フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Summary

好中球は、血液中に最も豊富に存在する白血球である。好中球は、このような炎症性サイトカインとアポトーシスの抑制​​の生産などの転写調節機能を有する。これらの関数は、単離核で、フローサイトメトリーによって核内因子の検出および定量化を可能にするここに示す方法で研究することができる

Abstract

好中球は、末梢血中に最も豊富に存在する白血球である。これらの細胞は、このように微生物を侵略に対する最初の防衛線となって、炎症や感染部位に最初に表示されています。好中球は、貪食作用、溶菌酵素の放出、活性酸素種の産生などの重要な抗菌機能を有する。これらの重要な防御機能に加えて、好中球などの炎症性サイトカインおよびアポトーシスの阻害の生産などの感染症に対応して他のタスクを実行します。サイトカインは、感染をクリアに役立つ他の白血球をリクルートする、アポトーシスの阻害は、好中球が感染部位で長生きすることができます。これらの機能は、転写レベルで調節されている。好中球は短命の細胞であるため、全く効率が存在しないためしかし、これらの細胞における転写調節応答の研究は、従来のレポーター遺伝子のメソッドで実行することはできません好中球のトランスフェクションのためcientテクニック。ここでは、フローサイトメトリーによって単離し、免疫標識核における核内因子の検出および定量化を可能にするシンプルで効率的な方法を提示する。我々は、ヒト末梢血から純粋な好中球を分離するための手法について説明抗受容体抗体で、これらの細胞を刺激し、隔離し、immunolabel核、フローサイトメトリーで核を分析します。メソッドが成功した好中球および他の細胞型から核内にNF-κBおよびエルク-1核内因子を検出するために使用されています。したがって、この方法では、種々の細胞型から単離核内転写因子の活性を分析するためのオプションを表します。

Introduction

好中球は末梢血¹に最も豊富に存在する白血球である。炎症や感染症、好中球の間に、彼らは防衛²の最初の行として働く場所患部に出現する最初の細胞である。好中球は貪食作用、活性酸素種の産生、脱顆粒によって溶菌酵素の放出、および^{4,5 -}炎症性サイトカインの産生を含むいくつかの抗菌メカニズムの^3を所有^{しています} 。好中球は急速に様々な細胞表面の受容体からのシグナル伝達を介して活性化取得短命な細胞である。好中球は、その短い寿命のため、端末の細胞と考えられ、炎症過程⁶の間に活性化されない限り、彼らはアポトーシスを受けるので、それは、彼らはまた、特定の遺伝子の転写のレベルを変更することにより、それらの表現を変更できることが明らかになってきたが。サイトカイン⁵と^7,8アポトーシスの阻害の生産は、i 2アール好中球の転写レベルで調節mportant活性化に依存した細胞機能。核因子κB（NF-κB）は、サイトカイン産生⁴の転写制御で、様々な種類の細胞における細胞生存とアポトーシス^9-11の調節に関与している。

核因子の活性化につながるシグナル伝達経路は、通常、レポーター遺伝子アッセイにより、または電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって研究されている。好中球は短命の細胞であ....

Protocol

1。ヒトの血液から好中球の分離（PMN）

1. 抗凝固剤としてヘパリン（10 U / ml）で約20mlヒトの血液を使用します。血液はvenopunctureによって成人の健康なボランティアから採取した。 UNAM - 全ての実験は、のInstituto de InvestigacionesBiomédicasにおける生命倫理委員会の承認の下で行われた。
2. 15mlコニカル遠心チューブにPBSで6％デキストランT500の2ミリリットルを入れて、血液の10ミリリットルを追加します。チューブを反転することによって2倍または3倍を混ぜて、それが赤血球沈降を可能にするために45分間放置します。
3. 新鮮な15mlコニカル遠心管に5ミリリットルのFicoll-Paqueは置く。
4. 赤血球沈降の上方に形成された白血球血小板血漿を取り、慎重に第2層を形成するのFicoll-Paqueの上に移します。 2フェーズがあることを確認してください。
5. 4℃で20分間、516×gで遠心分離し、遠心分離後、血漿とのFicoll-Paqueの相間での単核細胞の層がある。ねーutrophilsは、チューブの下部にあります。
6. 上清を取り除き、ラックに対してチューブをタップして、細胞ペレットを壊し、風邪の10ミリリットル（4℃）、PBS（注）追加することで、細胞を再懸濁する。ピペッティングにより細胞を再懸濁し、これがあまりにもあ....

