方法論記事

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

DOI：

10.3791/50321

⸱

2013年4月14日

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。

要約

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ここでは、効率的にヒト多能性幹細胞（PSCの）から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための段階的な手順が記載されている。分化過程は、細胞が浮遊培養に置かれたときに凝集体を形成するために切り上げ塊に人間のPSCを壊すことによって開始されます。凝集体は、その後自発的分化を可能にするために日1月4日からのhESC培地で栽培されています。この間、細胞は三胚葉のいずれかになるための能力を持っている。日5月8日から、細胞は、神経系統にプッシュした神経誘導培地に置かれます。 8日目ごろ、細胞を6ウェルプレートに取り付け、その間神経上皮細胞の形の間を区別するために許可されています。これらの神経上皮細胞は、17日目に単離することができる。彼らはカバースリップ上に播種できるようになるまで細胞はその後ニューロスフェアとして保持することができる。任意caudalizing要因なしに基本的な培地を用いて、神経上皮細胞はspecifieアールその後、さらに効率的に背側終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性神経細胞に分化させることができる終脳前駆体にD。全体的に、我々のシステムは、これらのニューロンの開発とそれらに影響を与える疾患を研究する研究者のための人間のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するためのツールを提供しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（性IPSC）の両方を含む、ヒト多能性幹細胞（PSCの）、1-3ニューロンを含む体のあらゆる細胞の種類を生成する能力を持っている。人間のPSCからの様々な神経細胞サブタイプの監督の分化は、再生医療におけるこれらの細胞のアプリケーションのための鍵を握っている。開発中の機能的なニューロンのサブタイプの世代は、神経系統の誘導、rostro -尾軸に沿った地域の前駆体の仕様、および4,5地域の前駆細胞から有糸分裂後ニューロンタイプの分化を伴う複雑なプロセスである。 2001年以降、いくつかのシステムは、ニューロンのサブタイプ6,7の次の世代のためのプラットフォームを提供してきたヒトES細胞から神経系統を生成するために設立されました。発達の原理、そのような脊髄の運動ニューロン8-12、中脳DOPのようないくつかのニューロンタイプに基づいアミン作用性のニューロン13から15、および神経網膜細胞16,17を効率的に人間のPSCから指定されています。これは、 生体内で開発中にこれらのニューロンタイプの仕様のために重要である重要なモルフォゲンを適用することによって行われていた。他のプロトコルはまた、分化21を促進するためにこのような小さな分子として、または他の種類の細胞と共培養することにより、追加の要因18から20のいずれかを使用して、神経細胞にヒトES細胞の分化を促進するために開発されている。

人間の大脳新皮質は、高度に発達し、学習、記憶、認知機能22,23において重要な役割を果たしているグルタミン酸作動性ニューロンを含む多くの種類の細胞が含まれています。培養中のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための最初のステップは終脳前駆細胞を指定することです。芳樹さんのグループは、第一の無血清サスペンシオを使ってマウスのESC（​​mESCs）から終脳前駆体の分化を指示報告n個のDKK1の存在下で培養（Wntシグナル伝達を阻害する）、ならびにLeftyA（Nodalシグナル伝達を阻害する）24。その後、自験例を含め、いくつかのグループはまた、無血清培地中で25から27までの人間のPSCから終脳前駆体の仕様を報告している。人間のPSCから終脳前駆体の生成は、外因性のモルフォゲンの使用を必要としないと、これらの前駆体を生成するのに効率がmESCs 26,27からのそれよりはるかに高いです。ここでは、よくZhangさんのグループ7によって確立された神経誘導のために化学的に定義されたシステムが記載されている。外因caudalizing因子の添加なしで、このプロトコルは、効率的に人間のPSC 27日から終脳前駆体を生成します。これらの前駆細胞は、その後、Wntとソニックヘッジホッグ（Shh）のシグナル伝達を調節することにより、背や腹前駆細胞に分化させることができる。背前駆細胞はさらに、グルタミン酸作動性ニューロンに分化することができる電子fficiently 27。また、このプロトコルはまた、作用機序、ならびに疾患の大規模な配列のための潜在的な治療法を模索するために利用することができる患者固有ニューロンの生成を可能にする人間性IPSC 28日からのグルタミン酸作動性ニューロンの生成に適しています。また、我々のシステムはまた、終脳の多様なニューロンタイプの開発と仕様を探るためのプラットフォームを提供します。

