任意の治療（ 図2A）の前に、約5分間、通常の魚の生理食塩水のレコードベースラインの電気的活動。薬、ホルモン、ペプチドなどの浴灌流。魚の生理食塩水に加え、通常の魚の生理食塩水^5、6、11でウォッシュアウト期間が続く200μL/分の速度、に続く。
膜電位の全細胞記録
3.1.4 - 全細胞パッチクランプ電気生理学的手順は、ステップ3.1.1から、上述した外ルーズパッチ記録過程と同様である。その後の手順は、それに応じてずれる。
1. 電圧クランプモードで電極抵抗を確認し、監視する。あなたは、電極の先端が神経細胞の表面上に、抵抗変化がわずかに正を解放することをオシロスコープであることから、ビデオモニタから見ることができる圧力とニューロン（〜3ギガΩ）上の高抵抗シールを作るには少し負圧を適用する。破裂パッチを適用した膜に口で優しく吸引を適用し、あなたはMΩ約120から250への抵抗の急激な低下が表示されます。
2. 電流クランプモードに切り替え、必要に応じて電圧と記録速度のスケールを調整し、任意の現在の入力なしで連続して膜電位を記録します。
3. 3.1.7（ 図2B）で上記のように任意の治療の前に、約5分間の通常の魚の生理食塩水のレコードベースラインの電気的活動。