ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

サマリー

マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。

要約

自然環境での栄養循環と炭素処理の多くは、微生物が発表した細胞外酵素の活性を介して行われます。従って、これらの細胞外酵素の活性の測定は、このような有機物分解または窒素およびリンの石灰化などのエコシステムレベルプロセスの速度への洞察を与えることができる。環境試料中の細胞外酵素活性のアッセイは、典型的には人工的な比色または蛍光基質にサンプルを曝露し、基質加水分解の速度を追跡することを含む。ここでは、短い時間枠内で多数のサンプルの分析を可能にするこれらの手順のために、マイクロプレートベースの方法を記載している。サンプルを、ディープウェルマイクロプレート·ブロック96ウェルマイクロプレート内で人工的基質と反応させ、酵素活性は、その後、標準的なマイクロプレートReadeのを使用して得られた最終生成物の吸収または蛍光によって決定されるRまたは蛍光光度計。そのようなハイスループットの手順は、空間的に別個の部位又は生態系間の比較を容易にするだけでなく、実質的にサンプルごとに必要な全体的な試薬容量を低減することによりそのようなアッセイのコストを低減するだけでなく。

概要

細菌や真菌などの微生物は、細胞外酵素の産生を介して複雑な有機化合物からの栄養と炭素を得る。これらの酵素は、典型的には、細胞内に取り込まれ得るより小さなサブユニットにポリマーを加水分解する。そのため、生態系のレベルでは、これらの微生物の細胞外酵素は、栄養の石灰化や自然環境の中で発生する有機物分解の多くを担当している。このようなビオヒドロラーゼ（CBH）およびβ-グルコシダーゼなどの酵素は、微生物の取り込みや同化のための利用可能な炭素基材を提供する^1,2グルコースへのセルロースの加水分解を触媒するために一斉にセルロース分解や仕事のために重要である。有機リン酸からの酵素ホスファターゼ放出性無機リン酸基、本質的にリン酸塩を鉱化し、ほとんどの生物³による使用に利用可能にする。例えば、N-アセチル（ナガセ）のような他の酵素は、importanですTキチン分解における微生物の取得⁴用の炭素と窒素の両方を利用できるようにすることができます。

自然環境中の微生物の細胞外酵素活性のアッセイのための手順のいずれかは人工的なp-ニトロフェニル（p個の NP）の使用は、本来の土壌⁵ホスファターゼ活性^を検出するために開発されたアプローチの基板を連結している。このアプローチは、人工基質を適切な酵素によって加水分解されるときに放出される着色最終生成物、p-ニトロフェノールの検出に依存する。 p-ニトロフェノールは、その後、周りの400〜410nmでの吸光度を測定することによって比色定量することができる。この方法は、例えば、日時のNAGase ⁶のような他の酵素を検出するために適用されており、土壌や堆積物^7-9中の微生物細胞外酵素活性を調べる様々な研究で使用されている。

originallた別のアプローチyは^10,11が 4 -メチルウンベリフェロン（MUB）連結された基材を使用する水環境における細胞外グルコシダーゼ活性を評価するために開発された。 （4 - メチルウンベリフェロン）放出最終生成物は、高度に蛍光性であり、460分の360付近の励起/発光の設定で蛍光光度計を用いて検出することができる。 MUB連動人工様々な基材は、P NP-基質比色手順を用いてアッセイすることができるように少なくとも同じ数の酵素（ 例えば 、β-グルコシダーゼ、ビオヒドロラーゼ、長瀬ホスファターゼ）の活性の蛍光測定を可能に用意されています。このようなタンパク質分解ロイシンアミノペプチダーゼのような他の微生物の細胞外酵素は、7 - アミノ-4 - メチルクマリン（COU）リンクされた基質を用いて蛍光定量的にアッセイすることができる。両方MUB-とカップリンクされた基板は、様々な陸上および水生サンプル^12,13中の酵素活性を測定するために使用されている。