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プロトコル

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1。ヒト多能性幹細胞凝集体の生成（D1〜D4）

  1. ヒト多能性幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ng / mlで）を補充したhESC媒体の存在下でマウス胚線維芽細胞（MEF）フィーダー上で培養される。文化の中で5から7日後、コロニーが大きいが、それでも未分化である場合、それらは、次のステップのための準備が整いました。
  2. 酵素液が最初に用意されるべきである。 50 mlチューブで、DMEM/F12培地に1 mg / mlの濃度でディスパーゼ（またはコラゲナーゼ）を溶かす。温めたときにこれらのソリューションは、最高のミックスなので、10〜15分間37℃の水浴中に培地と酵素を含むチューブを配置し、Steriflipフィルタを使用して、それを殺菌する。
  3. 細胞から培地を吸引、DMEM/F12でそれらをすすぎ、そして同様に、このオフを吸引除去する。ヒトES細胞のための3-5分（性IPSCの場合は最大10分）のためのインキュベーター内で各ウェル場所にディスパーゼの1ミリリットルを追加します。顕微鏡下で細胞を見て、時エッジが少し丸く/ビット暗くなり、細胞は次のステップのための準備が整いました。 3分後に細胞を確認し、必要な場合にそれらを戻すことが最善です。初めてこのプロトコルを使用する場合、それはできるだけ早くディスパーゼから細胞を除去することが重要であると同時に、細胞の1プレートのみで開始するのが最善です。
  4. 細胞からディスパーゼを吸引。穏やかに（細胞がこの段階では非常に脆弱であり、比較的容易に板から外れます）ディスパーゼを洗い流すために、各ウェルにDMEM/F12培地の1.5 mlを加える。 DMEM/F12を吸引し、各ウェルにhESCの培地1.5mlを加える。
  5. 細胞を剥離し、別れること、（垂直）の右下隅に向かって10mlガラスピペットの先端を配置ウェル（細胞に触れる）とピペットを上下に移動して - 上向きのストロークが近くになければなりません手続下向きストロークへ。井戸の反対側に到達すると、水平方向の悲惨で繰り返すction。
  6. セルの全てが懸濁状態にされたら、15 mlチューブに置き、2分間200 xgでそれらを遠心分離します。チューブの底部での細胞のペレットがあるはずです。ペレット上から培地を吸引。
  7. 凝集体を保つために利用されるべきである細胞培養フラスコの大きさは細胞の元の量に依存します。 hESCの培地50mlを活用すべきでhESCの6ウェル（1プレート）は、一つの非組織培養は、T75フラスコを治療した。ステップ1.6から37でフラスコとインキュベート℃にセルを転送
  8. 細胞の破片を取り除くためには、細胞培地、フラスコを約12時間後に交換する必要があります。これを行うには、（2分間200×g）で細胞をスピンダウンして、50 mlチューブに培地/細胞のすべてを置いて、古い培地を吸引。次に、新しいT75フラスコに細胞、場所に新鮮なhESCの培地50mlを加える。次いで、細胞を、これと同じ手順（5日まで）続く毎日供給することができます。

