マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

サマリー

統合されたマイクロ流体チップは、熱可塑性の分子診断として使用するために開発されました。チップは、核酸抽出、逆転写酵素、およびPCRを行います。チップを製造して実行するための方法が記載されている。

要約

迅速かつ効果的な診断は、効果的な患者の管理と治療を可能にすることによって、感染症の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液中のインフルエンザウイルスを増幅する機能を持つ統合されたマイクロ流体チップの熱可塑性を提示する。患者サンプルのロード時に、マイクロ流体デバイスは、順次、オンチップ細胞溶解、RNA精製および固相抽出（SPE）、逆転写（RT）とRT-PCRチャンバー内のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）内の濃縮工程を実施それぞれ。終点検出は、オフチップバイオアナライザー（Agilent Technologies社、サンタクララ、CA）を使用して実行されます。 2薄膜ヒータは、RTおよびPCRチャンバー用の熱源として使用されていましたが周辺機器のために、私たちは、試薬やサンプルを駆動するために、単一のシリンジポンプを使用していました。チップはfabricatiを低減するために、高スループット製造のために、単層と適当になるように設計され時間とコストで。マイクロ流体チップは、関心のある新しい病原体を検出するために必要な試薬の設計変更によってのみ制限されるウイルスや細菌の多種多様な、分析するためのプラットフォームを提供します。

概要

数百万人の死者は、20世紀¹の3つのインフルエンザのパンデミックの間に報告されている。また、最新のインフルエンザの大流行は2009年に世界保健機関^（WHO）2によって宣言された、とのように2010年8月1日の、18449人の死亡がWHOの³によって報告されました。このパンデミックは再び感染症の高負荷、高速疾患の確認、適切な公衆衛生対応と効果的な治療^4を有効にするに^は 、インフルエンザの迅速かつ正確な検出のための必要性を示した。

広くインフルエンザを診断するために使用されるいくつかの方法があり、これらは急速イムノアッセイ、直接蛍光抗原検査（DFA）とウイルス培養方法を挙げることができる。他の2つの方法は労働集約的で時間⁹消費している間に急速なイムノアッセイは劇的に、感度^5-8を欠いている。分子テストは高いsensit、短いターンアラウンド時間を含む複数の利点を提供ivity、高い特異性。いくつかの商業団体は、感染症のための速い分子テスト（とも呼ばれる核酸テストやNAT）に向かって取り組んできており、いくつかは彼らのパイプラインでインフルエンザアッセイを持っています。しかしそれらのほとんどは、オフチップのサンプル調製を必要とします。分子テストはアッセイ用カートリッジまたはモジュールに試料調製を組み込む放棄臨床検査改善修正法（CLIA）のなし。

ラボオンチップ技術は、ポイント·オブ·ケア検査装置の開発に重要な役割を果たしている。 1993年¹⁰における第1のPCRチップの導入後、数々の努力が核酸テストチップの開発に置かれている。しかし、これらは数が限られて下流の増幅を伴う原油試料調製を統合した。

我々は以前プラスチックマイクロ流体チップ¹¹に固相抽出カラム（SPE）の小型化を実証し、開発しました連続した流れのPCRチップ¹²のリーメントと最適化。ここでは、臨床診断のための単一のチップにRTおよびPCR手順でSPEを統合し、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液から核酸を増幅するために、その能力を実証するために前作を拡張します。

