細胞内Ca測定 2 +変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Summary

細胞内Ca ^{2 +}ダイナミクスは、精子生理学およびCaで非常に重要である ^{2 +}感受性蛍光色素は、それらを研究するための多彩なツールを構成する。集団実験（蛍光法およびフロー蛍​​光停止）し、単一細胞実験（フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング）は、時空間の[Caを追跡するために使用され ^{2 +]変化。}

Abstract

精子は、特に、到達認識し、卵と融合するように設計された男性の生殖細胞である。これらのタスクを実行するには、精子細胞は、絶えず変化する環境に直面して、いくつかの物理的な障壁を克服するために準備しなければなりません。転写と翻訳サイレント本質にある、これらの運動性の細胞は自分自身の向きに多様なシグナル伝達機構に深く依存しており、監督のファッションで泳ぎ、そして卵を見つけるために彼らの旅の間に環境条件に挑戦すると競合する。具体的には、Ca ^{2 +}の媒介シグナル伝達は、いくつかの精子の機能のための極めて重要です：運動の活性化能（先体反応のために精子を準備する複雑なプロセス）と、先体反応（精子卵の融合を可能にしますエキソサイトーシスイベント）。このイオンの細胞内変動を追跡するための蛍光色素の使用は、アプリケーション、感度の容易さのために顕著に重要である、とDETの汎用性ECTION。一つの染料ローディングプロトコルを用いて、我々は、精子のCa ^{2 +}動態を監視するために4つの異なる蛍光技術を利用。各手法は、シングルセル及び細胞集団レベルでデータを生成し、空間的および/または時間分解能を可能にする明確な情報を提供する。

Introduction

のCa ^{2 +は、}真核細胞内シグナル伝達経路の普遍的な二次メッセンジャーである。細胞内Ca ^{2 +（Ca 2 +}の_i）は興奮性と非興奮性細胞の両方で多くの基本的な生理的過程の調節に関与する。シグナル伝達事象中のセカンドメッセンジャーとしてのCa ²の重要性と普遍^+は、セル内の情報の伝送における時空間汎用性に由来する。のCa ^{2 +} のde novo又は細胞内で分解さ合成することはできないが、その細胞内濃度（[Ca ^{2 +]} _i）が連続的にバッファ、封鎖、区分化、および/ ​​またはカルシウム^2を蓄積するさまざまな細胞機構を介して非常に厳格な限度内に維持される^+。このイオンの濃度の変化は、セル¹内に高度にローカライズされた地域で発生し、このような変動を解読すると、デを得るために不可欠であることができますEPERのシグナル伝達機構（1）の役割を理解すること、（2）それらの生理的重要性、および細胞シグナル伝達の（3）一般的なメカニズム。のCa ^{2 +}を介するシグナル伝達は、精子生理学²において特に重要である。精子の運動性は、受精の成功のための最も重要な機能の一つであり、実際には、いくつかの精子の運動性の欠陥は不妊^3-5を

Protocol

本稿では、ヒトの精子細胞での[Ca ^{2 +]} _iの変化を測定するための4つの前述の技術の使用を報告している。それはよく、このステロイドは、一時の[Ca ^{2 +]} _iは精子の増加を生成することを確立されているように我々は、Ca ^{2 +}の反応を誘発するためにプロゲステロンを使用していました。特に、ヒト精子において、プロゲステロンが直接精子細胞^10,11の原形質膜においてのみ発現のCa ^{2 +}チャネル（すなわちCatSper）を起動する。また、測定された安静時の[Ca ^{2 +]} _iのそれはまた広く増加の[Ca ^{2 +]} _iは能間に起こることが認められていることを考えると能前後。を最小限の蛍光値のために、我々は蛍光消光⁺にMnの^{2を使って} 、正の制御を必要とする技術のために私達は⁺イオノフォアイオノマイシンするセルに最大限のCa ^{2 +}の取り込みを誘導し、その結果、最大の蛍光応答のCa ^2を使用した。

1。スイムアップ法による精子サンプル調製（図1を参照）

（マスターベーションによっ....

Results

図1。スイムアップ法による精子サンプル調製のための実験プロトコールの概略図。精子の分離およびそれらの濃度を調整するための主要なステップが示されている。能が必要とされるときに最後インキュベーション工程にのみ実行される。

図2。プロゲステ.......

Discussion

細胞内シグナル伝達は、ほとんどの細胞の活動のために不可欠であり、Ca ^{2 +}の受精で、その起源から、そのライフサイクルの終わりに、彼らの全体の寿命を通して、哺乳動物細胞に伴うユビキタスメッセンジャーです。別の刺激に応答して、[のCa ^{2 +]} iの増加、発振と時空成文とともに減少、それに応じて、多様なプロセスが起動され、変調された又はCa ^{2 +}でエンコードされたメッセージによって終了。細胞内Ca ^{2 +}イオンは、このシグナル伝達プロセスの複雑なオーケストレーションに関与するようにダイナミクスは、精子の生理学に非常に重要である。例えばCa ^{2 +}の知識は変動が解読Ca ^{2 +}の関与チャンネル、異なるシグナル伝達カスケードにおけるそれらの特定の役割の分子アイデンティティを助けることができる。のCa ^{2 +}感受性蛍光色素は、非常に特異的かつ高感度のCa ^{2 +} Mを有効にすると、それらを研究するための強力なツールを構成する生細胞内の濃度変化を追跡するために使用すること.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ハムのF-10	ΣΣ-Aldrich	N-6013
ウシ血清アルブミン	ΣAldrich	A-7906
塩化カルシウム二水和物 約99%	ΣΣAldrich	C-3881
Makler 計数室	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg
各 イオノマイシン	アロモン	I-700
プロゲステロン	Sigma-Aldrich	P0130
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S-9888	ヒト精子培地用試薬 (HSM)
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P-3911	ヒト精子培地用試薬 (HSM)
重炭酸ナトリウム	JT Baker	3506	試薬ヒト精子培地用試薬(HSM)
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M-2670	ヒト精子培地用試薬(HSM)無
水塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C-1016	ヒト精子培地用試薬(HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	ヒト精子培地用試薬(HSM)
D-グルコース	JT Baker	1906-01	ヒト精子用試薬中 (HSM)
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P-2256	ヒト精子培地用試薬 (HSM)
L-乳酸ナトリウム (約 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	ヒト精子培地用試薬 (HSM)
ヨウ化プロピジウム	Invitrogen	L-7011	成分
B Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution水中
丸型カバースリップ	VWR	48380 080	直径25 mm
ポリ-L-リジン溶液	Sigma-Aldrich	P8920
塩化マンガン	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor;セルチャンバー、顕微鏡用	ライフサイエンステクノロジー	A-7816
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml