方法論記事

光音響膀胱造影

DOI：

10.3791/50340

⸱

2013年6月11日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo, The State University of New York, 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH) , 3School of Electrical Engineering and Computer Science, Kyungpook National University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光音響膀胱造影（PAC）は、任意の電離放射線や有毒な造影剤を使用せずに膀胱、小児患者における放射線感受性の臓器を、マップする大きな可能性を秘めている。ここでは、ラットの光不透明なトレーサーの注射で膀胱をマッピングするためにPACを使用する方法を示す。

要約

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放射線不透過性の染料を用いて診断用X線に基づいている従来の小児膀胱造影は、有害な電離放射線の使用に苦しんでいる。放射線被ばくに起因する小児の膀胱がんのリスクは、他の多くの癌よりも重要である。ここでは、近赤外（NIR）の光吸収（ すなわちメチレンブルー、プラズモニック金ナノ構造体、または単層カーボンナノチューブ使って、光音響膀胱造影（PAC）と呼ばれる膀胱の非電離及び非侵襲的光音響（PA）イメージングの実現可能性を実証）光濁っトレーサーとして。我々は正常暗視野共焦点PAC方式を用いた光吸収剤を充填したラットの膀胱をイメージしている。造影剤の経尿道投与後、ラットの膀胱は重要PA信号増強を達成することにより、photoacoustically可視化した。蓄積は分光PAイメージングによって検証された。さらに、唯一のレーザパルスエネルギーを用いて未満1 MJ / cm 2と （安全限度の1/20）で、私たちの現在のイメージングシステムは、in vivoでの生体組織における越え1cmの深さでメチレン青塗りつぶさラット膀胱をマッピングすることができます。双方は、in vivoおよびex vivoで PAイメージング結果に造影剤が自然排尿を介して排泄されたことを検証します。したがって、臨床翻訳を容易にする、長期毒性剤の蓄積に関する心配がない。

概要

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X線膀胱造影1は、膀胱癌、膀胱尿管逆流、尿管の閉塞、神経因性膀胱などのような膀胱関連疾患を識別するためのイメージングプロセスです。2-5は一般的には、尿が排泄され、放射線不透過剤がを通して注入されカテーテル。その後、X線透視画像は、膀胱を記述するために取得される。しかし、キー安全性の問題は、有害な電離放射線は、この手順で使用されることである。さらに0.6〜1.8％へ診断用X線の範囲に75歳の年齢により、図6の累積癌のリスクの割合は、発がん性の脅威は、小児患者で有意である。英国の研究では、9つの主要臓器の中で、X線診断からの平均年間放射線量が4未満女児における膀胱で最高だったと4未満の男性の子供で2番目に高いことが明らかになった。7これはその膀胱癌のリスクを示している小児患者の中で最も重要である。 Altキーハフ小児放射線科医は、合理的に達成可能な、電離放射線を完全に排除することはできないという低い放射線被ばく量を低減するために努めています。したがって、制限は膀胱造影における非放射性造影剤と完全に放射線フリー、敏感な、費用対効果の高い、高分解能イメージングモダリティの必要性を作成する。

PATは強い光吸収コントラストと生体組織において高い音波空間分解能を提供することができるので、最近では、光音響トモグラフィー（PAT）は、最初の生物医学イメージング·モダリティとなっています。PATの8原則は、超音波を対象物の熱弾性膨張により誘発されるということです光吸収が続く。媒体検出することにより、2次元または3次元音響（PA）の画像を介して進行する音波を時間分解が形成されている。超音波（US）は、はるかに少ない散乱光（典型​​的には2桁又は3桁）に比べて組織中であるため、。空間分解能イメージング深さの1/200に維持しつつ、PATの撮像深さは、組織中〜8センチメートルまで達することができるcystographicアプリケーションのPATの9主な利点は、（1）PAT、電離から完全に自由である放射線。 （2）ClinicalUSimagingシステムは容易にデュアルモーダルPA、米国イメージング機能を供給するように適合させることができる。したがって、デュアルモーダルPA /米国イメージングシステムは、高速臨床翻訳のための重要な基準である、費用対効果の高い、高速、相対的に移植できることができます。内因性および外因性のコントラストの両方を使用して、PATは、腫瘍生理病理学、脳の血行動態、内臓、眼科、血管造影、および等を研究するために組織の高解像度、形態的、機能、分子イメージングを提供してきました。10-16

本稿では、近赤外（NIR）光学吸収（ すなわちメチレンブルー、行く使用非電離光音響膀胱造影の実験プロトコル（PAC）を実証無毒光濁っトレーサーとしてのldナノケージ、または単層カーボンナノチューブ）。造影剤で満たされたラットの膀胱はphotoacousticallyと分光in vivoで線引きされた。いいえエージェントは、永続的にラットの膀胱や腎臓に蓄積されていません。したがって、エージェントの蓄積によって引き起こされるかもしれない。長期毒性を排除することができる。この結果は、光吸収体の組み合わせでPACが潜在的に小児患者のために本当に無害cystographicモダリティであることを意味します。システム構成、システムの配置、およびin vivo / ex vivoでの撮像法では、この資料に記載されている。