プロトコル

1。チップ製造¹²

1. ゼオネックス690Rペレットから2プラークを作る：5分間198℃で加熱したプレスで金属板、予熱の中心に均等に8〜9グラムゼオネックスペレットを配布し、その後、別の5分間2500 psiに徐々に圧力をかける。この手順を完了するために、我々はカーバーホットプレスを使用していました。
2. エポキシモールドとプラーク中の微小流体チャネルをエンボス。金型製作についての詳細は、別の場所で^12（ 図2bのチャネル設計）で概説されています：エポキシモールドに1歯垢を入れ、次に157で加熱プレスで予熱それら℃で10分間とは別の10分間ゆっくりで1,000 psiに圧力をかける。手で型から歯垢を除去するか、またはそれが冷える前にトングを使用しています。 （ 注：このステップの間に熱手袋を着用してください。）
3. エンボス加工された入口のチップ、廃棄ポート、および微小流体流路の出口に穴を開けます。私たちは、1.25ミリメートルの直径を使用三つの穴を作るためにドリルビットをeter。
4. ボンド別のプラーク（一番上）をエンボス加工チップは：;もう、350 psiで押した後、10分間131℃で加熱したプレスで空気乾燥、予熱それらをとIPA、RNアーゼアウェイ、シーケンス内の脱イオン水を用いてチップを洗う10分。
5. 入口、廃棄物、別にJBウェルドエポキシを使用して出口ポートでNanoportsを取り付け、メーカーの指示に従って15から24時間で硬化。
6. 100μlのヌクレアーゼフリー水で続くアウェイ50μlのRNaseを使用するSPEのチャネルを、すすいでください。
7. 接ぎ木溶液（3％（w / v）のベンゾフェノンとメチルメタクリレート）の4μlのSPEチャンネルをロードし、次に365nmのUV波長および2000 mJ / cm ^2以下でUVオーブンで10分間インキュベートすることにより、メチルメタクリレートを架橋。真空の残留移植溶液を除去します。私たちは壁の真空を使用していました。最良の結果を得るには、新鮮な溶液を使用する必要があります。それは、保存するために、しかし、通常許容され最大一週間、4℃で調製した溶液。
8. SPEカラム液（すべてのv / v％）で作る：16％エチレンジメタクリレート、24％ブチルメタクリレート、42％1 - ドデカノール、18％のシクロヘキサノール、1％2 - ジメチルアミノ-4 - （メチルアミノ） - フェノール追加光開始剤として。
9. SPEカラム溶液（1:1混合物を作るために）としてシリカ微小液の同じボリュームを取り出し、完全に真空オーブン中で70℃で一晩でそれを乾燥させてください。蓋を閉じた状態でチューブをタップすることで、ペレットを破る。混ぜて乾燥させたシリカ微小球管と渦にSPEカラム溶液を加える。
10. 同じチャンネルに、SPE溶液4μlをロードしてから、2.5分間UV照射によってそれを架橋する。次に、上にチップを反転し、さらに2.5分間照射します。重合SPEカラムは不透明な白色の固体でなければならない。
11. 過剰反応物質を洗い流すために100％メタノール500μlのチャンネルを洗う。この洗浄はまたイントラポリマーpoを削除rogenic溶剤、周囲条件で乾燥したときに、それによってSPEカラムの開いた細孔構造を作成する。
12. 熱伝導テープでチップの底に2つの薄膜ヒーターを取り付けます。ヒーターの側面は別々に変性とアニーリングのための広いチャネル（ 図1を参照）のエッジに位置合わせする必要があります。
13. 死者を介してチップに5箇所の熱電対（ 図2bを参照）、各チップの開放側チャネルを終了しました。熱電対は、プレスフィットを介してこれらのチャネルでご利用いただけます。テープは、さらに熱電対の位置を固定するために使用された。