Results

ここに記載の精製方法は、通常は95％（ 図1A）を超える純度を有する非刺激好中球（PMN）を提供しています。隔離されたPMNはその後、特定のモノクローナル抗体で架橋する特定の受容体によって刺激することができる。我々は、Fc受容体とインテグリン（ 図1B）を介してPMNを刺激してきた。一度刺激、PMNを溶解し、核を高収率で分離されています。核は、そのような特異的な抗体との核因子κB（NF-κB）、（ 図1B）などの特定の核因子に対して免疫標識されています。

核は簡単にドットプロット（ 図2A）とフローサイトメーターにそのままPMNの異なる集団として認識させることができます。休んPMNにおけるNF-κBの基底レベルは細胞核（ 図2B）で発見されます。架橋β1インテグリンによる刺激時には、NF-κBは核とこのincremへ移行している核のNF-κBでENTは、蛍光（ 図2B）の増加として.......

Discussion

ここに記載の精製方法は、短時間で95％（顕微鏡観察により評価）、より高い純度を持つ非刺激好中球の分離（PMN）が可能になります。後者は完全に溶解されていない場合、時には好中球は、赤血球によって汚染することができます。赤血球及びPMNを簡単にフローサイトメトリーによって異なる細胞集団として区別することができるので、これは通常、技術に影響を与えません。隔離されたPMNはその後、特定のモノクローナル抗体で架橋する特定の受容体によって刺激することができる。実際には、PMNは、薬理学的手段によって、または様々な基材または他の細胞への接着によって刺激することができる。ここで紹介する方法は、細胞は実質的に関連する生物学的刺激によって活性化された後、PMN核における核内因子の変化につながるシグナル伝達経路の解析に使用できます。

PMNが刺激されると、この論文に記載された方法は、迅速かつefficiが可能免疫蛍光法およびフローサイトメトリー分析によるNF-κBのこれらの核中の核のと検出のための耳鼻咽喉科浄化、。特定の受容体のPMNの刺激後、細胞質におけるNF-κBは、その阻害剤IκBから解放された.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
>Heparin	PiSA (Mexico)
Dexrick T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
塩化ナトリウム	Σ	S7653
リン酸ナトリウム 一塩基性	Sigma	S9638
ナトリウム二塩基性	Sigma	S9390
ウシ血清アルブミン(BSA)	ΣA2153	Cohn画分V
HEPES	シグマ	H3375
塩化カリウム		P9541
マグネシウム無水シ	グマ	M8266
<サブ>DL-ジチオスレイトール (DTT)	Σ	D9163
トリパンブルー (0.4 % 溶液)	Σ	T8154
パラホルムアルデヒド	Σ	P6148
トリトン X-100	Σ	X100
ウシ胎児血清 (FBS)	GIBCO	10437-028
モノクローナル抗体 IV.3	メダレックス (ニュージャージー州アナンデール)	025-1	ヒト特異的抗FcRII(CD32)
モノクローナル抗体3G8	Medarex(ニュージャージー州アナンデール)	028-2	ヒト特異的抗FcRIII(CD16)
モノクローナル抗体 TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute(マサチューセッツ州ボストン)	マーティン・ヘムラー博士より寄贈	ヒト特異的抗薬-β1インテグリン(CD29)
モノクローナル抗体IB4	カリフォルニア大学サンフランシスコ	エリック・J・ブラウン博士より寄贈	ヒト特異的抗薬-β2インテグリン(CD18)
F(ab')2ヤギ抗マウスIgG	カペル(オーロラ、オハイオ州)	55468
FITC標識F(ab')2ヤギ抗マウスIgG	カペル(オーロラ、オハイオ州)	55522
FITC標識F(ab')2ヤギ抗ウサギIgG	カペル(オーロラ、オハイオ州)	55665
NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	ウサギポリクローナル抗体
抗NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml 遠心分離管	Corning	430791
50-ml 遠心分離管	Corning	430291
遠心分離機, Sorvall 卓上	Dupont Instruments	RT 6000D
pH メーター	コーニング	340
ピペットマンピペット P-20	ギルソン	F123600
ピペットマンピペット P-200	ギルソン	F123601
ピペットマンピペット P-1000	ギルソン	F123602
血球計算盤	フィッシャー サイエンティフィック	0267110
顕微鏡	ニコン	エクリプス E600
倒立顕微鏡	Nikon	TMS
ウォーターバスインキュベーター	Fisher Scientific	2IS-M
微量遠心機	Eppendorf	5414C
微量遠心機	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur