ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
免疫組織化学（IHC）は、高度に、特定の信頼性と魅力的なタンパク質の可視化を提供します。 IHCベースの多色標識の正しい性能および解釈は、中枢神経系（CNS）のような高脂肪含有量を有する組織中の標的タンパク質との間の相互関係を評価するために利用される場合は特に、困難です。
我々のプロトコルは、特にラットCNSおよび神経炎症によって影響末梢リンパ節（LN）の両方の構造および可溶性タンパク質の検出のために調整し、標準的な免疫標識技術の改良を表します。それにもかかわらず、さらなる改変の有無にかかわらず、我々のプロトコルはそうであってもここで紹介する以外の臓器や種で、他の関連するタンパク質標的の検出のために使用することができます。
概要
高度なハイスループットの使用にもかかわらずmethylome、トランスクリプトームまたはプロテオームさえレベルで実行解析、免疫染色は、組織試料、細胞培養物又は細胞塗抹標本に直接タンパク質検出のための黄金の標準のままです。局在/分布パターンを明らかにすることによって、免疫組織化学（IHC）は、相対比と標的タンパク質の地形的相互関係を評価し、さらにそれらの生物学的活性を示すことができます。したがって、IHCは広く、診断、治療の評価のために、 例えば 、臨床研究のためなど病気のメカニズム、動物モデルにおける機能と表現型の変化の研究を利用しています
基本的に組織学、病理学、生化学および免疫を備え、IHCが大幅に蛍光標識した抗体は感染組織1に肺炎球菌抗原を同定するために初めて使用された1941年以来進めてきました。 VIHCによる細胞製品およびコンポーネントのisualizationは、その特定の抗原（Ag）からに対する抗体（ABS）の結合に基づいています。フルオロフォアタグ付けされた抗体を使用するほかに、免疫反応はまた、ペルオキシダーゼ2,3またはアルカリホスファターゼ4のような酵素を使用して可視化することができます。放射性標識は、オートラジオグラフィーによって可視化しながら、さらに、金コロイドタグ抗体5は 、光と電子顕微鏡の両方により特異的な抗....
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プロトコル
倫理的なステートメント
本研究は、N15 / 10とによって承認されたN65 / 10、、倫理的な許可N338 / 09下の実験動物のためのスウェーデン国家委員会と欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）のガイドラインに従って行われます北ストックホルムの動物倫理委員会。
1.組織標本
- 灌流＆固定
- 左心室を介しtranscardial灌流を行うためにイソフルランで動物を麻酔。 0.1 M PBS（PFA）中の4％パラホルムアルデヒドに続く血液成分を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて血管系のリンスを開始します。
- PFAに浸漬することにより、解剖脳、脊髄及び末梢LN組織を固定します。 4℃で24時間後、さらに処理するまで4℃でPBSにPFAから組織や店舗を転送します。あるいは、商業PBSに、250ミリリットルS＆で9グラムのNaClを溶解＃246; rensenバッファと750ミリリットルを脱イオン水（のdH 2 O）を追加します。 0.2 Mソレンセン緩衝液（pH7.4）を調製することは2.5 L の dH 2 O中に13.8グラムのNaH 2 PO 4×1H 2 Oおよび71.2グラ....
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結果
二重免疫染色（共染色）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN切片で行いました。 3-5ミクロン厚の組織切片は、スレッジミクロトームを用いて切断し、プレコーティングされた接着剤のガラススライド上にマウントされ、その後、以前10,11,12に記載のように処理しました。簡潔には、組織の再水和および内因性のペルオキシダーゼの不活性化を脱パラフィン後、切片を、非特異的結合部位を除去するブロッキング工程に続いて、抗原回復処理を行いました。 ⅱ）CCL11 / ED1及びiii）CCL11 / CD8、ⅰ）CCL11 /伊庭-1：同時染色は、以下の組み合わせで行いました。各同時染色のために使用される主要なABSが彼らの同時インキュベーションを有効にして2つの異なる種（それぞれ、ヤギ、マウス、）、で育ちました。イバ-1、ED1およびCD8ながらCCL11は、褐色のペルオキシダーゼ反応生成物によって可視化した、青AP信号により可視化しました。
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ディスカッション
標準的なIHC手順は、多くの場合、一般的に豊富な経験だけでなく、「試行錯誤」アプローチを意味し、最適な結果を得るために、具体的な調整を必要とします。組織標本からターゲットの可視化まで、プロトコルのほぼ各ステップを個別に最終的な結果を改善するために修飾を設計するために行ってもよいです。ここで紹介する二重染色プロトコルは、特に神経炎症の影響を受け、ホルマリン固定、パラフィン包埋したラットCNSおよびLN組織切片における私たちの目的の標的タンパク質間の相互関係を評価するための調整ターゲットとIHCベースのタンパク質を例示しています。このように、IHCの技術を学ぶためのチュートリアルとしてだけでなく、より高度な試験のためのインスピレーションの源として使用することができます。しかし、提示され、ここよりも、および/または他の組織中の他のタンパク質を標的とするため、このプロトコルの単なる再生は次善の結果を生成する可能性があることに留意すべきです。
CCL11は、コンジェニックラット系統10のCNSにおけるそれぞれのmRNAレベルのアップレギュレーションを示し.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
彼らの指導とサポートに対して、ハンス・ラスマンとヤン・バウアーに感謝します。また、優れた技術支援を提供してくださったKatalin Benedek氏と、批評的および言語的な評価を提供してくださったCaroline Westerlund氏にも感謝します。
この研究は、バイオジェン・アイデック、ウェナー・グレン財団、スウェーデン研究評議会、スウェーデン神経障害者協会、スウェーデン脳財団、EU 6THフレームワークEURATools (LSHG-CT-2005-019015)、ニューロプロミス (LSHM-CT-2005-018637) からの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | |||