2。固相抽出法

1. DEPC処理及びオートクレーブ処理水（脱イオン水またはミリポア濾過された）での70％エタノールを96μlを準備します。
2. 1チューブ内での70％エタノールを96μlにセキュア25X RNAの4μlを追加し、別々のチューブに100％エタノールで同じ混合物を複製します。
3. 300を準備以下を混合することにより、チャンネルバッファの液：6 Mグアニジンチオシアネート（GuSCN）75μlの、2 - プロパノール、ヌクレアーゼフリー水63μL、およびSecure 25X RNAを12μlの150μlの。
4. 6 M GuSCN、2 - プロパノールを200μl、12μlの25X RNAを100μlの安全性：混合による溶解緩衝液312μlを準備します。
5. RNAのセキュアをアクティブにするには10〜20分間60℃での70％エタノールを加熱し、100％エタノール、チャネルバッファと溶解バッファー。
6. マイクロ流体チャネルを平衡状態にし、0.8ミリリットル/ hrの流量で、SPEチャネルを通してチャネル·バッファを実行します。
7. 水浴中で37℃でVTMでテストサンプルを迅速に融解し、できるだけ早く、それが解凍されると水槽から直ちに試料を取り出す。
8. 10分間、13,000 rpmで遠心し、溶解緩衝液300μlに100μlの上清を移す。 1μg/μLのキャリアRNAの6μlを添加して混合物を完了します。
9. ミックスする渦、とのスピンの後5秒は、ルアーロック1ccのシリンジに全体ライセートをロードします。
10. 0.8ミリリットル/ hrの流量で、SPEチャネルを通じてライセートを実行します。
11. 1ミリリットル/ hrで100μlのof100％エタノールに続く70％エタノール100μlのSPEのチャネルを、洗ってください。 （押し出されないでしょうシリンジ先端で50μlのデッドボリュームがありますので、実際には50μlのは、チャネルを通過している。）
12. 0.5 mlのマークに空の注射器を置き、1ミリリットル/ hrでそれを乾燥させるためにチャネルを介して空気を押してください。
13. 0.5ミリリットル/ hrで結合した核酸を溶出させ、廃港でnanoportから13.5μlを収集するためにチャネルを介しヌクレアーゼフリー水67.5μlを実行します。 （流体損失はシリンジの先端およびSPEチャネルで54μlのデッドボリュームによるものです。）

3。 RT-PCR法

1. キアゲンワンステップRT-PCRキットの試薬を用いて、空気乾燥工程（2.12）の間に、RT-PCRマスターミックスを36.5μlを準備します。
2. RT-PCをロードRは廃港でnanoportの試薬、およびRNAと混合以下50μlのRT-PCR反応を得るために：ヌクレアーゼフリー水、4μlを、RT-PCR酵素ミックスを、10μlのQの溶液、10μl1X1で13.5μlの溶出したRNAをステップバッファー、2μlの25 mMのMgCl _2、1μlの50μMのフォワードプライマー5'-GAC CRA TCCは、TGT CACは、CTCのTGA C-3 '、1μlの50μMのリバースプライマー5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 '、2μlのdNTPを、0.75μlの1.0パーセントw / vのBSA、0.73μlのPEG8000と5.02μlのヌクレアーゼフリー水。
3. 穏やかな真空によってRTのチャネル（私たちは壁の真空を使用）に、RT-PCR混合物をロードして、閉じたフィッティングとNanoportを封印。
4. ヒーター1から35 Vを印加します。ヒーター1は50℃で平衡化した後に30分間、RTチャネル内の試薬を保つ95℃でヒータ1平衡後15分℃の室温チャネル内の試薬を保つ
5. ヒーター1、ヒーター2から50 Vまで27 Vを印加し、60＆ドで約3分またはヒータ1平衡化するまでの待ちgであり、Cとヒーター95℃2℃の平衡
6. 0.5μl/分でPCRチャンネルに試薬を押し込みます。試薬が蛇行流路を通って流れることは約20分を取る必要があります。
7. サンプルが蛇行流路の端に表示されるようになるように、適切な大きさのピペットチップを使用して出口でPCR産物を収集します。

4。 PCR産物検出

1. 我々は製品を検出するために、Agilentの高感度DNAテストを使用しています。このテストを実行するには、テストの前に冷蔵庫で30分からAgilent高感度DNAキットを取り出します。
2. バイオアナライザの電源をオンにして、2100エキスパートソフトウェアを開きます。
3. テスト版（testing）へのPCR産物1μlをロードおよびAgilentプロトコル（フォローhttp://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent％の20Manual.pdfを ）。
4. データを分析し、記録します。

