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方法論記事

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

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DOI：

10.3791/50425

⸱

2016年11月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

この記事について

サマリー

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。

要約

免疫組織化学（IHC）は、高度に、特定の信頼性と魅力的なタンパク質の可視化を提供します。 IHCベースの多色標識の正しい性能および解釈は、中枢神経系（CNS）のような高脂肪含有量を有​​する組織中の標的タンパク質との間の相互関係を評価するために利用される場合は特に、困難です。

我々のプロトコルは、特にラットCNSおよび神経炎症によって影響末梢リンパ節（LN）の両方の構造および可溶性タンパク質の検出のために調整し、標準的な免疫標識技術の改良を表します。それにもかかわらず、さらなる改変の有無にかかわらず、我々のプロトコルはそうであってもここで紹介する以外の臓器や種で、他の関連するタンパク質標的の検出のために使用することができます。

概要

高度なハイスループットの使用にもかかわらずmethylome、トランスクリプトームまたはプロテオームさえレベルで実行解析、免疫染色は、組織試料、細胞培養物又は細胞塗抹標本に直接タンパク質検出のための黄金の標準のままです。局在/分布パターンを明らかにすることによって、免疫組織化学（IHC）は、相対比と標的タンパク質の地形的相互関係を評価し、さらにそれらの生物学的活性を示すことができます。したがって、IHCは広く、診断、治療の評価のために、 例えば 、臨床研究のためなど病気のメカニズム、動物モデルにおける機能と表現型の変化の研究を利用しています

基本的に組織学、病理学、生化学および免疫を備え、IHCが大幅に蛍光標識した抗体は感染組織1に肺炎球菌抗原を同定するために初めて使用された1941年以来進めてきました。 VIHCによる細胞製品およびコンポーネントのisualizationは、その特定の抗原（Ag）からに対する抗体（ABS）の結合に基づいています。フルオロフォアタグ付けされた抗体を使用するほかに、免疫反応はまた、ペルオキシダーゼ2,3またはアルカリホスファターゼ4のような酵素を使用して可視化することができます。放射性標識は、オートラジオグラフィーによって可視化しながら、さらに、金コロイドタグ抗体5は 、光と電子顕微鏡の両方により特異的な抗原-抗体相互作用を検出するために使用されます。

Agを抗体の免疫反応は、直接的および間接的な方法によって検出することができます。それは直接標識一次Absの6を使用していますように直接的な方法は、より速く、より簡単な本質的です。しかし、感度の大幅な不足のためには、間接的な方法は、直接のものに好適です。二段階の間接検出手順は、最初のように、非標識一次腹筋を必要とし、第二層7として、主要な腹筋に対して向けられた二腹筋標識。信号増幅は、さらに二次抗体に結合する酵素 - 結合された第三抗体（三段間接法）を含むことによって達成することができます。一般的に使用される間接的な検出方法は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（PAP）です。あるいは、アルカリホスファターゼantialkalineホスファターゼ（APAAP）複合体ではなく、PAP法を用いることができます。特に、アルカリホスファターゼ（AP）メソッドは、免疫ペルオキシダーゼ法4よりもさらに敏感であるように思われます。アビジン - ビオチン複合体（ABC）法は、標識アビジン - ビオチン複合体（LAB）のいずれかとの組み合わせで、ビオチン化二次抗体を使用し、またはストレプトアビジン - ビオチン複合体（SLAB）標識しました。検出感度はさらにペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ8で標識したアビジンを含むことによって増大させることができます。使用中の他の検出方法は、ポリマー標識、チラミン増幅および免疫ローリングサークル9です。特に、別の検出方法は、同じ組織内の複数のAgの検出のために組み合わせることができここに提示1978年4。同時二重免疫染色で初めて報告されたサンプルは、それぞれ、ペルオキシダーゼ結合し、AP結合二次抗体を用いて、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN組織切片で行いました。信号は、それぞれ、3,3'- diaminobencidine（DAB）色素原とファーストブルー（FB）APAAP複合体を用いて可視化しました。