これまでの研究では、一行コメントがありますがアイベッド蛍光または比色マイクロプレートは、細胞外酵素活性^14を決定するために近づくと、このようなアッセイを実施する方法の明確なプレゼンテーションが必要とされている。ここでは、比色Pの NP-連結基板アプローチを使用して土壌と堆積物中の蛍光MUB-連結基板技術を用いて、天然水中の細胞外酵素活性の分析のためのハイスループットマイクロプレート法を実施するための手順を示しています。我々は、β-グルコシダーゼ、のNAGaseの活性の測定に注目し、これらの酵素のようなホスファターゼは、それぞれ、炭素、窒素、およびリン循環に接続することができる。しかしながら、ここで説明する手順は、異なる人工基質を用いて他の細胞外酵素の測定に適用することができる。

プロトコル

土壌や堆積物中の細胞外酵素活性の比色分析

1。酵素活性の比色分析用基板及び緩衝溶液の調製

1. 50ミリリットルの0.1M酢酸（2.87ミリリットル500mlの水で氷酢酸）を150 mlの0.1 M酢酸ナトリウム、およびH ₂ Oを200mlの蒸留を混合することによって、50mMの酢酸緩衝液（pH 5.0〜5.5）を調製必要に応じて、0.1M酢酸で5.0〜5.5にpHを調整する。
2. 蒸留H ₂ O中に1 M水酸化ナトリウム（NaOH）の溶液を調製
3. 50 mMの酢酸緩衝液中のPのNP-連結基質溶液を調製する。ホスファターゼをアッセイする50mM酢酸緩衝液中で5 mMのP NP-リン酸を準備し、β-グルコシダーゼは5 mMのP NP-β-グルコピラノシドを準備アッセイするナガセは2 mMのPNP-β-N-acetylglucosaminideを準備アッセイする。無菌15ミリリットルまたは50ml遠心チューブ内のすべての基質溶液を準備します。溶液は2〜3週間、4℃で保存することができる。

2。 Pの NP濃度に吸光度を変換するための標準の決定

1. 50mM酢酸緩衝液中のp-ニトロフェノールの標準溶液を調製する。濃度は、MM 0.025から1の範囲であるべきである。
2. 透明な96ウェルマイクロプレートへの転送各濃度の100μLの3回の反復を。各ウェルに、H ₂ Oを蒸留10μlの1 M NaOHおよび190を添加する。
3. マイクロプレートリーダーを用いて410nmでの記録的吸光度。
4. 0.3による標準曲線で増殖濃度は、300μlの反応体積あたりのマイクロモルのp NPを取得します。 Pの NPのマイクロモル対吸光度の曲線をプロットします。曲線の傾きは、各酵素反応でのp NPの吸光度をμモルに関連するであろう変換係数（C）となる。

3。酵素アッセイを実施

1. 土壌については、concentrで15mlの滅菌遠心管にアッセイされる各試料のスラリーを調製約1グラム/ミリリットル^-1 50mM酢酸緩衝液を使用することのATION。堆積物については、スラリーを簡単にpipettable作るのに十分な酢酸緩衝液を追加します。必要なスラリーの正確な量は、アッセイの酵素の数に応じて異なるが、5ミリリットルの最小を推奨します。渦土壌や堆積物のすべての塊が分散し、最終容量に注意してまで、各スラリー。
2. 再渦各スラリーし、すぐに96ウェルディープウェルブロック（ 図1）上の6ウェルのそれぞれに150μlのピペット。これは、懸濁液中の土壌粒子を維持するために十分に、頻繁にボルテックスすることが重要である。基板制御として機能するために、空のブロックごとに少なくとも2つのウェルを残す。注意：土壌スラリーはヒントを詰まらせる傾向があるので、前にピペッティングをハサミでピペットチップの端をクリップする。アッセイすべき各酵素の1 96ウェルブロックを準備します。
3. ピペットリザーバ内の酢酸緩衝液約5ミリリットルを注ぎ、Lに150μlのバッファーを追加するには、8チャンネルピペッターを使用各試料の2つのウェル（これらは、サンプルバッファコントロールなる）と2つの基板のコントロールとなるウェル（ 図1）はast
4. ピペットリザーバに適切なPのNP-基質溶液を約10ミリリットルを注ぎ、（ 図1）、各サンプルの最初の4つのウェルと2基板制御ウェルに基質溶液150μlを追加するには、8チャンネルピ ​​ペッターを使用しています。反応は、すぐに基質溶液を添加するとして始まり、時間に注意してください。
5. 0.5〜4時間、室温（22℃）で培養する。正確なインキュベーション時間は、活性が試料中のレベルとアッセイされるべき酵素に依存して変化する。長瀬他の酵素は、> 2時間のインキュベーション時間を必要とするのに対し、ほとんどの土壌や堆積物の場合は、ホスファターゼ、β-グルコシダーゼは、0.5〜1.5時間のインキュベーション時間を必要とする。
6. アッセイは、吸光度の読み取りにマイクロプレート透明な96ウェルを準備インキュベートされている。 （ すなわち 、各Eに対する各ディープウェルブロックごとに1マイクロプレートを準備しますnzyme）アッセイした。ピペット10μlの1 M NaOHで、マイクロプレートの各ウェルに蒸留水190μL。注：NaOHを酵素反応を遅くし、NPは、反応中に放出されたpの色を強化し、pHを上昇させる。
7. インキュベーション後、土壌粒子をペレット化し、5分間2,000〜5,000×gで96ウェルブロックを遠心する。
8. ペレットを与えないように注意しながら、各ウェルから100μlのを撤回するマルチチャンネルピペットを使用して、準備明確な96ウェルマイクロプレートに対応するウェルに移す。
9. マイクロプレートリーダーの電源をオンにし、必要なソフトウェアをセットアップします。 410 nmの吸光度を記録。特定のウェルの吸光度はプレートリーダーの直線検出限界を超えている場合、水と再測定値とそのウェル1:1に希釈する。吸光度は依然として高すぎる場合、アッセイは、より短いインキュベーション時間で繰り返されるべきである。