結果

典型的な結果は、インフルエンザに感染した鼻咽頭洗浄液検体については、 図3に示されている。各患者検体中のインフルエンザウイルスの量が異なるために、PCR産物の最終濃度は異なります。良い結果は、低ノイズ、2つの明確なラダーのピーク（35〜10380 bp）と正のサンプル用に設計された製品のサイズで単一の生成物のピーク（107 bp）を持っている必要があります。生成物のピークは理論的にはネガティブコントロールのために不在でなければなりませんが、我々はいくつかのサンプルでプライマーダイマーの形成からインフルエンザ特有の遺伝子座に近いスプリアスPCRのピークを観察した。複数の製品のピークは試験の汚染の可能性を反映している。この問題が発生した場合は、サンプルの別のアリコートを再テストする必要があります。ゲル電気泳動は、テスト結果¹³の更なる検証のために使用することができます。

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ディスカッション

診断方法は、高い特異性と低い検出限界を持つ患者検体からインフルエンザRNAを増幅するための統合されたマイクロ流体プラスチックチップの能力を実証してここで紹介する¹³我々は、ケア検査の潜在的な点については、このチップを設計した：（a）温度と流体制御が簡素化された、（b）のチップは、低コストおよび射出成形を用いた高スループットの製造に適しており、（c）のチップは、このように、試料のクロスコンタミネーションの心配を減らし、使い捨てと1回の使用のために意図されている。

3時間の私達の現在のオンチップ·ランタイムが、我々の抽出プラットフォームは、プロセスの最適化の余地が含まれています。例えば、右の溶出前に洗浄及び乾燥時間は、流量を増加させ、洗浄量削減の組み合わせによって減少させることができた。また、コストはチップ製造プロセスを合理化し、高価なまたは厄介な周囲を置き換えることにより、トリミングすることができるそのような使い捨てのシリンジ輸液ポンプと固相抽出カラムのジオメトリと多孔性を拓く小型バッテリーパックのような選択肢があることをシリンジポンプ、電源、などpheral...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号
1 - ドデカノール	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	443816-500G
2,2 - ジメトキシ-2 - フェニルアセトフェノン	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	196118-50G
2100バイオアナライザ	Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ	G2943CA
2 - プロパノール	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	19516
ベンゾフェノン	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	239852-50G
BSA	サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア	A7979-50ML
メタクリル酸ブチル	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	235865-100 ml
キャリアRNA	キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州	1017647
シクロヘキサノール	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	105899-1L
エタノール	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	E7023
エチレンジメタクリレート	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	335861
エチレングリコールジメタクリレート	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	335681-100ML
ガラスシリンジを250μl	ハミルトン、リノ、ネバダ州	81127
チオシアン酸グアニジン	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	50981
高感度DNAキット	Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ	5067-4626
ホットプレス	カーバー、ウォバシュ、IN	4386
JBウェルドエポキシ	マクマスター-Caのrrは、エルムハースト、イリノイ州	7605A11
ルアーロックシリンジ	BD-医療、フランクリンレイクス、ニュージャージー州	309628
塩化マグネシウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア	AB-0359
メタノール	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	494437
メタクリル酸メチル	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	M55909
Nanoport	アップチャーチ·サイエンティフィック	N-333から01
Nanoportフィッティング	アップチャーチ·サイエンティフィック	F-120倍
ヌクレアーゼフリー水	サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア	PR-P1193
ワンステップRT-PCRキット	キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州	210210
PEG8000	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	41009
パワーサプライ	VWR、ラドナー、ペンシルバニア	300V
アウェイリボヌクレアーゼ	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州	83931-250ML
RNASecure	アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州	AM7005
シリカ微小球	Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア	24324から15
注射器ポンプ	ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州	HA2000P/10
熱伝導性テープ	マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州	6838A11
熱電対	オメガエンジニアリング、スタンフォード、コネチカット	5SRTC-TT-J-40から36
薄膜ヒーター	Minco、ミネソタ州ミネアポリス	HK5166R529L12A
紫外線架橋剤	UPV、アップランド、カリフォルニア州	CL-1000
ゼオネックス	ゼオンケミカルズ、ルイビル、ケンタッキー州	690R