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プロトコル

倫理的なステートメント
本研究は、N15 / 10とによって承認されたN65 / 10、、倫理的な許可N338 / 09下の実験動物のためのスウェーデン国家委員会と欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）のガイドラインに従って行われます北ストックホルムの動物倫理委員会。

1.組織標本

  1. 灌流＆固定
    1. 左心室を介しtranscardial灌流を行うためにイソフルランで動物を麻酔。 0.1 M PBS（PFA）中の4％パラホルムアルデヒドに続く血液成分を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて血管系のリンスを開始します。
    2. PFAに浸漬することにより、解剖脳、脊髄及び末梢LN組織を固定します。 4℃で24時間後、さらに処理するまで4℃でPBSにPFAから組織や店舗を転送します。あるいは、商業PBSに、250ミリリットルS＆で9グラムのNaClを溶解＃246; rensenバッファと750ミリリットルを脱イオン水（のdH 2 O）を追加します。 0.2 Mソレンセン緩衝液（pH7.4）を調製することは2.5 L の dH 2 O中に13.8グラムのNaH 2 PO 4×1H 2 Oおよび71.2グラムのNa 2 HPOのx 2H 4 2 Oに溶解します
  2. 脱水＆埋め込みます
    1. カミソリの刃を使用して、約5ミリメートルの厚さの部分に組織を切断します。
    2. キシレン、最後にパラフィン（ 表1）、続いて組織テックVIP真空浸潤プロセッサ（エタノールの上昇濃度に浸漬に基づく標準的な手順を使用して、組織の硬化処理（脱水）を開始します。
    3. 金型内に組織を置き、「パラフィンブロック」を形成するために、試料周辺の流動パラフィン中に注ぎます。長期保存は、室温（RT）が必要です。しかし、セクショニングの前に、 例えば 、ブロックを冷却するために4℃で（O / N）で一晩推奨されます。

2.セクショニング

  1. ナイフを横切って前後に移動することができる、スレッジミクロトームの固定ホルダーにパラフィンブロックを配置します。ブロックとミクロトームナイフ（すなわち、ナイフの幾何学的形状に依存するだけでなく、切削速度および技術上の）間の最適な角度を調整します。
  2. パラフィンブロックから5μm厚断面 - 3をカット。
  3. 水容器の中にだけ切断した断面を転送し、スライドガラス上に水から、その後、それをマウントします。
  4. 残留水および潜在的な気泡を除去するためにペーパータオルに対して慎重に取り付けられた部分を押してください。商業的にプレコーティングされた接着剤ガラススライドをお勧めしますが。
  5. 60°C - ドライは50にストーブに時間のカップルのためのスライドをマウントしました。

3.脱パラフィン（再水和＆内因性ペルオキシダーゼブロッキング）

  1. スライドを浸し2倍キシレン（あるいはキシレン代替品へXEM-200）、毎回15から20」。
  2. 99％エタノールですすいでください。
  3. 内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、0.25％過酸化水素を含むメタノール溶液に30 'のためのセクションをインキュベートします。
  4. 蒸留水で終わる、増加水分含量（99％、70％エタノールを使用して再水和を継続します。
  5. この点からカバーの装着までのセクションでは、湿った保たする必要がスリップ。

4.抗原回復

  1. （EDTA緩衝原液は、1.21グラムトリスおよび50ミリリットルのdH 2 Oに溶解した0.37グラムのEDTAが含まれている60のための抗原回復溶液（この場合はEDTA pH8.5の緩衝液）」のスライドを沸騰するための蒸し器を使用してください。作業を準備します47.5ミリリットルのdH 2 O中での溶液希薄2.5ミリリットルのEDTA原液）。
  2. 約室温でのスライドをクールダウン。 1時間してから3すすぎ - トリスで5倍は0.05 Mトリス及び0.15MのNaClからなる（TBSは、代わりにPBSを使用）緩衝生理食塩水; pHを7.5に調整のwi第HClです。あるいは、商業TBSを使用します。