2。神経上皮細胞の誘導（D5-D17）

  1. 50mlチューブに細胞/培地を移し、200×gで2分間細胞を遠心分離する。次に、上清を吸引し、神経誘導培地（NIM）50mlでT75フラスコ新しい（処理非組織培養）にセルを転送します。
  2. 細胞はNIMに入ったら、培地の半分が一日おきに交換する必要があります。凝集体は、彼らが数分後に自分で50 mlコニカルチューブの底（ない遠心分離は必要ありません）に沈んでしまう場所に十分に大きくなるはずです。 NIM（D7-D8の合計）で2〜3日後、細胞をプレートに準備ができているはずです。ラミニンまたはウシ胎児血清（FBS）は、細胞がプレートに取り付けるために利用することができます。
  3. 各集合が他のものに触れることなく、いくつかのより多くの日をプレート上で増殖することができるはずとして必要とされている6ウェルプレートに扱わ組織培養の数は、細胞の密度に依存します。平均して、1からセルT75フラスコは細胞の価値は約4-6 6ウェルプレートをもたらすでしょう。
    1. ラミニンを使用している場合は、コート10〜20μg/ mlの6ウェルプレート（ウェル〜0.5ミリリットル/）にNIMでそれを希釈してください。 2〜3時間のためにコーティングした後、6ウェルプレート（ウェル当たり約20から30凝集体）上にプレート細胞凝集体。凝集体が取り付けられた後、NIMの1.5 mlを加える。
    2. FBSを使用している場合は、90％のNIMおよび10％FBS（1.5 ml /ウェル）の混合物を準備します。各ウェルに細胞と培地1.5mlを加え、穏やかに集計を広げるためにプレートを前後に振ると、細胞がインキュベーターにO / Nを添付することができます。 FBSを削除するには、次の朝培地（2 ml /ウェルNIMの）を変更してください。
  5. メッキであることの一日か二日後、各集合は単分子膜を形成するために広がるでしょう。数日以内に、これらの細胞のほとんどの中心は形態学的に円柱状の細胞（細長い）のように表示されます。この期間中、一日おきにNIMを変更します。いくつかのPSCライン（特別なLY IPSC）、あまり効率的柱状細胞を形成することができる。この問題が発生した場合、ステージ2の間のBMPおよびTGF阻害剤（2μMでDorsomorphin 29、SB431542 19）の添加が役立つことがあります。
  6. 日14から17の周りに、円柱状の細胞がよりコンパクトに表示されます。時には、これらの細胞は内部に見えるルーメンと尾根や環を形成する。円柱状の形態に加えて、この段階での細胞は、このようなPAX6とSOX1 12,26として神経上皮マーカーを発現する。
  7. 分離を開始する前に、1は最初に存在する任意の非神経上皮細胞があるかどうかを判断するために細胞を調べなければなりません。客観的マーカーは、非上皮コロニーを示すために利用することができます。これらは、その後ピペットチップでそれらを掻き落として除去することができます。

3。終脳前駆細胞の生成（D17-D24）

  1. コロニーの中心は神経上皮細胞が含まれており、植民地の他の部分から隔離されるべきである。これは、使用して行うことができますマイクロピペットと滅菌1mlをピペットチップを濾過した。圧力少量のコロニーの中心部に適用されると、それは一般的に極めて容易にオフに持ち上げる。コロニーの外側部分が同様に切り離すことができないように慎重になる。センターでは、頑固なされているし、自分で抜けない場合は、無菌フードで顕微鏡下で針を使用してそれらを切り出すことにより削除することができます。 2分間、200×gで15 mlのチューブとスピンにコロニーの中心部分を転送します。
  2. 培地を細胞から吸引されるべきである。 （ビタミン、1:50なし）B27の添加によりNIMの10ミリリットルを含むT25フラスコを処理した細胞の価値がある二つのプレートは、その後、非組織培養に転送することができます。細胞の1プレート当たり培地の5〜10 mlを使用します。
  3. 細胞は翌日見たときに、彼らは外見のような球を持っている必要があります。それはしばしば末梢細胞であるとして、それは新しいフラスコ（NIMとB27の存在下で、午前1時50分）に、これらの細胞を移すことが必要であるでこっそりとフラスコの底に付着している。
  4. ニューロスフィアは、その後B27（1:50）を補っNIMを使用して一週間の浮遊培養しなければならない。セルの耐久性を促進し、増殖、サイクリックAMP（cAMP、1μM）と同様にインスリン成長因子（IGF-1、10 ng / ml）をするために、懸濁培養中の培地に添加することができる。この時点では、ニューロスフィアは、終脳前駆細胞が含まれている（FOXG1 +）と最終分化のためにカバースリップ上に播種する準備が整いました。

