人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

サマリー

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

要約

皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経^1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発³の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。

現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡^4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子^5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3Dイメージングは​​さらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。

概要

現在のところ、それは小さなファイバ神経障害^{、3つ6-8を}診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘⁹ 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー^10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡⁶ PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学^7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは^）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリア....

プロトコル

パート：免疫組織化学

バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように^8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クライオスタットに厚さ50μmのセクションに区分に埋め込まれ、最大1週間のために4で20％グリセロール°Cとリン酸緩衝食塩水（PBS）で凍結保護されています。以下に説明するプロトコルは、8皮膚切片ワン96ウェルプレートに浮遊免疫組織化学を受けることが可能な皮膚切片の最大数に設計されている。

1日目：

1。角質層非特異免疫反応の防止

1. ラベル96ウェルプレート、 図1に示すように。
2. 画像-IT 96ウェルプレートの1行目の各ウェルにバックグラウンド染色^11,12を遮断するための効果的なFX信号（画像-IT）、150μlのを追加します。
3. 96ウェルプレートの2行目と3で各ウェルに1×PBSを150μlを加える。
4. DLで撮影生から1セクション、PTで取ら生から1セクショ....

結果

私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を持つ66歳の男性、2型糖尿病（：;疼痛スコア108ヶ月47期間）の。定量的な官能試験及び神経伝導研究を含む神経学的検査履歴とは、末梢神経障害を評価するために実施した。疼痛スコアは、0〜100のビジュアルアナログ痛みのスケールに基づいて決定した。

このプロトコルを使用して、我々は、ヒトの皮膚におけるIENFs（ 図2）の3次元構造を研究することができる。 図2の、PGP陽性IENFsは緑色信号によって同定された、とTrkの陽性IENFsは赤信号で標識した。すべてTrkはA陽性IENFsはPGPにもプ.......

ディスカッション

IENFDの測定は広く末梢神経障害^13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN ¹⁵の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。

我々は以前侵害IENFD数の増加は、DB / dbマウスにおける疼痛行動、2型糖尿病⁵のマウスモデルに関連付けられていることを報告した。そのレポートでは、まず侵害IENFを研究するための二重免疫蛍光プロトコルを適用した。現在の研究では、PNの患者から、ヒトの皮膚への我々のプロトコルを展開します。二重免疫蛍光分析は、仲介IENFsのサブセットで、合計IENF及び侵害IENF両方の測定値を提供します痛み。これらの侵害IENFはTrkのAや他の侵害受容神経ペプチド⁵のために主に陽性である。痛みを伴う神経障害のために類似した二重免疫蛍光分析はラウリアら^.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 ロバ &-ウサギ	Invitrogen	A21206	AF488 ロバ &-ヤギ
Alexa Fluor 647 ロバ &-ヤギ	Invitrogen	A21447	AF647 ロバ &-ヤギ
アルブミン、ウシ血清	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
未校正ループ	LeLoop	MP 199025	接種ループ
96ウェルアッセイプレート	コーニングインコーポレイテッド	3603	ウェルプレート
Prolong Gold 退色防止試薬 DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
顕微鏡カバーガラス 22x22 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-541-B	カバースリップ
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド	フィッシャー科学	12-550-15	顕微鏡スライド
オリンパス Fluoview レーザー走査型共焦点顕微鏡	オリンパス	FV500	共焦点顕微鏡
最適切断温度	さくら	4583	OCT
ライカ クライオスタット	ライカ	CM1850	クライオスタット