統合されたマイクロ流体チップは、熱可塑性の分子診断として使用するために開発されました。チップは、核酸抽出、逆転写酵素、およびPCRを行います。チップを製造して実行するための方法が記載されている。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
迅速かつ効果的な診断は、効果的な患者の管理と治療を可能にすることによって、感染症の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液中のインフルエンザウイルスを増幅する機能を持つ統合されたマイクロ流体チップの熱可塑性を提示する。患者サンプルのロード時に、マイクロ流体デバイスは、順次、オンチップ細胞溶解、RNA精製および固相抽出（SPE）、逆転写（RT）とRT-PCRチャンバー内のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）内の濃縮工程を実施それぞれ。終点検出は、オフチップバイオアナライザー（Agilent Technologies社、サンタクララ、CA）を使用して実行されます。 2薄膜ヒータは、RTおよびPCRチャンバー用の熱源として使用されていましたが周辺機器のために、私たちは、試薬やサンプルを駆動するために、単一のシリンジポンプを使用していました。チップはfabricatiを低減するために、高スループット製造のために、単層と適当になるように設計され時間とコストで。マイクロ流体チップは、関心のある新しい病原体を検出するために必要な試薬の設計変更によってのみ制限されるウイルスや細菌の多種多様な、分析するためのプラットフォームを提供します。
概要
数百万人の死者は、20世紀1の3つのインフルエンザのパンデミックの間に報告されている。また、最新のインフルエンザの大流行は2009年に世界保健機関（WHO）2によって宣言された、とのように2010年8月1日の、18449人の死亡がWHOの3によって報告されました。このパンデミックは再び感染症の高負荷、高速疾患の確認、適切な公衆衛生対応と効果的な治療4を有効にするには 、インフルエンザの迅速かつ正確な検出のための必要性を示した。
広くインフルエンザを診断するために使用されるいくつかの方法があり、これらは急速イムノアッセイ、直接蛍光抗原検査（DFA）とウイルス培養方法を挙げることができる。他の2つの方法は労働集約的で時間9消費している間に急速なイムノアッセイは劇的に、感度5-8を欠いている。分子テストは高いsensit、短いターンアラウンド時間を含む複数の利点を提供ivity、高い特異性。いくつかの商業団体は、感染症のための速い分子テスト（とも呼ばれる核酸テストやNAT）に向かって取り組んできており、いくつかは彼らのパイプラインでインフルエンザアッセイを持っています。しかしそれらのほとんどは、オフチップのサンプル調製を必要とします。分子テストはアッセイ用カートリッジまたはモジュールに試料調製を組み込む放棄臨床検査改善修正法（CL....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1。チップ製造12
- ゼオネックス690Rペレットから2プラークを作る：5分間198℃で加熱したプレスで金属板、予熱の中心に均等に8〜9グラムゼオネックスペレットを配布し、その後、別の5分間2500 psiに徐々に圧力をかける。この手順を完了するために、我々はカーバーホットプレスを使用していました。
- エポキシモールドとプラーク中の微小流体チャネルをエンボス。金型製作についての詳細は、別の場所で12（ 図2bのチャネル設計）で概説されています：エポキシモールドに1歯垢を入れ、次に157で加熱プレスで予熱それら℃で10分間とは別の10分間ゆっくりで1,000 psiに圧力をかける。手で型から歯垢を除去するか、またはそれが冷える前にトングを使用しています。 （ 注：このステップの間に熱手袋を着用してください。）
- エンボス加工された入口のチップ、廃棄ポート、および微小流体流路の出口に穴を開けます。私たちは、1.25ミリメートルの直径を使用三つの穴を作るためにドリルビットをeter。
- ボンド別のプラーク（一番上）をエンボス加工チップは：;もう、350 psiで押した後、10分間131℃で加熱したプレスで空気乾燥、予熱それらをとIPA、RNアーゼアウェイ、シーケンス内の脱イオン水を用いてチップを洗う10分。
- 入口、廃棄物、別にJBウェルドエポ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
典型的な結果は、インフルエンザに感染した鼻咽頭洗浄液検体については、 図3に示されている。各患者検体中のインフルエンザウイルスの量が異なるために、PCR産物の最終濃度は異なります。良い結果は、低ノイズ、2つの明確なラダーのピーク（35〜10380 bp）と正のサンプル用に設計された製品のサイズで単一の生成物のピーク（107 bp）を持っている必要があります。生成物のピークは理論的にはネガティブコントロールのために不在でなければなりませんが、我々はいくつかのサンプルでプライマーダイマーの形成からインフルエンザ特有の遺伝子座に近いスプリアスPCRのピークを観察した。複数の製品のピークは試験の汚染の可能性を反映している。この問題が発生した場合は、サンプルの別のアリコートを再テストする必要があります。ゲル電気泳動は、テスト結果13の更なる検証のために使用することができます。
の "のfo：SRC =" / files/ftp_u.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
診断方法は、高い特異性と低い検出限界を持つ患者検体からインフルエンザRNAを増幅するための統合されたマイクロ流体プラスチックチップの能力を実証してここで紹介する13我々は、ケア検査の潜在的な点については、このチップを設計した：（a）温度と流体制御が簡素化された、（b）のチップは、低コストおよび射出成形を用いた高スループットの製造に適しており、（c）のチップは、このように、試料のクロスコンタミネーションの心配を減らし、使い捨てと1回の使用のために意図されている。
3時間の私達の現在のオンチップ·ランタイムが、我々の抽出プラットフォームは、プロセスの最適化の余地が含まれています。例えば、右の溶出前に洗浄及び乾燥時間は、流量を増加させ、洗浄量削減の組み合わせによって減少させることができた。また、コストはチップ製造プロセスを合理化し、高価なまたは厄介な周囲を置き換えることにより、トリミングすることができるそのような使い捨てのシリンジ輸液ポンプと固相抽出カラムのジオメトリと多孔性を拓く小型バッテリーパックのような選択肢があることをシリンジポンプ、電源、などpheral.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは競合する経済的利益を宣言していない。