4。終脳のニューロン（D25 +）にさらに分化

    1. 細胞をメッキするpoly-ornithine/lamininコーティングされたカバーガラス（24ウェルプレート中）を用意します。カバーガラスを最初にクリーニングされ、その後、策略-オルニチン（0.1 mg / mlの、37℃、O / N、および冷凍庫に保存されている）でコーティングされています。
      ポリオルニチンコーティング：
      1. カバースリップを滅菌：のカバーガラスを置き硝酸の入ったビーカー、優しく1時間ドラフト内で振る。 、硝酸を注ぐDI水で数回すすぎ、少なくとも15分間のDI流水でカバースリップのままにしておきます。 95％エタノールでカバーガラスを置き、どちらのRTで30分間（直ちに使用している場合）またはエタノールの店のために振る。
      2. 無菌フードでは、6ウェルプレートのふたに滅菌カバースリップを含む50 mlチューブの中身を注ぐ。滅菌ピンセットを用いて、一度に1つのカバーグラスをピックアップし、24ウェルプレートの1ウェル内に立設。各ウェルにカバースリップを持つように繰り返します。
      3. カバースリップは各ウェルでフラット落ちているまで、彼らが完全に乾いた後、プレートをタップします。次の各カバースリップにポリオルニチンμlの100を（滅菌のdH 2 Oで0.1 mg / ml）を追加し、37℃でプレートO / Nをインキュベート℃に
      4. 翌日、インキュベーターからプレートを取り外し、それらを室温まで冷まします。 （tの端から各カバースリップのオフポリオルニチンアスピレート彼カバースリップ）は、プロセス内のカバーガラスに触れたり、傷を付けないことを確認して。カバーガラスは、洗濯前に約30分間乾燥させます。
      5. 各ウェルに1 mlの滅菌dH 2 Oを追加し、10分間放置し、各ウェルから水を吸引。この洗浄工程を2回繰り返します。プレートが完全に乾燥した後、（休業はフードでオフカバー）アルミホイルで覆い、上にふたを置き、-20℃で保存する
      1. ラミニンでコートしたカバーガラスをして、唯一のカバースリップ自体を（触れる液体を持つように注意しながら、各ポリオルニチン扱わカバースリップに神経分化培地およびラミニン（20μg/ mlの最終濃度）の混合物50μlを加えるとこぼしていないオフ）。添付ファイル用の細胞を準備する前に1〜2時間37℃でそれらをインキュベートする。
  2. 15mlチューブで2分間200 xgでニューロスフィアを収集し、遠心分離する。上清を吸引。
    1. DMEM-F12で細胞を洗浄し、再び細胞を遠心分離する。ニューロスが正しくアタッチするには大きすぎる場合は、この段階でAccutaseと解離させることができる。
    2. Accutaseを使用する場合と：DMEM-F12で細胞を洗浄した後、ニューロスフェアはAccutase（約2ミリリットル）を加え、3分間37℃で細胞をインキュベートすることにより、小さなクラスターに解離する。次に、トリプシンインヒビター（〜2ミリリットル）の同量を追加し、3分間200 xgで細胞を遠心分離します。次いで、細胞を、NDMに再懸濁し、P200のピペットを用いて分割する必要があります。小さなクラスターは、その後、予め被覆カバーガラス上にめっきすることができる。
  4. 媒体の大半を吸引し、それらを選択すると、より簡単になるように培地に数滴6cmのシャーレ上にセルを配置する。各プレコーティングされたカバースリップに約4-5ニューロスフェアを追加します。第一ラミニンを吸引する必要はありません。
  5. ニューロスフィアは、少なくとも2〜4時間のために添付しましょう​​。かつて彼らは持っているよくttached、もっと培地（0.5ミリリットル/カバースリップ）を追加する必要があります。それは、神経B27（1:50）を補充した分化培地は、cAMP（1μM）、および神経栄養因子（BDNF、GDNF、およびIGF、すべてのng / mlで10℃）で構成する必要があります。この時点で、培地の半分は一日おきに変更することができ、これらの細胞は数ヶ月の間維持することができる。

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結果

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ここでは、いくつかの重要な工程を経て終グルタミン酸作動性ニューロンへの人間のPSCを区別するために、プロトコル：終脳のニューロンへのPSC凝集体の形成、神経上皮細胞の誘導、終脳前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞の最終分化（ 図1）があります記載されて。このシステムは、終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性ニューロンの生成に堅牢かつ効率的です。例（ 図2）として、caudalizing因子を添加することなく、ヒトES細胞は、神経系統27に分化させた。 24日後の分化では、神経前駆細胞の大半はFOXG1（終脳によって発現する転写因子）が陽性であったが、HOXB4に負（後脳と脊髄細胞のマーカー）終脳前駆細胞を示唆して成功した（ 図2D）を生成した。これらの前駆細胞は終脳の電話 PAX6（背前駆細胞によって発現されるマーカー）（ 図2E）ではなく、NKX2.1（腹前駆細胞のマーカー）（ 図2F）の発現によって示されるように、背の表現型をossess。さらなる...

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ディスカッション

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神経分化プロセスの間に、いくつかの重要なステップがあります。そうでなければ細胞はすでに非神経系統になってきに偏っている可能性があるため、人間のPSCが多能性であることを確認することが重要です。これは、あるOct4、Sox2は、Nanog遺伝子、及びTRA-1-60 1から3のように多能性マーカーに対する抗体を用いた人間のPSCを染色することによって確認することができます。人間のPSCは、それらを継代した後、非常によく結合しなかった場合、ROCK阻害剤（Y27632）を助けるために添加することができる。その細胞の多能性を維持が困難な人のために、いくつかの潜在的な問題は、品質/密度MEF細胞のと同様に、バッチ毎に変動があり得るとして使用されてKOSRがたくさんあり​​ます。 MEFフィーダー細胞は、上記のプロトコルでのPSCを維持するために使用されてきたが、この方法はまた、フィーダーフリーシステムを使用して培養するPSCのために動作します。

細胞はPSCの凝集体を形成する分割されているとき、それはLIMに重要であるそれはほんの数分へのディスパーゼ露出（エッジは切り...

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開示事項

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が惜しみなくFOXG1抗体を提供するための博士Y.笹井に感謝したいと思います。この作品は、コネチカット幹細胞研究助成金（08-SCB-UCHC- 022と11-SCB24）と痙性対麻痺財団によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
F12栄養混合物(DMEM / F12)を含むダルベッコの修飾イーグル培地Gibco11330-032
ノックアウト血清代替品Gibco10828-028
L-グルタミン(200 mM)Gibco25030
必須アミノ酸Gibco1140-050
2-Mercapt–タノール (14.3 M)SigmaM-7522
神経基礎培地Gibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
ヘパリンΣH3149
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩 (ポリオルニチン)Σ116K5103
ラミニン (ヒト)SigmaL-6274
Laminin (mouse)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
ウシ血清アルブミン(BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagenaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative CellテクノロジーAT104
ROCK 阻害剤ステムジェント04-0012
SB431542ステムジェント04-0010
ドルソモルフィンステムジェント04-0024
線維芽細胞成長因子 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
トリプシン阻害剤ギブコ17075
0.1% ゼラチンMilliporeES-006-B
Foxg1 抗体Dr. Y. Sasai
Hoxb4 抗体 (1:50)Developmental Studies Hybridoma BankI12
Pax6 抗体 (1:5000)Developmental Studies Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 抗体 (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 抗体 (1:2000)ChemiconAB9616
vGLUT1抗体 (1:100)Synaptic Systems135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)株式会社プレポテック450-02
グリア由来神経栄養因子(GDNF)プレポテック株式会社450-10
インスリン成長因子1(IGF1)株式会社プレポテック100-11
サイクリックAMP (cAMP)SigmaD-0260
ソニックヘッジホッグ (SHH)R&D1845-SH
50 ml チューブベクトン ディキンソン (BD)352098
15 ml チューブBD352097
6 ウェルプレートBD353046
24 ウェルプレートBD353047
T25 フラスコ (未処理)BD353009
T75 フラスコ (未処理)BD353133
カバースリップChemiglassライフサイエンス1760-012
6 cmシャーレBD353004
9インチガラスピペットッシャー13-678-20D
Steriflipフィルター(0.22 μM)ミリポアSCGP00525
ステリカップフィルター 1,000 ml (0.22 μM)ミリポアSCGPU10RE
位相差顕微鏡(オブザーバーA1)ツァイスR2625
二酸化炭素インキュベーター(Hera Cell 150)サーモエレクトロンコーポレーション
バイオセーフティフード(Sterilgard III Advance)ベーカーカンパニー
遠心分離機(5702 R)エッペンドルフ
非フィ

参考文献

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