| >イソフルラン（イソフルラン）:1-Chlor-2,2,2-トリフルオロエチル（ジフルオロメチルエーテル〉 2-Chlor-2-（ジフルオロメトキシ)-1,1,1-トリフルオレタン％ ）C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | 眼照射.おそらく生殖能力に影響を与え、子宮内の赤ちゃんにダメージを与えます。適切に装備された麻酔環境でのみ投与してください。. |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | メルク | 1.0604 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、錠剤 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| パラホルムアルデヒド(OH(CH2O)nH(n = 8-100))、1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | 健康被害。腐食 性。燃えやすい。急性毒性。 |
| エタノール ≥99.5%、絶対(CH<サブ>3CH<サブ>2OH) | シグマ-アルドリッチ | 459844-1L | 可燃性。 |
| キシレン(キシレン、組織学的グレード;C<サブ>6H<サブ>4(CH<サブ>3)<サブ>2 | グマ・アルドリッチ | 534056 | フラマブル。急性毒性。 |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| 接着顕微鏡スライド | Starfrost | MIC-1040-W | |
| キシロール代替品 XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | 呼吸器感作。発癌性。 |
| -CD8 (Ox-8) マウス抗ラット、一次抗体 | AbD Serotec | MCA48G | |
| &-Iba1 (AIF1) マウス抗ラット、一次抗体 | Millipore | MABN92 | |
| &-CD68 (ED1) マウス抗ラット、一次抗体 | AbD Serotec | MCA341R | |
| &α;-eotaxin C-19 (CCL11) ヤギ抗ラット、一次抗体 | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| アルカリホスファターゼ (AP) 標識二次抗体 | デンマーク ダコパッツ | D0314 | |
| ビオチン化二次抗体 | アマシャム バイオテック | RPN1025 | |
| アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体 (HRP) | シグマ-アルドリッチ | A3151 | |
| ナフトール AS-MX リン酸 (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | 急性毒性。 |
| ファストブルーRRソルト、アゾイックジアゾ No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| 塩酸レバミゾール (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | 急性毒性。 |
| 3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB発色剤) | DAKO | S3000 | 非常に可燃性です。毒性。 |
| 硫酸銅(CuSO4) | Merck | 1.02791 | 急性毒性。環境ハザード。 |
| GelTol 水性実装媒体 | サーモエレクトロンコーポレーション | 230100 | |
| 過酸化水素、30% (H2O2) | Merck | 107210 | 急性毒性。 |
| メタノール(CH3OH) | Fluka | 65543 | 急性毒性。呼吸器感作。発癌性。可燃 性。 |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、TRIS塩基(C4H11NO3) | AppliChem | A1379 | 皮膚および眼の刺激。 |
| トリス緩衝生理食塩水(TBS)、錠剤 | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| リン酸水素ナトリウム二水和物 (Na2HPO4 x 2H2O) | メルク | 1.0658 | |
| リン酸二水素ナトリウム一水和物 (NaH2PO4 x 1H2O) | メルク | 1.06346 | |
| 子牛胎児血清 (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | 2-8 °Cで保存する必要があります。Cは細菌の増殖を抑制します。泡立ちを避けてください。 |
| N、N-ジメチルホルムアミド;DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | 可燃性。急性毒性。 |
| グラスカバースリップ24 x 36 mm | Menzel-GLäser | BB024036A1 | |
| 塩酸、濃度 (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | 腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。 |
| 塩酸溶液容積測定、2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | 腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。 |
| 亜硝酸ナトリウム、ReagentPlus、≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | 酸化剤。毒性。環境に危険です。 |
| エチレンニチリロテトラ酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA;C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | 経口暴露は、生殖および発達への影響を引き起こす可能性があります。 |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P 真空浸透プロセッサ | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | ハッカー機器 | ||
| 家庭用食品スチーマー | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| 光学顕微鏡 | Leica Polyvar 2 |
参考文献
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
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再版と許可
