私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。
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この記事について
サマリー
要約
私たちは、移植のために製造された組織工学バイオ複合材料に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。装置は主にネイティブ機械的歪みを模倣するバイオリアクターとして機能するが、それはまた、力フィードバックまたは構築物の機械的試験を提供するためのロードセルを装備している。デバイス被験者はローディング線量の高い精度（振幅と周波数）で軸機械的負荷に対する軟骨構造を設計し、標準的な組織培養インキュベーター内に収まるように十分コンパクトです。それは、直接組織培養プレートにサンプルをロードし、多板サイズは、システムと互換性がある。装置は、精密誘導レーザ·アプリケーションのために製造コンポーネントを使用して設計されている。二軸荷重は、2つの直交する段によって達成される。ステージ50ミリメートル移動範囲を有し、ステッピングモータアクチュエータによって独立に駆動されることによって制御50nm未満のステップサイズを可能にする、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ。ポリスルホンローディングプラテンは、二軸可動プラットフォームに連結されている。ステージの動きはトール·ラボの高度なポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、周波数及び剪断及び独立かつ同時に圧縮の両方の振幅の負荷パラメータを調整するためのソフトウェアで使用される。位置フィードバックは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの分解能を持っている非線形光学エンコーダによって提供されます。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスに必要な位置フィードバックを提供します。検出するためのフォースフィードバックのロード応答に連絡し、評価を提供するためには、精密小型ロードセルローディングプラテンとmovinの間に配置されているグラムプラットフォーム。ロードセルは、0.15％〜0.25％フルスケールの高い精度を有している。
概要
私たちは、移植のために製造されたバイオ複合材料工学組織に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディングバイオリアクターを設計しました。この装置は、主に関節軟骨のために設計された代替のためのバイオリアクターとして設計され、それはまた、人体の他の耐荷重組織を使用することができる。このバイオリアクター設計の私たちのモチベーションは、動きの欠如に起因する麻痺ニワトリ胚における関節軟骨の異常形成の精液の観察を行ったDrachmanとソコロフ1、に由来する。同様に、物理的な運動は、通常の筋肉と骨の開発に不可欠である。この考え方に沿って、多くの研究グループは、in vitro培養中に物理的刺激の方法の異なるモードを調べた細胞バイオ複合生体材料および組織外植片2-7の生化学的および機械的特性を調節する。機能的な組織工学の概念組織の機能的特性を向上させ、機械的刺激のインビトロでの使用に伴い、 インビボ応力と歪み8,9 に耐えることが予想される組織を有効にする機械的特性、即ち 。多くの研究では、関節の関節のために設計軟骨構造を刺激するせん断および圧縮の観点から使用機械的荷重を報告している。 Mauck ら 10は、単独で機械的負荷がさらに不可欠とみなされる成長因子の非存在下で、間葉系幹細胞の軟骨形成を誘導することができることを示....
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プロトコル
1。二軸ロードバイオリアクターの設計
- バイオリアクターは、偉大な負荷用量の精度（振幅と周波数）と多種多様のアプリケーションを使用して、設計された組織への一軸又は二軸の機械的ひずみを適用するための精密誘導レーザーアプリケーション用のトール·ラボ（ニュートン、マサチューセッツ州）製の二つの段階を採用単一の24ウェルプレート（ 図1）組織培養条件。
- 二軸荷重は2 TravelMax段階（LNR50SE）によって達成される。これらのステージは、XZ構成で直角に取り付けられている。水平ステージは、X軸に沿って振動させることにより、動的せん断動きを提供します。縦のステージはZ軸に沿って振動することによって、動的圧縮荷重を提供しています。これらの段階は、50ミリメートル移動範囲を有し、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ（BSC102）によって制御されるステッピングモータアクチュエータ（DRV014）によって独立に駆動され、より小さいステップサイズを可能にする50nmである。
- 装置は、剛性25センチメートルに装着され×30メートル×12.5機械の部品組立のためのプラットフォームとして組織培養プレートを装着するために使用されるミリメートルのアルミベースプレート。調整可能なストップは、キネマティックアルミニウム基板上に所定の位置に組織培養プレートをロックするために使用される。これらの運動が停止し、そうでなければ手では達成できない正確な....