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プロトコル

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1。深い反射モード光音響膀胱造影（PAC）システム

  1. システムコンフィギュレーション17,18
    1. Q-スイッチNd：YAGレーザー（SLII-10;連続、532 nm）をポンプ波長可変レーザー（Surelite OPO PLUS;連続、波長チューニング範囲：680〜2,500 nm）を。
    2. 各レーザショットのパルス持続時間は、約5ナノ秒であり、レーザの繰返しレートは10Hzである。
    3. 波長が使用される造影剤の光吸収ピークに依存する。メチレンブルーは、造影剤として作用する場合に吸収ピークがあり、667 nmでの光波長が使用される。プラズモン金ナノ構造は、それらの物理的および化学的特性に基づいて、NIRスペクトル領域における可変局在表面プラズモン共鳴を有することができる。また、単層カーボンナノチューブの広い吸収スペクトルは、波長選択のための広い選択肢を提供することができる。
    4. 波長可変レーザから出てくる光は、球面円錐レンズトンに配信されますhrough直角プリズム（PS908、ソーラボ）。
    5. 光は球面円錐レンズを通過した後にドーナツ状の光ビームパターンが生成される。ホームメイドの円錐レンズがBK7レンズから作られ、円錐角は152°です。レンズの直径は、2.5 cmである。
    6. 発散ドーナツ状の光ビームは透明なアクリル系シートからなる光学コンデンサを介して 、リダイレクトされる。上面および底面の直径は、それぞれ6.1〜4.8センチメートルである。凝縮器の厚さは、2.5 cmである。リダイレクトされたリング状の光ビームは、組織表面に暗い中心とドーナツ状を形成する。
    7. 音響結合を高めるために小さな水容器を利用する。水容器は、光学的および音響的に透明で明確な薄いポリエチレンフィルムで包まれた下部開口部を有する。小動物は、水容器の下に位置している。
    8. 生成されたPA波は球面集束超音波トランスデューサ（V308によって検出される。オリンパスNDT、5 MHzの中​​心周波数）、光凝縮器の中央に取り付けられている。素子直径とトランスデューサの焦点距離はそれぞれ1.9と2.5センチメートルである。従って、トランスデューサのFナンバーは1.3〜ある。
    9. 横方向と軸方向の解像度はそれぞれ590と144μmである。
    10. 検出されたPA波は最初のブロードバンド超音波パルサー/レシーバー（;オリンパスNDT; 5072PR 35 MHzの帯域幅と59デシベルのRFゲイン）で増幅された後、オシロスコープ（TDS5054;テクトロニクス）で取得しました。
    11. PA波の到達時間を測定することにより、一次元時間分解画像（Aラインと呼ばれる）を取得します。現在、PA波の速度は、全体の画像取得上で1480メートル/秒であると仮定される。二（B-スキャンと呼ばれる）と、三次元PA像が機械的に直線状のラスター走査ステージ（;ダナハードーバーXY6060）を移動させることにより得ることができる。
    12. 撮像時間はと1体積単一波長のPAイメージのため約25分でxyzの面で2.5のx 2.4倍1.5センチメートル3のビュー（FOV）の分野。我々は、0.4mmでステップサイズとy方向に沿った60のサンプル、0.2mmのステップサイズをx方向に125のサンプルを取得した。 50MHzのサンプリングレートで500データポイントは、z方向に沿って得られた。メカニカルスキャンは自家製NI LabVIEWソフトウェアシステムによって制御される。
    13. ボリュメトリックデータは、MathWorksのMATLABソフトウェアシステムを使用して、最大振幅突起（MAP）で表される。
  2. システムアラインメント
    1. 球状​​円錐レンズ後、ビームパターンは完璧なリング状であることを確認してください。ドーナツ型ビームパターンが正しく生成されない場合、皮膚表面に由来するPA信号が支配的である。これにより、深部組織イメージングを達成することは困難である。
    2. 水中でライン状の光の焦点が同軸音波焦点ゾーンに合わせなければならない。それらが同軸に整列されていない場合、システムは低い信号対苦しん雑音比。
    3. 2波長が680〜1000nmでのチューニングされているMJ / cm 2で、それぞれ-皮膚表面に照射されたレーザパルスエネルギーは、約1まで変化させた。これらのレーザーパルスエネルギーは、それぞれスペクトル領域にわたって20〜80 MJ / cm 2とから様々な、米国規格協会の安全限界よりもはるかに低くなっています。

