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方法論記事

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

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DOI：

10.3791/50440

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2013年8月14日

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1Department of Ophthalmology, Northwestern University, 2Department of Neurobiology, Northwestern University

この記事について

サマリー

慢性高眼圧症は、マウスの目に小柱網のレーザー光凝固を使用して誘導される。眼圧（IOP）は、レーザー治療後数ヶ月上昇する。視力と実験動物のコントラスト感度の低下は微細運動テストを使用して監視している。

要約

頻繁に上昇した眼圧（IOP）に関連付けられている緑内障は、失明の主要な原因の一つである。我々は、ヒトの高張力緑内障を模倣する高眼圧症のマウスモデルを確立しようとした。ここで、レーザ照射角度を閉塞を誘発する、房水流出をphotocoagulateする角膜輪部に印加される。 IOPの変化はレーザー治療前と後のリバウンド眼圧計を使用して監視している。微細運動行動試験は、視覚能力の対応する変化を測定するために使用される。レーザー照射後に持続IOP上昇を開発1マウスの代表の結果が示されています。視力低下やコントラスト感度は、この眼高血圧マウスにおいて観察される。一緒に、我々の研究では、緑内障マウスで神経変性基礎となる分子メカニズムを調査するために貴重なモデルシステムを導入しています。

プロトコル

手順

C57BL/6Jマウス（ジャクソン研究所、バーハーバー、ME）は、ノースウェスタン大学のアニマルケア施設で発生します。すべての動物は、ノースウェスタン大学制度動物実験委員会およびNIHから神経科学研究における動物の使用に関するガイドラインに準拠することによって承認されたプロトコールに従って使用しています。

1。レーザー光凝固術

レーザー光凝固の手順5-7以前に公表されたプロトコルから変更されている。

  1. ケタミン（100 mg / kgで、バトラーシャインアニマルヘルス、OH）およびキシラジン（10 mg / kgで、アイオワ州、シェナンドーのロイド社、IA）の腹腔内注射することによって40〜60日齢のマウスを麻酔。
  2. 1％硫酸アトロピン溶液の1つまたは2つの滴（アルコン研究所社、フォートワース、テキサス州）で局所処置により実験動物の右眼の瞳孔を拡張させる。
  3. 散瞳後、平らにレーザー誘導6を強化するnterior室。前房内の流体を排出するスリットランプ下前歯スペース（SL-3E、トプコン、オークランド、ニュージャージー州）に鋭い先端（世界プレシジョンインスツルメンツ、サラソタ、フロリダ州）のガラスマイクロピペットを挿入します。
  4. プラスチックコーンホルダー（トリーサイエンス社、MA）でマウスを抑制し（ 図1A参照 ）自家製プラットフォームに縛ら。拘束とマウスを持ち、スリットランプの後ろに光源にマウスの右目を公開します。スリットランプの下で麻酔したマウスの右眼の位置を合わせます。
  5. 両手でマウスの拘束を保持しながら、アルゴンレーザー（ウルティマ2000SE、コヒーレント、サンタクララ、CA）を使用して、角膜輪部にレーザー照射を適用します。小柱網の周囲に垂直に80-100レーザスポット（514 nmで、100 mWで、50ミリ秒パルス、および200μmのスポット）について配信します。 C57BL / 6マウスは、任意のpに対する障壁として機能する着色された虹彩を有するotential漂遊エネルギー7。
  6. 痛みを和らげるために局所0.5％のレーザー処理面積を消毒するための眼表面上のモキシフロキサシン（アルコンラボ社、フォートワース、テキサス州）と0.5％プロパラカイン（ボシュロム、ロチェスター、NY）を植え付ける。
  7. それは完全に目を覚ましになるまで時間程度回復のための加熱パッド（サンビームプロダクト株式会社、ボカラトン、フロリダ州）の動物を保管してください。
  8. 左目は、コントロールとして機能するように未処理である。

2。 IOP測定

  1. プラスチックコーンホルダーにロードしてから、（ 図2A参照 ）プラットフォーム上でそれを抑制するためのチューブに目を覚まして、マウスを置きます。
  2. マウスホルダー位置に適応し得るように5〜10分待ちます。プローブ先端が離れて角膜14の表面2〜3ミリメートルになるまでマウスの目にリバウンド眼圧計（TonoLab、コロニアルメディカルサプライ、フランコニア、ニューハンプシャー州）に近づく。
  3. プローブ先端が中心面を打つように、測定ボタンを押すと、静かに角膜の。同じ目のIOPの6測定の3つの連続した​​セットが目のIOPとして取得し、平均化されます。未処理の対照の眼は、常に次の測定されレーザー治療目のベースライン値を得るために最初に測定されます。