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結果
装置を20万個の細胞/ mlの軟骨とアガロースゲルシードを使用してテストし、一軸（圧縮）または軸（圧縮及びせん断）機械的荷重の存在下で培養した。一次ブタ軟骨細胞は2-4ヶ月のブタの関節軟骨から分離した。直径5mm及び厚さ1.5mmのサンプルを定義した軟骨細胞培養培地（高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、2.5μgの/ mlの2mlに培養したアムホテリシンB、37、24ウェルプレート中の50μgの/ mlのアスコルビン酸、0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）、プロリン0.4ミリモル）°C、5％CO 2。 10 -7 Mデキサメタゾンおよび10 ng / mlのTGF-β1は、培養の最初の10日間の供給した。サンプルは10から30日の間に3時間/日のためにロードされた。一軸負荷が10％圧縮ピーク·ツー·ピーク振幅から構成され、1Hzの二軸荷重は0.15ミリメートル（10％厚さ）圧縮および0.075から成っmmのせん断ピーク·ツー·ピーク振幅、1 Hzの。動的なひずみ振幅と負荷周.......
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ディスカッション
私たちは、移植のために製造された組織工学構造物に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。デバイスは、天然組織の前に又は他の治療後の機械的特性を記述するために設計されたバイオ複合材料のin vitro培養用のバイオリアクターとして、または検査装置として用いることができる。デバイス被験者は24ウェルプレートへの単一の大きな負荷用量の精度（振幅と周波数）と組織培養条件の多種多様なアプリケーションとの二軸機械的負荷に組織構造を設計。
せん断荷重のアプリケーションは、このシステムの設計のための固有の課題の組を提示した。栄養素伝達を最大にするために、構築物は、最初に24ウェルプレートの各ウェル内に閉じ込められた。風袋圧縮歪があること被保険者として、これは、動的圧縮のために問題を提示しませんでしたサンプルプラテン接触が失われていませんでした。せん断ひずみがプロトコルに追加されたとき、しかし、一軸サンプルはプレートの底に沿ってスライドとプラテンといくつかの失わ接触。さらに、軸荷重プロトコールサンプル中に一貫性のないロードを引き起こして、裏返し.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益がないことを宣言します。
謝辞
この作品は、研究開発、RR＆Dサービス、退役軍人の米国エネルギー省、NIH COBRE 1P20RR024484、NIH K24 AR02128と防衛W81XWH-10-1から0643の部門のオフィスによってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM, 高グルコース, ピルビン酸 | Invitrogen | 11995 | |
| アガロース II 型 | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen 連鎖球菌 グルタミン | Invitrogen | 10378-016 | |
| アムホテリシンB | Invitrogen | 041-95780 | |
| アスコルビン酸 | シグマ | A-2218 | |
| 非必須アミノ酸溶液 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-プロリン | Σ | P-5607 | |
| デキサメタゾン | Σ | D-2915 | |
| 組換えヒトトランスフォーミング成長因子 β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 ロードセル (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| モデル 31 ロードセル (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| シングルチャンネルディスプレイ | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| 2チャンネルステッピングモータコントローラ | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm台形ステッピングモータドライブ (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| 調整可能なキネマティックロケータ (4) | Thorlabs | KL02 | |
| 精密直角プレート | Thorlabs | AP90/M | |
| 垂直取り付けブラケット | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| 1.5 mmおよび0.75 mmスペーサープレートBioRad | #1653312および#1653310 | ||
| 固体アルミニウムブレッドボード | Thorlabs | MB3030 / M | |
| 33-35 | |||
| 16 mm 中空パンチ | Neiko Tools | ||
| 非組織培養処理プレート、24 ウェル、平底 | BD Biosciences 351147 | ||
| プラテン積載用超耐湿ポリスルホン シート | McMaster-Carr | 86735k19 | カスタム加工 |
参考文献
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cel....
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