4。サンプルの乾燥質量の決定

1. 各SAMPLのピペット1ミリリットル予め秤量したアルミニウム製パンにEスラリー。
2. 48時間75℃の乾燥炉内の乾燥と比較検討する。スラリーの1ミリリットルの土壌や堆積物の乾燥質量を得るために、この値から、パンの重量を差し引く。酵素アッセイにおいて、各ウェルに添加し、150μlの試料の乾燥質量を決定するために0.15の係数で乗算する。

5。土壌や堆積物の乾燥質量あたりの酵素活性の計算

1. サンプルアッセイ吸光度からサンプル制御吸光度を差し引くことにより、各試料の最終吸光度を計算します。基板のコントロールは高い吸光度（およそ> 0.060）がある場合、また、それらを引きます。
2. μモル時間で酵素活性を算出^-1グラム乾燥質量を^-1方程式から：

酵素活性=最終吸光度/（C xのインキュベーション時間×サンプル乾燥質量）

天然水中の細胞外酵素活性の蛍光分析

酵素活性の蛍光分析用基板、標準、およびバッファソリューション> 1。準備TLE」

1. 無菌に適切な基質を溶解させることによりMUB-連結基板（ 例えば 4-MUB-β-グルコピラノシド、4 - MUB -リン酸、4 - MUB-N-アセチル-β-D-グルコサミニド）の200μMの溶液を調製する（オートクレーブ処理）蒸留15mlの滅菌又はを50ml遠心管中のH ₂ O。光を排除し、使用前に冷蔵庫に保存するためにアルミホイルでチューブを包みます。この方法で保存した場合の基板は、少なくとも1週間は安定であるべきである。
2. 滅菌蒸留H ₂ O中の100μMの4 -メチルウンベリフェロンの原液を作ることでMUB標準を準備するストアは琥珀色、またはアルミホイルにくるまれた瓶の中に冷蔵した。使用直前に、酵素アッセイのために10μMの作業溶液を作るために、滅菌H ₂ O中に1/10、100μMのストック溶液を希釈する。
3. のNaHCO <8.4gを溶解することによって100mMの重炭酸塩緩衝液のストック溶液を調製サブ> 3 1 LH ₂ O、オートクレーブに。酵素アッセイのための5mMの作業溶液を作製するために、必要に応じて、滅菌_を H ₂ Oに、この原液を1/20に希釈する。

2。 96ウェル黒色マイクロプレート上の編成水試料

1. 図2に示した例以下の各酵素のためのマイクロプレートを整理。十分な複製、標準、およびコントロールを可能にこの手順は1 96ウェル黒色マイクロプレート上で最大9水のサンプルのための単一の酵素の活性を測定できることに注意してください。
2. ピペットリザーバーに最初のサンプルの約5ミリリットルを注ぎ、マイクロプレート（S）のカラム1のウェルの全てにμLpipette200する8チャンネルピペッターを使用しています。使用済みのピペットチップを破棄し、列1-9を埋めるために、各試料水のために必要に応じて繰り返します。

