私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。
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この記事について
サマリー
要約
私たちは、移植のために製造された組織工学バイオ複合材料に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。装置は主にネイティブ機械的歪みを模倣するバイオリアクターとして機能するが、それはまた、力フィードバックまたは構築物の機械的試験を提供するためのロードセルを装備している。デバイス被験者はローディング線量の高い精度（振幅と周波数）で軸機械的負荷に対する軟骨構造を設計し、標準的な組織培養インキュベーター内に収まるように十分コンパクトです。それは、直接組織培養プレートにサンプルをロードし、多板サイズは、システムと互換性がある。装置は、精密誘導レーザ·アプリケーションのために製造コンポーネントを使用して設計されている。二軸荷重は、2つの直交する段によって達成される。ステージ50ミリメートル移動範囲を有し、ステッピングモータアクチュエータによって独立に駆動されることによって制御50nm未満のステップサイズを可能にする、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ。ポリスルホンローディングプラテンは、二軸可動プラットフォームに連結されている。ステージの動きはトール·ラボの高度なポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、周波数及び剪断及び独立かつ同時に圧縮の両方の振幅の負荷パラメータを調整するためのソフトウェアで使用される。位置フィードバックは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの分解能を持っている非線形光学エンコーダによって提供されます。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスに必要な位置フィードバックを提供します。検出するためのフォースフィードバックのロード応答に連絡し、評価を提供するためには、精密小型ロードセルローディングプラテンとmovinの間に配置されているグラムプラットフォーム。ロードセルは、0.15％〜0.25％フルスケールの高い精度を有している。
概要
私たちは、移植のために製造されたバイオ複合材料工学組織に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディングバイオリアクターを設計しました。この装置は、主に関節軟骨のために設計された代替のためのバイオリアクターとして設計され、それはまた、人体の他の耐荷重組織を使用することができる。このバイオリアクター設計の私たちのモチベーションは、動きの欠如に起因する麻痺ニワトリ胚における関節軟骨の異常形成の精液の観察を行ったDrachmanとソコロフ1、に由来する。同様に、物理的な運動は、通常の筋肉と骨の開発に不可欠である。この考え方に沿って、多くの研究グループは、in vitro培養中に物理的刺激の方法の異なるモードを調べた細胞バイオ複合生体材料および組織外植片2-7の生化学的および機械的特性を調節する。機能的な組織工学の概念組織の機能的特性を向上させ、機械的刺激のインビトロでの使用に伴い、 インビボ応力と歪み8,9 に耐えることが予想される組織を有効にする機械的特性、即ち 。多くの研究では、関節の関節のために設計軟骨構造を刺激するせん断および圧縮の観点から使用機械的荷重を報告している。 Mauck ら 10は、単独で機械的負荷がさらに不可欠とみなされる成長因子の非存在下で、間葉系幹細胞の軟骨形成を誘導することができることを示唆している。そのような組織培養中の圧縮またはせん断などの断続的な機械的荷重の印加が軟骨及び骨形成を調節することが示されているが、しかしながら荷重の最適な線量は、細胞および組織特性11と異なっている。
関節軟骨の最も重要な機能は、内圧縮および剪断力に耐える能力であるジョイントは、したがって、それは高い圧縮および剪断弾性率を有していなければならない。工学軟骨における機能機械的強度および生理学超微細構造の欠如は、in vivoでのネオ軟骨で内訳と関節の軟骨交換戦略の失敗をもたらした。圧縮及びせん断は、一般的に変調し、関節軟骨のバイオ複合材料の機械的強度を向上させることが実証されているが、合成アプローチは6,12-15稀である。 Wartellaとウェイン16は半月板軟骨の交換を生成するために引張圧縮を適用されたバイオリアクターを設計しました。ウォルドマンら 15は、多孔性カルシウムポリリン酸基質で培養軟骨細胞への圧縮とせん断を適用するデバイスを設計しました。総統ら 17ゲルおよび軸メカの適用における成人イヌ軟骨細胞のin vitroでの栽培とネイティブ軟骨のマッチング機械的特性を実証しanicalローディング（圧縮変形のロードと摺接ロード）。