謝辞
この研究は、米国立衛生研究所（NIH）助成金R01 EB008268によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/材料の名称 | 会社 | カタログ番号 | |
| 1 - ドデカノール | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 443816-500G | |
| 2,2 - ジメトキシ-2 - フェニルアセトフェノン | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 196118-50G | |
| 2100バイオアナライザ | Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ | G2943CA | |
| 2 - プロパノール | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 19516 | |
| ベンゾフェノン | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 239852-50G | |
| BSA | サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア | A7979-50ML | |
| メタクリル酸ブチル | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 235865-100 ml | |
| キャリアRNA | キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州 | 1017647 | |
| シクロヘキサノール | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 105899-1L | |
| エタノール | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | E7023 | |
| エチレンジメタクリレート | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 335861 | |
| エチレングリコールジメタクリレート | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 335681-100ML | |
| ガラスシリンジを250μl | ハミルトン、リノ、ネバダ州 | 81127 | |
| チオシアン酸グアニジン | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 50981 | |
| 高感度DNAキット | Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ | 5067-4626 | |
| ホットプレス | カーバー、ウォバシュ、IN | 4386 | |
| JBウェルドエポキシ | マクマスター-Caのrrは、エルムハースト、イリノイ州 | 7605A11 | |
| ルアーロックシリンジ | BD-医療、フランクリンレイクス、ニュージャージー州 | 309628 | |
| 塩化マグネシウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア | AB-0359 | |
| メタノール | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 494437 | |
| メタクリル酸メチル | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | M55909 | |
| Nanoport | アップチャーチ·サイエンティフィック | N-333から01 | |
| Nanoportフィッティング | アップチャーチ·サイエンティフィック | F-120倍 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア | PR-P1193 | |
| ワンステップRT-PCRキット | キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州 | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 41009 | |
| パワーサプライ | VWR、ラドナー、ペンシルバニア | 300V | |
| アウェイリボヌクレアーゼ | Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州 | 83931-250ML | |
| RNASecure | アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州 | AM7005 | |
| シリカ微小球 | Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア | 24324から15 | |
| 注射器ポンプ | ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州 | HA2000P/10 | |
| 熱伝導性テープ | マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州 | 6838A11 | |
| 熱電対 | オメガエンジニアリング、スタンフォード、コネチカット | 5SRTC-TT-J-40から36 | |
| 薄膜ヒーター | Minco、ミネソタ州ミネアポリス | HK5166R529L12A | |
| 紫外線架橋剤 | UPV、アップランド、カリフォルニア州 | CL-1000 | |
| ゼオネックス | ゼオンケミカルズ、ルイビル、ケンタッキー州 | 690R |
参考文献
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