5.非特異的結合部位をブロックします

  1. 非特異的なバックグラウンド反応を回避するために、10％ウシ胎児血清（FCS）、90％DAKO緩衝液を含有するブロッキング溶液中で30 '室温で切片をインキュベートします。

6.ダブル免疫標識：プライマリ腹筋との同時インキュベーション

  1. ブロッキング溶液中で一次抗体の必要量を希釈し、O / Nで4℃でインキュベートします。 （; 1 ED1：1,000）α-CD68またはα-IBA1（Aif1、1：1,000）、またはα-CD8α（オックス-8; 1：200）：;二重免疫染色のためにα-エオタキシン（300 1 CCL11）を組み合わせ。
  2. （代替的に10倍希釈したDAKOバッファを使用）TBSバッファーで3〜5倍のスライドを洗浄します。
  3. ブロッキング溶液中で、室温で1時間インキュベートする：二次抗体の必要量（200ビオチン化抗ヤギおよびAP結合抗マウス、両方1）を希釈します。
  4. （私たちをTBS緩衝液で5倍 - スライド3をすすぎEは、代替的に10倍）は、DAKO緩衝液に希釈しました。
  5. RTでの1時間ブロッキング溶液で希釈したアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（HRP）でスライドをインキュベートします。
  6. TBS緩衝液で5倍（あるいは10倍希釈DAKOバッファを使用） - スライド3をすすいでください。

7.可視化

  1. 結合したAP標識二次抗体の可視化
    1. 1リットルのdH 2 O 12.1グラムのトリスを溶解し、0.1M Tris-HCl緩衝液を調製し、HClを用いによってpHを調整します。 1 Mレバミゾール溶液を調製するために同一のTris-HCl緩衝液を使用します。 dH 2 O中で新鮮に4％のNaNO 2溶液を準備
    2. ファーストブルー（FB）基板（1標準的なガラスキュベットに必要なボリュームが）ガラス管に312.5μlのDMF中の6.25mgのナフトール-AS-MXリン酸を溶解し、予め温め50mlに攪拌の50ミリリットル（37を取得するには°C）のTris-HCl緩衝液。 312.5μlの2 Nに12.5 mgのFB RR塩を溶解するためにHClが以前prepaの312.5μlを添加します赤の4％のNaNO 2溶液と予め温めトリス-HCl緩衝液の同じ50 mlの中に混合物を攪拌します。黄色の液体が透明になるまで軽く振ると、最終的に先に調製した1 Mレバミゾール溶液を77μlを添加します。ろ液を混合して得られたガラスキュベットに入れスライド上に注ぎます。
    3. 37℃でのインキュベーションを開始し、約光学顕微鏡下でのプロセスを開発して制御します。すべての15から30分。ファジー回した場合は、新鮮な混合物とFB液を交換してください。
    4. PBSバッファに続いてTBSバッファーと転送と5倍 - スライド3を洗い流します。
  2. 結合したビオチン化二次抗体の可視化
    1. DABは、/ H 2 O 2 49ミリリットルのPBSで1ミリリットルDABストック溶液（1mlのPBSあたり25ミリグラムのDAB）を希釈することにより、現像液を準備します。注ぐ前のセクションに16.5μlのH 2 O 2、ろ液を追加します。
    2. 眉を沈殿させるに色素原DABの変換n個の顔料は即時にすることができます。 （でも数秒より長いインキュベーションが高いバックグラウンドを上げ、特定の信号をマスクすることができる）、光学顕微鏡下で現像処理を制御します。
    3. 褐色顔料の沈殿物の強度は、あるいは5 'の2％硫酸銅と、0.9％のNaClからなる溶液中でインキュベートすることによって向上させることができます。
    4. スライド3をすすぎ- PBSで5倍、最終的にのdH 2 Oで、代わりに水道水を使用しています。
    5. カバーは、水性GelTolマウンティング培地を使用することにより、水から直接スリップしてスライドをマウントします。気泡を作成しないでください。
    6. 例えば、O / N、4℃で、封入剤の完全な乾燥を可能にします。ストアは、RT上でスライドを乾燥させました。
1。 ％エタノール 20 ' 40°C
2。 ％エタノール 60＆＃39; 40°C
3。 ％エタノール 90 ' 40°C
4。 ％エタノール 60 ' 40°C
5。 ％エタノール 90 ' 40°C
6。 ％エタノール 60 ' 40°C
7。 ％エタノール 90 ' 40°C
8。 ％エタノール 120 ' 40°C
9。 キシロール 30 ' 40°C
10。 キシロール 60 ' 40°C
11。 パラフィン 60 ' 60°C
12。 パラフィン 60 ' 60°C
13。 パラフィン 60 ' 60°C
14。 パラフィン 120 ' 60°C