二軸機械的荷重バイオリアクターは、もともと組織工学軟骨で形態素適応を誘導するために全体的な目標に我々の研究室でダニエルチュウによって設計されました、現在入手可能な18よりも高い圧縮とせん断弾性係数の結果構築します。私たちは、この研究が大幅にメカノは、臨床的に関連する組織をエンジニアに変調することができる方法の我々の広範な理解を高めると信じています。
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プロトコル
1。二軸ロードバイオリアクターの設計
- バイオリアクターは、偉大な負荷用量の精度（振幅と周波数）と多種多様のアプリケーションを使用して、設計された組織への一軸又は二軸の機械的ひずみを適用するための精密誘導レーザーアプリケーション用のトール·ラボ（ニュートン、マサチューセッツ州）製の二つの段階を採用単一の24ウェルプレート（ 図1）組織培養条件。
- 二軸荷重は2 TravelMax段階（LNR50SE）によって達成される。これらのステージは、XZ構成で直角に取り付けられている。水平ステージは、X軸に沿って振動させることにより、動的せん断動きを提供します。縦のステージはZ軸に沿って振動することによって、動的圧縮荷重を提供しています。これらの段階は、50ミリメートル移動範囲を有し、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ（BSC102）によって制御されるステッピングモータアクチュエータ（DRV014）によって独立に駆動され、より小さいステップサイズを可能にする50nmである。
- 装置は、剛性25センチメートルに装着され×30メートル×12.5機械の部品組立のためのプラットフォームとして組織培養プレートを装着するために使用されるミリメートルのアルミベースプレート。調整可能なストップは、キネマティックアルミニウム基板上に所定の位置に組織培養プレートをロックするために使用される。これらの運動が停止し、そうでなければ手では達成できない正確な位置合わせを可能にするために、微調整ネジを持っている。ベースプレートのモジュール設計は、異なるサイズおよび形状（ペトリ皿対マルチウェルプレート）のプレートを収容するためにこれらの運動学的ストップの柔軟な配置を可能にする。
- カスタム加工ポリスルホンロードプラテンは、精密機械加工直角ブラケットを介して二軸移動プラットフォームに接続されている。ポリスルホン材料は、その生体適合性により、加工のしやすさ、および滅菌を容易にするために選ばれた。
- ステージの動きはトール·ラボ[詳細ポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、私たちです。独立かつ同時に周波数及び剪断及び圧縮の両方の振幅の負荷パラメータの調整を可能にするソフトウェアとの組み合わせオピニオン。
- 位置フィードバックは、各移動架台に取り付けられ、ソフトウェアと統合されている非線形光学エンコーダによって提供される。エンコーダシステムは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの解像度を持っています。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスと絶対位置を直接読み出しに必要な位置フィードバックを提供します。
- プラテンと試料間の接触を検出するために必要な力フィードバックを提供し、ローディング応答、ローディングプラテンと可動プラットフォーム（ 図2）との間に配置される精度ミニチュアロードセル（ハネウェルモデル31）に評価するためである。ロードセルは、高い精度を有する0.15％〜0.25％フルスケール。ロードセルする表示部（SC500）は、小数点以下5桁までの荷重測定を提供することができる。さらに、コンピュータ上でデータ収集を可能にするためにRS-232ポートを有している。
2。細胞播種アガロースコンストラクト
- 4％アガロースを準備：50ミリリットルのフラスコに、沸騰してから70に留めておく°使用するまでCのオーブンで20ミリリットルDMEM（無添加）に0.8グラムアガロースを追加。
- 所望の細胞播種密度の二重量のための細胞懸濁液の量を調整します。この懸濁液は、所望の播種密度で2％アガロースゲルを作成するために4％w / vのアガロースの等量混合する。
- インキュベーター内で細胞懸濁液と1つの10ミリリットルピペットの両方を配置します。
- ゲルキャスティングシステムを設定します。 One 1.5ミリメートルと1 0.75ミリメートルスペーサープレートが2.25ミリメートルの厚さのゲルを作成するために一緒に配置する必要があります。他のサイズのスペーサプレートは、異なる厚さのゲルを作成するために使用することができる。ゲルキャストシステムは、これらのプレートtogetを保持するのに十分な大きさではない彼女には、ので、それらは確実に漏れを防ぐためにテープで固定しなければならない。
