Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

サマリー

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

要約

photothromboticストロークモデルは、以前に注入された光感受性色素の光活性化によって与えられた皮質領域内虚血性損傷を誘発することを目指しています。照明続いて、色素が活性化され、その後の血小板凝集し、最終的に局所血流の中断を決定する血栓の形成、を、内皮細胞膜の損傷成分という一重項酸素を生成する。当初は1977年にローゼンブラムとエルSabbanによって提案されたこの手法は、後のラット脳内で1985年にワトソンによって改良と現行モデルの基礎を設定されていた。また、トランスジェニックマウス系統の可用性の向上、さらにphotothrombosisモデルの関心を高めるために貢献した。簡潔には、感光性染料（ローズベンガル）が腹腔内注射し、血流に入る。冷光源によって照射されたときに、色素が活性化になると、ローカルの結果、血小板の活性化および血栓症、内皮損傷を誘発する血流の中断。光源は、再現可能かつ非侵襲的な方法で、任意の目的の皮質領域のターゲティングを可能開頭の必要がなく無傷の頭蓋骨に適用することができる。マウスはその後縫合と目を覚ますために許可されています。虚血性損傷の評価が迅速トリフェニルテトラゾリウムクロリド又はクレシルバイオレット染色によって達成することができる。この技術は、正確なセルの特性又は機能的研究のために非常に有利で小型化と十分に区切られた境界の梗塞を生成する。また、トランスジェニックマウスにおける脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

概要

21世紀の初めには、虚血性脳卒中は、長期障害¹とストロークは、2004年²で約5,7万人が死亡を占めている死亡、世界中の第二の原因の第二の原因を表して壊滅的な疾患である。に入れ、多くの努力にもかかわらず、脳卒中後の機能回復を改善するために利用できる有効な治療法はまだありません。それらは虚血性障害の病態のモデル化を可能にし、in vivoで異なる神経保護戦略の有効性を試験するようにストロークの動物モデルが広くストローク研究の分野で使用されている。これらのモデルのほとんどは、他のモデルは、通常、特定の領域、モータと体性感覚野に小型の病変を研究するために開発されたのに対し、（一時的または恒久的に）中大脳動脈内の血流を遮断することによって広範な梗塞を誘発することを目指します。しかし、いくつかの要因は、ACを生成するために寄与することができる使用マウス系統を含む実験的な脳卒中の研究、の変動のertain度、すべての上に、研究に含まれており、動物の年齢や性別、技術は、虚血性損傷を誘発するために採用。後者の点に関しては、期間と侵襲手術（ つまり開頭術の必要性）だけでなく、確実に虚血性病変を誘発するために、オペレータに必要な外科的なスキルは、in vivo脳卒中研究で成功し、公平のための重要な決定要因である。

photothrombosisの概念は当初、1977年^....

プロトコル

1。手術前

1. 1.5mlチューブにローズベンガルを秤量し、15 mg / mlの最終濃度に達するまで無菌食塩水に溶解する。 0.2μmのフィルターを通して滅菌をフィルタリングして、最大2ヶ月、室温で暗所に保管してください。
2. オートクレーブですべての手術器具を殺菌する。手術領域は、手術を開始する前に、1時間未満で消毒されるべきである。
3. 注入されるローズベンガルの投与量を調節するために、マウスの体重を記録します。我々は現在のプロトコルで12週齢の雌CD1マウスに10μlの/ gの動物体重を注入した。ローズベンガルの量は、所望の皮質病変の大きさを容易異なる投与量（典型的に2μlの/ gであり、5μlの/ g以上は10g /μlの体重）試験することによって予備実験の別個のセットを決定することができる生成するために必要とされる。注入されるローズベンガルの量は、特に実験条件、光源の種類に大きく依存することに留意使用され、露光の期間。本研究では、10グラム/液（150μgの/ g）の用量は、その他のグループは、報告されたのに対し、15分間露光によりphotothrombosisを誘導するのに必要であることが分かった50μgの/ gの^6,8および100μg/ml/ gのどちら¹⁰腹腔内注射はphotothrombotic病変を誘導するために十分であった。

2。麻酔の手順

結果

このプロトコルは、すでに肉眼（ 図1A-1C）の皮質の解剖時に表示されている皮質病変を生成します。 photothrombotic病変組織がローズベンガルの光活性化を可能にするために十分に透明である浅と深い皮質層に発症。脳梗塞の程度の測定を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後、新鮮な組織、あるいは、クレシルバイオレットによるトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）を用いて組織学的染色によって迅速に行うことができる。 TTCのインキュベーションの前に、新たに解剖脳は、脳スライサーに配置されており、厚さ1mmのスライス（ 図1C）に区分。梗塞領域が梗塞面積（ 図1D-1E）の正確な測定を可能にする、淡い現れるのに対し、TTCは赤で無傷の組織にラベルを付けます。ペナンブラとして定義された不完全な虚血のゾーンは、病変の大きさに応じて非常に減少もしくは存在しないです。

同様に、クレシルバイオレット染色は紫染色周囲の組織に比べて染色梗塞領域の識別を可能にします。反応性増殖と細胞浸潤.......

ディスカッション

修正や代用

なぜなら562 nmでの吸収ピークから、濾過キセノンアークランプからの緑色光レーザーは、もともと感光ローズベンガルを照射するように選ばれた。レーザー媒介励起がまだrecently5を用いたが、それはまた、色素の励起^10,15を確実に冷光ランプに置き換えることができます。冷光光ファイバは、レーザー光源より操作しやすく、安価である。しかし、レーザーは、一般的に生体内で血管固有凝固¹⁰のため開頭後に個々の表面の細動脈を標的とするために使用されていることに気づいたことがあります。

感受性色素の送達は、通常、均一で再現性のある結果を得るためのいくつかの訓練を必要と尾静脈注射によって達成される。対照的に、腹腔内注射によって行うことが容易で、ローズベンガル、数分¹³後の血流中の検出可能である。実効photothrombosisを色素5分間腹腔内注射した後^、8励磁することによって達成することができる、ラットにおけるローズベンガルしかし.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
手術材料および機器
>フィルター	Havard 装置	340415
150W 光ファイバー照明器	Photonic	PL3000
プレート用 TCAT-2DF	Havard 装置	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
手術顕微鏡	高木	OM8
ヒーティングパッド
、酸素、窒素ガス
、手術ツール、	ワールド精密機器		、光ファイバータップ、マスクはカスタムメイドです