組織-Tek社のVIP真空浸透プロセッサによって 表1 組織処理。

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結果

二重免疫染色（共染色）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN切片で行いました。 3-5ミクロン厚の組織切片は、スレッジミクロトームを用いて切断し、プレコーティングされた接着剤のガラススライド上にマウントされ、その後、以前10,11,12に記載のように処理しました。簡潔には、組織の再水和および内因性のペルオキシダーゼの不活性化を脱パラフィン後、切片を、非特異的結合部位を除去するブロッキング工程に続いて、抗原回復処理を行いました。 ⅱ）CCL11 / ED1及びiii）CCL11 / CD8、ⅰ）CCL11 /伊庭-1：同時染色は、以下の組み合わせで行いました。各同時染色のために使用される主要なABSが彼らの同時インキュベーションを有効にして2つの異なる種（それぞれ、ヤギ、マウス、）、で育ちました。イバ-1、ED1およびCD8ながらCCL11は、褐色のペルオキシダーゼ反応生成物によって可視化した、青AP信号により可視化しました。

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ディスカッション

標準的なIHC手順は、多くの場合、一般的に豊富な経験だけでなく、「試行錯誤」アプローチを意味し、最適な結果を得るために、具体的な調整を必要とします。組織標本からターゲットの可視化まで、プロトコルのほぼ各ステップを個別に最終的な結果を改善するために修飾を設計するために行ってもよいです。ここで紹介する二重染色プロトコルは、特に神経炎症の影響を受け、ホルマリン固定、パラフィン包埋したラットCNSおよびLN組織切片における私たちの目的の標的タンパク質間の相互関係を評価するための調整ターゲットとIHCベースのタンパク質を例示しています。このように、IHCの技術を学ぶためのチュートリアルとしてだけでなく、より高度な試験のためのインスピレーションの源として使用することができます。しかし、提示され、ここよりも、および/または他の組織中の他のタンパク質を標的とするため、このプロトコルの単なる再生は次善の結果を生成する可能性があることに留意すべきです。

CCL11は、コンジェニックラット系統10のCNSにおけるそれぞれのmRNAレベルのアップレギュレーションを示し...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

彼らの指導とサポートに対して、ハンス・ラスマンとヤン・バウアーに感謝します。また、優れた技術支援を提供してくださったKatalin Benedek氏と、批評的および言語的な評価を提供してくださったCaroline Westerlund氏にも感謝します。