2 生体内と生体外イメージングの手順で

  1. 動物の準備
    1. すべてのPAイメージング実験で250グラム - 200の重量の女性Spraque-Dawleyラットを使用します。
    2. まず、ケタミン（85 mg / kg体重）およびキシラジン（15 mg / kg体重）の混合物の腹腔内注射によってラットを麻酔。
    3. 腹部に毛を脱毛。
    4. カスタムメイドの動物のホルダーの上にネズミを置きます。
    5. コー​​トのカテーテル挿入を向上させるために潤滑剤を22ゲージのカテーテル。
    6. カテーテルVerticaはホールドLLY尿道開口部に。カテーテルのハブがようやく口に達するまで、次に、尿道に、水平に、カテーテルの先端を挿入します。
    7. 膀胱に尿がカテーテルを介して無効になります。
  2. 生体 PAC イメージング
    1. PACシステム内の水容器下の動物のホルダーの上に位置ラットを、置きます。
    2. 音響結合を改善するために、動物の皮膚表面とプラスチック膜との間の超音波ゲル（Sonotech）を適用する。
    3. 完全に生体 PAイメージング実験で中イソフルラン気化を（1L /分の酸素と0.75％イソフルラン）を使用してラットを麻酔。
    4. 前の造影剤の注入制御PA像を得る。
    5. メチレンブルー（30mMの濃度の0.8グラム/μlの体重）、金ナノケージ（2 nMの濃度の1.2グラム/μlの体重）、または単層カーボンナノチューブ（0.8μlの/ gの体の水溶液を導入する重量カテーテルを介して膀胱〜0.3μMの濃度）。 22ゲージのカテーテルを1 mlのシリンジを使用してください。
    6. PA一連の画像を取得する。
  3. ex vivoで PACイメージング
    1. ペントバルビタールの過剰摂取を注入することにより、 生体内 PAC イメージング後にラットを生け贄に捧げる。
    2. 2つの主要な器官、膀胱、腎臓を除去体内分布を調査し、ガラス板上に。
    3. PACシステム内の水容器下にガラス板を置きます。
    4. 摘出臓器や音響結合を改善するためのプラスチック製の膜の間に超音波ゲル（Sonotech）を適用します。
    5. PAの画像を取得する。
    6. Photoacoustically画像制御などの健康ラットから取り出し臓器。

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結果

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図1は、光学的に濁ったメチレンブルー（MB）を用いたin vivo非電離及び非侵襲PAC で示しています。制御PA像がMB（ 図1A）のピーク光吸収で、667 nmで得た。 FOV内の血管がはっきりと可視化されるが、それはこの波長で光学的に透明であるので、ブラダーは見えない。 図1Bに示すように、ブラダーは明らかにMBの0.2時間後、注射PAで取得された画像において明らかにされる。膀胱におけるMBの蓄積を確認するために、我々は周囲の構造からMBで埋め​​膀胱を区別するために2つの光の波長（667〜850 nm）を用いた。 850 nmでMBの光吸収係数がほぼ0であるので、 図1（c）に示すように、膀胱内のPA振幅が表示されません。従って、この結果は膀胱MBで満たされていることを示している。その結果、分光ことを示しているPAのイメージは明らかに異なった内因性および外因性choromophoresを区別することができます。1Dと

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ディスカッション

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結論として、我々は、in vivoでラットモデルにおいて無毒光吸収剤を使用してPACを電離する可能性を示している。我々は正常に我々の非電離及び非侵襲PACシステムを用いた光吸収剤を充填したラット膀胱をイメージしました。 2つの重要な安全性の問題は、我々のアプローチで解決されました：（1）cystographicアプリケーションや体内の造影剤の（2）のない蓄積非電離放射線の使用。

我々の臨床の関心は、小児患者で膀胱尿管逆流症（VUR）を監視が含まれています。米国の子供たちの約3％が尿路感染症の影響を受け19、及びこれらの患者の約1.5％がVUR苦しむされる。現在の臨床診療において、すべてのこれらの患者に直接電離X線透視撮影を受ける。米国泌尿器科学会小児VUR臨床ガイドラインパネルは強く小児パットに電離放射線の使用を最小限に抑えることをお勧めしますients。20我々の長期的な目標は、PACを使用して、毒性のない光学的コントラスト剤の組み合わせでVURを監視することである。患者でVURがあればこのように、私たちは、注入された...

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開示事項

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全ての動物実験では、バッファローインスティテューア​​ニマルケアのニューヨーク州立大学および使用委員会を遵守していました。
著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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この作品は、IT知の統合クリエイティブプログラム、バッファロー臨床およびトランスレーショナルリサーチセンターの大学のパイロット研究プログラムからの助成金とバッファロートランスレーコンソーシアム、ロズウェルパークアライアンス財団からの助成金、大学バッファロー校からスタートアップ資金によって部分的にサポートされていましたMKE、とNIPA（C1515-1121から0003）とMESTのNRF助成（2012から0009249）の。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
QスイッチNd:YAGレーザーContinuumSLII-10ポンプ
レーザーOPOレーザーContinuumSurelite OPOPLUSチューナブルレーザー
プリズムThorlabsPS908光は、
超音波トランスデューサリンパスNDTV3085 MHz
ウルトラウンドパルサー/レシーバーオリンパスNDT5072PRアンプ
オシロスコープテクトロニクスTDS5054データ収集
スキャンステージダナハー ドーバーXY6060ラスター スキャン
メチレンブルーシグマ・アルドリッチM9140-25G造影剤
ラットハーランスパグ・ドーリー動物被験者
イソフレン気化器安楽死EZ-155麻酔
超音波ゲルSonotechクリアイメージシングル音響カップリング
オを提供します・剤

参考文献

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