3。サンプル、標準、急冷し、基板コントロールの設定

1. 標準試料を考慮して制御を設定サンプルと同じ黒色マイクロプレート（ 図2）のS、基板焼入れ。
2. サンプルコントロールは試料水と重炭酸塩緩衝液を含んでおり、活動の計算に使用されていないが、実験の過程全体の一貫性を読んでデモンストレーションを行います。急冷コントロールは、サンプル水および蛍光タグの標準量からなり、試料水中の蛍光の回折を測定するために使用される。基板と標準コントロールは、基板結合またはそれぞれの標準蛍光タグ、および重炭酸塩緩衝液のどちらかで構成されています。
3. きれいなピペットリザーバーに5 mMの重炭酸塩緩衝液約5ミリリットルを注ぐ。サンプルあたりのサンプルコントロールの2反復ウェルを形成する行DとEでのマイクロプレートウェルに緩衝液をピペット50μlの1〜9。チェンジピペットチップはその後10〜12行を通してウェルに重炭酸塩緩衝液200μlを移すAとH.
4. 李調光またはオフにすることで、周囲の照明を減らす蛍光標準としてGHTSは光に敏感である。
5. きれいなピペットリザーバーに10μMの4 - メチルウンベリフェロンの約5ミリリットルを注ぐ。クエンチサンプルあたりのコントロールと、全体的な標準のコントロールの3回の反復を形成する行GおよびFへのマイクロプレートウェルにピペット50μL行のH 1〜12、およびウェルに1〜9。暗闇の中でマイクロプレートを置くか、MUBの光劣化を低減する不透明な蓋をかぶせどちらか。
6. 蛍光光度計の電源を入れ、セットアップし、必要なソフトウェアを基質を添加する前に必ずお読み準備ができている。注：一部の蛍光光度電球は3分以上のウォームアップ時間が必要な場合があります。
7. きれいなピペットリザーバに適切なMUB-連結基質（ 例えば 4-MUB -リン酸）を約5ミリリットルを注ぐ。各試料の3つの複製アッセイおよび3基板のコントロールを形成するために、1行のBおよびC 1〜9行Aの12を通ってマイクロプレートウェルに50μlのピペット、およびウェルにするために12チャンネルピペッターを使用してください。 ImmediatelYは、蛍光を記録し、4.1に進みます。

4。記録蛍光

1. 直ちにマイクロプレートへの基質添加後の初期の蛍光を読む。蛍光を読んだ後、いずれかの暗いまたはMUBの光劣化を低減するために、不透明な蓋で覆われた中で（22°C）RTでマイクロプレートをインキュベートする。
2. 水サンプル中の最大の潜在的酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、試料内の酵素濃度に依存するであろう。アッセイを完了する前に、これが不明であるため、マイクロプレートは、複数の時間ステップで読み出されなければならない。ある種の酵素のための非常に高い活性を持つサンプルは10分前のピークかもしれないが、通常、1時間にわたって10〜15分間隔で読み取ると、多くの酵素が許容される。
3. 少なくとも1時間、ご指定の時間間隔で、マイクロプレートの蛍光を読み続ける。読書の間、マイクロプレートカバーや暗闇の中を保つようにしてくださいS。

5。水の容量あたりの酵素活性の計算

1. 初期サンプル蛍光（ウェルDおよびE）を意味する、平均最終試料の蛍光（ウェルAC）、平均±標準蛍光（ウェルH10-11）、および平均は対照蛍光を消光（ウェル：各時間間隔で各試料について計算するFG）。
2. 各時間間隔については、ナノモル時間で酵素活性を算出^-1 ml ^-1の式から：

酵素活性=（サンプル平均蛍光 - 初期サンプル平均蛍光）/（（）HRの時間（x）を0.2ミリリットル（標準的な蛍光）×平均/制御蛍光を消光意味（標準的な蛍光/ 0.5モル）×平均）

3. 各時間ステップに対して計算活性値を調べてください。最も高い活性を持つ時間ステップからの最終的な潜在的活性を決定する。活性値が増加し続ける場合は、後の時間ステップが必要になることがあり、活性値が落ちた場合をthrougホウトランのコースは、より短い時間ステップで再度実行してください。最終的な活性は、基質が消費時間^{-1 -1}ミリリットルのナノモルであるが、時間^-1 Lは^-1マイクロモルとして表現するためにスケールアップすることができます。

結果

土壌や水生堆積物は、一般的に粒子の表面上に成長して付着した微生物群集（バイオフィルム）の結果として、細胞外酵素活性のかなりのレベルを持っている。第三の表層堆積物から得られた粒子の大きさによっては、この活動がどのように変化するかを図3に示す図北部ミシシッピ州、米国の順ストリーム。以前の研究では、このストリームからの堆積物の粒子上の細菌のコミュニティは、コミュニティ構造の分子分析に基づいて、三つの異なるグループに分離することができることを示した：0.063ミリメートル粒子は、0.125のそれら、0.25、0.5mmの粒子上のもの、およびそれらの1ミリメートル^と15粒子 。細胞外酵素活性のパターンの分析は、この結論を支持している。ホスファターゼ（ 図3A）で0.125、0.25、0.5mmの粒子に類似しているしかし、p個の NP-連結された基板技術を用いて測定したとき1および0.063ミリメートルの画分にはるかに高い。 O例えば、β-グルコシダーゼ（ 図3B）、ナガセ（...

ディスカッション

土壌や堆積物中の微生物の細胞外酵素の様々な活性を測定することは、栄養無機化と有機物処理¹⁷の速度に有益な洞察を提供することができます。しかし、土壌はそれらの水分レベルで変化させることができるので、土壌の乾燥重量に対して活性を標準化することが重要である。これは単に、酵素活性を測定することを越えて（典型的には2日間の）追加の乾燥工程を必要とする。このように、瞬間的な結果の近くで提供する水試料中の酵素活性のアッセイとは対照的に、土壌や堆積物中の酵素活性の信頼できるアッセイは、数日かかる。いくつかの土壌については、それも乾燥手順以外に、追加のアッシング工程（500℃、典型的には2時間）を必要とする、有機物又は灰分フリー乾燥重量のグラム当たり活性を発現することがより適切であり得る。関係なく、土壌または堆積物の酵素活性の比色アッセイにおいて最も重要な工程は、ディープウェルブロックfからの上清の撤退であるインキュベーション期間の終了時に、遠心分離をollowing。この手順では、吸光度を測定することに依存しているため、最終的なマイクロプレートのいくつかの浮遊土壌粒子であっても存在が誤った結果につながることができます。自体ははるか...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬と材料
>Glacial酢酸			各種サプライヤー
酢酸			各種サプライヤー
水			各種サプライヤー
p-Nitrophenol		Fisher BP612-1	代替品が利用可能
p-ニトロフェニル (pNP)-リン酸	シグマ	N3234	pNP-基板
pNP-β-グルコピラノシド	シグマ	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-アセチルグルコサミニド	Σ	N9376	pNP基板
クリア96ウェルマイクロプレート	フィッシャー	12-563-301	オルタネートが利用可能
96ウェルディープウェルブロック	Costar	3958	オルタネートが利用可能
アルミ製計量パン			様々なサプライヤー
滅菌済み 15ml遠心分離チューブ			様々なサプライヤー
滅菌済み50ml遠心分離チューブ			さまざまなサプライヤー
4-メチルウンベリフェロン		Σ M1381
4-メチルウンベリフェリル (MUB)-リン酸		Σ M8883	MUB基板
4-MUB-グルコピラノシド		Σ M3633	MUB基板
4-MUB-N-アセチルグルコサミニド	Σ	M2133	MUB基板
重曹			各種サプライヤー
黒色 96ウェルマイクロプレート	Costar	3792
ピペットリザーバー			各種サプライヤー
EQUIPMENT
>Centrifuge	Eppendorf	5810R
遠心分離機ローター	Eppendorf	A-4-81	マイクロプレート/ディープウェルブロック用
マイクロプレートリーダー	BioTek	Synergy HT	オルタネートあり
マイクロプレート蛍光光度計	BioTek	FLx 800	タネートあり
8チャンネルピペッター			各種サプライヤー