- 次のステップは、アガロースが固化する前に迅速にゲルモールドに予め用意アガロースとピペットを用いて細胞懸濁液を混合することである。オーブンから液体アガロースを取り外し、中の滅菌温度計を配置。アガロースは°C細胞と混合する前に42-43に冷却しなければなりません。 37℃に細胞懸濁液を温めるアガロースが43に当たったら℃、迅速に所望の量をピペットで、その後すぐにミックスするには、上下に数回の細胞懸濁液をピペット。その後、直ちにゲル型に混合物全体をピペット。
- ゲルは10〜15分間固化した後、慎重に水平位置に傾けることができます。
- トップガラス板と生検パンチとパンチディスクを削除します。ディスクは小さな滅菌スパチュラでピックアップすることができます。我々の経験では、9ミリリットルゲルが百以上の5 mmの直径のディスクを作るのに十分な大きさでした。
3。文化ディスク
- 24ウェル非組織培養処理プレートの各ウェルに置きつのディスクを。
- 各ウェルに無血清軟骨分化培地2mlを加える。
- （37℃、5％CO 2）インキュベーターにプレートを置く。
- メディアの変更については、1ミリリットル当たりよく2〜3日ごとに交換してください。
4。機械的負荷のためのサンプルの固定化
- 4％アガロース（無細胞懸濁液を添加していない）を準備し、ゲルは、サンプル自身（ロード時の干渉を防ぐために）よりも薄くする必要があります。推奨厚さは1.5〜1.9ミリメートル（339 mm厚のサンプルのため）です。
- かつて24ウェルプレート用ポンチ直径16mmディスクは、ゲル化した。必要に応じて各ディスクには、サンプルのためのパンチ1 5ミリメートル穴をインチ配置される、メディアの変化の間に配置されるピペットのディスクの端に別の5ミリメートルの穴を開ける。
- 図3に示すように、一度アガロースウェルを、24ウェルプレート内の場所なされている。
- アガロースW一度エルボは、24ウェルプレートにあり、各ウェルにサンプルを圧入。サンプルはアガロース井戸の上部から突出する必要があります。
5。機械的荷重
- プラテンします（ 図2）滅菌する。
- セルをロードするためにアルミ板を固定します。セキュアプラテン/ステージにロードセル/アルミニウムプレートアセンブリをロードする。
- ステッピングモータコントローラ（背面のスイッチ）をオンにします。
- PCとオープン"APTユーザー"プログラム（ 図4）をオンにします。
- 左の画面は、水平ステッピングモータを制御する。右の画面は縦のステッピングモータを制御する。各画面では、 "グラフィックコントロール"タブでは、手動位置を可能にし、 "移動シーケンサ"タブでは、自動化が可能になります。すべてのユニットはミリです。
- 両方の画面の "グラフィックコントロール"タブに移動し、 "ホーム/ゼロ"ボタンを押してください。両方のステッピングモータは50mmの範囲を有する。 "ホーム/ゼロ"を押すと、ゼロ位置（トップと一番右の位置）にステッピングモーターの両方を送信します。
- た準備各ウェルから一部のメディアを除去することにより、ロードするための24ウェルプレートでの電子のサンプル。メディアのこれ以上より1 mlをロード中にオーバーフローを防ぐために、各ウェルに残しておく必要があります。十分なメディアがサンプルをカバー保つために十分に残されていることを確認してください。
- インキュベーターは、機器の故障を防ぐために、低湿度条件に保持されることに留意されたい。
- 場所24ウェルプレートバイオリアクターで、慎重にプラテンに並ぶ。
- プレートは、4つの調整可能な運動ロケータを使用してバイオリアクターに固定されている。それが簡単にプラテンを整列できるようにするため、左側の2つのロケータが事前に配置されている。プレートが安全であるように、右側の2つのロケータを締めます。バイオリアクターベースの前面とアップフラッシュプレートを並べるようにしてください。
- "グラフィックコントロール"タブでは、特定のステッピングモーターの位置を手動で位置ボックスをクリックして入力することができます。ゆっくりプラテンを下げ、プレートと並ぶように水平方向に移動するには、この機能を使用します。
- プラテン、サンプルに接触に近くなると、非常に遅く単位でプラテンをダウンさせるために開始（0.1mm）をあなたが所定の開始位置に到達するまで（パート6を参照）。
- 開始位置に到達すると、タブ "シーケンサを移動"を押すことにより、所望の移動シーケンスをロードするために行く "ロード"をその後、開始するには、 "ファイル名を指定して実行"を押します。 （ 図5）パート7を参照してください。投与プロトコルを記述する。
- ロードが完了したら、手動でプラテンを上げる。任意のサンプルがプラテンに立ち往生している場合は、慎重に滅菌スパチュラを用いてよく、適切にそれらを戻す。
- バイオリアクターからの24ウェルプレートを取り外し、メディアを交換してください。
- 慎重にロードセルからプラテンを削除してから、楽器をオフにします。
6。キャリブレーションの読み込みプラテン
適切な株はサンプルに適用されるようにするには、各プラテンは慎重に実験を開始する前に校正する必要があります。
- 5.8に手順5.1を実行してください。
- 手動で25ミリメートルの位置に水平ステッピングモータを置く。
- それはちょうどかろうじてバイオリアクターの底に接触して慎重に下プラテン来るまで。ロードセルは、この時点で増加した負荷を示す。縦のステッピングモータ（すべての圧縮ひずみ測定は、この値から計算されるように、できるだけ正確に）の正確な位置に注意してください。
- 位置を記録。この値は、試料の寸法と所望の菌株をもとにして投与プロトコルを書き込むために使用される。
7。投薬プロトコルを書く
- バイオリアクターは、同時にまたは個別に、圧縮及びせん断ひずみの両方を適用することができる。風袋圧縮ひずみ、動的ひずみ振幅、周波数をロードする：3つの主要なパラメータが決定しなければなりません。
- 風袋株は試料からプラテンのリフトオフを防止するために適用される。
- サンプルの動的ひずみ振幅と周波数荷重周波数が選択されています。
本研究では、次のように圧縮とせん断ひずみを定義します。
例えば二軸投与·プロトコル
試料の厚さ：2.25ミリメートル
風袋ひずみ（圧縮）：試料の厚さの10％（0.225ミリメートル）
動的なひずみ振幅（圧縮）：10％（+ / - 試料の厚さの5％）
周波数（コンプレッション）：1 Hzの
動的なひずみ振幅（せん断）：試料の厚さの25％（0.5625ミリメートル）：せん断応力は
水平に移動するプラテンにより試料に適用。
周波数（せん断）：0.5 Hzの
典型的な投与プロトコルは、一日あたりのローディング3時間である。この例では、動的および剪断荷重を同時にではなく順次に印加される。私たちは、このパターン良いMIMを信じる人間の膝でICS複雑なローディング環境。
- 投与プロトコルが選択されると、圧縮移動シーケンスプログラムが書き込まれなければならない。
- 移動シーケンスは、ステッピングモータは、指定の加速度と最大速度でに移動することを位置のリスト、のように聞こえるかを正確です。
- プロトコルとプラテンの校正値（パート6から）投薬に基づいて、所望の垂直位置を計算します。
- プラテン1のサンプル計算は、以下に提供されています：
校正値との差 垂直位置 プラテン校正値（バイオリアクターのタッチボトム） 0ミリメートル 29.7700ミリメートル プラテンは、サンプルと接触（339ミリメートルサンプル）になります 4.4140ミリメートル 25.3560ミリメートル セント雨（5％厚さ） 4.3015ミリメートル 25.4705ミリメートル 株（10％厚さ） 4.1890ミリメートル 25.5810ミリメートル 歪み（15％厚さ） 4.0765ミリメートル 25.6955ミリメートル - 一度位置が正しい周波数を得るために、加速と最大速度値を持つ実験を計算されます。サイクル数は、（1 Hzで3時間、例えば 10,800サイクル）に応じて、選択されるべきである。
- 例動的圧縮移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、10％のダイナミックひずみ振幅、1Hz）で（ 図5）
- 動的剪断移動シーケンスプログラム：サイクルの数は、所望の周波数および持続時間（0.5 Hzで3時間、例えば 5,400サイクル）に従って選択されるべきである。
- 例動的剪断移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、0.5625ミリメートル（厚さの25％）は、動的せん断ひずみ振幅、0.5Hz）を（ 図5）。
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結果
装置を20万個の細胞/ mlの軟骨とアガロースゲルシードを使用してテストし、一軸（圧縮）または軸（圧縮及びせん断）機械的荷重の存在下で培養した。一次ブタ軟骨細胞は2-4ヶ月のブタの関節軟骨から分離した。直径5mm及び厚さ1.5mmのサンプルを定義した軟骨細胞培養培地（高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、2.5μgの/ mlの2mlに培養したアムホテリシンB、37、24ウェルプレート中の50μgの/ mlのアスコルビン酸、0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）、プロリン0.4ミリモル）°C、5％CO 2。 10 -7 Mデキサメタゾンおよび10 ng / mlのTGF-β1は、培養の最初の10日間の供給した。サンプルは10から30日の間に3時間/日のためにロードされた。一軸負荷が10％圧縮ピーク·ツー·ピーク振幅から構成され、1Hzの二軸荷重は0.15ミリメートル（10％厚さ）圧縮および0.075から成っmmのせん断ピーク·ツー·ピーク振幅、1 Hzの。動的なひずみ振幅と負荷周...