この研究は、バイオジェン・アイデック、ウェナー・グレン財団、スウェーデン研究評議会、スウェーデン神経障害者協会、スウェーデン脳財団、EU 6THフレームワークEURATools (LSHG-CT-2005-019015)、ニューロプロミス (LSHM-CT-2005-018637) からの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
>イソフルラン（イソフルラン）:1-Chlor-2,2,2-トリフルオロエチル（ジフルオロメチルエーテル〉 2-Chlor-2-（ジフルオロメトキシ)-1,1,1-トリフルオレタン％ ）C3H2ClF5O)Baxter1001936060眼照射.おそらく生殖能力に影響を与え、子宮内の赤ちゃんにダメージを与えます。適切に装備された麻酔環境でのみ投与してください。.
塩化ナトリウム(NaCl)メルク1.0604
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、錠剤Sigma-AldrichP4417
パラホルムアルデヒド(OH(CH2O)nH(n = 8-100))、1x PBSApl pharma34 24 28健康被害。腐食 性。燃えやすい。急性毒性。
エタノール ≥99.5%、絶対(CH<サブ>3CH<サブ>2OH)シグマ-アルドリッチ459844-1L可燃性。
キシレン(キシレン、組織学的グレード;C<サブ>6H<サブ>4(CH<サブ>3)<サブ>2グマ・アルドリッチ534056フラマブル。急性毒性。
Histo-Comp Paraffin WaxTissue-TekV0-5-1001
接着顕微鏡スライドStarfrostMIC-1040-W
キシロール代替品 XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200呼吸器感作。発癌性。
-CD8 (Ox-8) マウス抗ラット、一次抗体AbD SerotecMCA48G
&-Iba1 (AIF1) マウス抗ラット、一次抗体MilliporeMABN92
&-CD68 (ED1) マウス抗ラット、一次抗体AbD SerotecMCA341R
&α;-eotaxin C-19 (CCL11) ヤギ抗ラット、一次抗体Santa Cruz BTSC-6181
アルカリホスファターゼ (AP) 標識二次抗体デンマーク ダコパッツD0314
ビオチン化二次抗体アマシャム バイオテックRPN1025
アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体 (HRP) シグマ-アルドリッチA3151
ナフトール AS-MX リン酸 (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1G急性毒性。
ファストブルーRRソルト、アゾイックジアゾ No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
塩酸レバミゾール (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742急性毒性。
3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB発色剤)DAKOS3000非常に可燃性です。毒性。
硫酸銅(CuSO4)Merck1.02791急性毒性。環境ハザード。
GelTol 水性実装媒体サーモエレクトロンコーポレーション230100
過酸化水素、30% (H2O2)Merck107210急性毒性。
メタノール(CH3OH)Fluka65543急性毒性。呼吸器感作。発癌性。可燃 性。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、TRIS塩基(C4H11NO3)AppliChemA1379皮膚および眼の刺激。
トリス緩衝生理食塩水(TBS)、錠剤Sigma-AldrichT5030
リン酸水素ナトリウム二水和物 (Na2HPO4 x 2H2O)メルク1.0658
リン酸二水素ナトリウム一水和物 (NaH2PO4 x 1H2O) メルク1.06346
子牛胎児血清 (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKOS30062-8 °Cで保存する必要があります。Cは細菌の増殖を抑制します。泡立ちを避けてください。
N、N-ジメチルホルムアミド;DMF (C3H7NO)Fluka40250可燃性。急性毒性。
グラスカバースリップ24 x 36 mm Menzel-GLäserBB024036A1
塩酸、濃度 (HCl)Sigma-Aldrich30721腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。
塩酸溶液容積測定、2 M HCl (2 N)Fluka71826腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。
亜硝酸ナトリウム、ReagentPlus、≥99.0% (NaNO2)Sigma-AldrichS2252酸化剤。毒性。環境に危険です。
エチレンニチリロテトラ酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA;C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454経口暴露は、生殖および発達への影響を引き起こす可能性があります。
Equipment
Tissue-TekV.I.P 真空浸透プロセッサSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome ハッカー機器
家庭用食品スチーマー BraunMultiGourmet FS 20
光学顕微鏡 Leica Polyvar 2
の4%シ

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ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析
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