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ディスカッション
私たちは、移植のために製造された組織工学構造物に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。デバイスは、天然組織の前に又は他の治療後の機械的特性を記述するために設計されたバイオ複合材料のin vitro培養用のバイオリアクターとして、または検査装置として用いることができる。デバイス被験者は24ウェルプレートへの単一の大きな負荷用量の精度（振幅と周波数）と組織培養条件の多種多様なアプリケーションとの二軸機械的負荷に組織構造を設計。
せん断荷重のアプリケーションは、このシステムの設計のための固有の課題の組を提示した。栄養素伝達を最大にするために、構築物は、最初に24ウェルプレートの各ウェル内に閉じ込められた。風袋圧縮歪があること被保険者として、これは、動的圧縮のために問題を提示しませんでしたサンプルプラテン接触が失われていませんでした。せん断ひずみがプロトコルに追加されたとき、しかし、一軸サンプルはプレートの底に沿ってスライドとプラテンといくつかの失わ接触。さらに、軸荷重プロトコールサンプル中に一貫性のないロードを引き起こして、裏返し...
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益がないことを宣言します。
謝辞
この作品は、研究開発、RR＆Dサービス、退役軍人の米国エネルギー省、NIH COBRE 1P20RR024484、NIH K24 AR02128と防衛W81XWH-10-1から0643の部門のオフィスによってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM, 高グルコース, ピルビン酸 | Invitrogen | 11995 | |
| アガロース II 型 | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen 連鎖球菌 グルタミン | Invitrogen | 10378-016 | |
| アムホテリシンB | Invitrogen | 041-95780 | |
| アスコルビン酸 | シグマ | A-2218 | |
| 非必須アミノ酸溶液 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-プロリン | Σ | P-5607 | |
| デキサメタゾン | Σ | D-2915 | |
| 組換えヒトトランスフォーミング成長因子 β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 ロードセル (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| モデル 31 ロードセル (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| シングルチャンネルディスプレイ | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| 2チャンネルステッピングモータコントローラ | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm台形ステッピングモータドライブ (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| 調整可能なキネマティックロケータ (4) | Thorlabs | KL02 | |
| 精密直角プレート | Thorlabs | AP90/M | |
| 垂直取り付けブラケット | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| 1.5 mmおよび0.75 mmスペーサープレートBioRad | #1653312および#1653310 | ||
| 固体アルミニウムブレッドボード | Thorlabs | MB3030 / M | |
| 33-35 | |||
| 16 mm 中空パンチ | Neiko Tools | ||
| 非組織培養処理プレート、24 ウェル、平底 | BD Biosciences 351147 | ||
| プラテン積載用超耐湿ポリスルホン シート | McMaster-Carr | 86735k19 | カスタム加工 |
参考文献
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