3。微細運動テスト

視力とコントラスト感度は、14,15をテストされます。個々のマウスの両眼は、漂流格子方向を反転させることにより別々に検討されている。時計回りに漂流格子が左眼と右眼16についての反時計回りに漂流格子の視覚機能を識別するために使用され、即ち 。各テストは約15分かかり、独立して、二人の観察者によって繰り返される。

  1. マウスを置き、マウスは、4つのコンピュータのモニタ（ 図3A-B）に囲まれた高架プラットフォーム上で自由に移動することができます。
  2. 彼らは水平正弦​​漂流表示されるようにモニターを設定39 CD / m 2での平均輝度の視覚刺激として格子。格子の移動方向が交互べき 連続して右回りと左回りの間。
  3. 動物の動きを分析します。視覚刺激がオンになった後、徐々に増加した後、漂流格子と、コンサートでは、動物の動きを15秒以内 "ポジティブ"とみなされます。最高応答惹起する視覚刺激は、動物の視力17として定義されています。
  4. 0.075、0.16、そして1度当たり0.3サイクル（CPD）：3つの事前選択された空間周波数でのコントラスト感度を調べます。各眼用コントラスト閾値は、予め固定周波数での視覚的応答を誘発する最も低いコントラストとして定義される。コントラスト感度は、しきい値17の逆数である。

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結果

の手順で説明するように、レーザー照明は角度の閉鎖（ 図1）を誘導、房水流出をphotocoagulateに輪部地域における小柱網を目指している。ほとんどのレーザ書込み目は以前の所見6と一致し、有意な物理的な損傷、顔料剥離や感染症を示さなかった。マウスの小グループ（すべてのレーザ書込み動物の5％未満）などの収縮眼球、重度の白内障、大幅な顔料剥離や出血などの重篤な損傷の物理的な兆候を示したとき、我々はすぐに安楽死。レーザ書込み目の約30％がマイナー角膜瘢痕を開発し、それらのほとんどはレー​​ザー治療後1〜2週間以内に回復した。

私たちは、百以上のマウスから、ほぼすべてのレーザー処理した目に高いIOPを見つけました。実験動物のIOPがリバウンド眼圧計（ 図2）を用いて監視される。 図2Bは、Iの変化の一例を示すレーザー治療前後OP。 15.7 mmHgの（右）対14.7 mmHgの（左、0日目、 図2B）：レーザー治療の前に、マウス...

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ディスカッション

我々は、持続的な高眼圧症上記のレポートは、マウスの目にレーザー照射によって誘導することができる。生理食塩水の注入モデル18および広範顕微スキルを必要とする、どちらも静脈焼灼モデル11に比べて、レーザー照射は、実行するために、比較的シンプルで簡単です。通常、私たちは2〜3時間で4-6マウス用レーザー照射を行うことができます。持続的な眼圧上昇を達成するための重要なステップは、レーザーとレーザー照射のためのパラメータの前に平坦化前房です。小柱網領域にレーザを標的と周辺の毛様体および血管6への損傷を最小限にするために容易に前房に流体を排出する。レーザの異なるタイプも報告されている、例えば、幾つかの研究では、角膜輪部レジスタに小柱網と強膜上静脈を対象とする810nmのエネルギーパルス7を用い532nmの5,6および他の波長を有するダイオードレーザを使用したイオン。角度損傷を最大限にするために、我々は以前に報告されたレーザ5-7モデルと比較してレーザスポットの数が増加している。我々の実験によると、ほぼすべてのレーザ処理...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

著者は、ノースウェスタン大学のフルタイムの従業員です。

著者は、この記事で使用する試薬や楽器を生み出す企業によって提供されたNOの資金を受け取っていません。

謝辞

この論文に含まれている作品は、アメリカの健康支援財団（XL）、失明を防止するための研究からウィリアム＆メアリーグレーヴェ特別奨学生賞（XL）、から緑内障研究博士ダグラス·H.ジョンソン賞によってサポートされています失明予防のためのイリノイ州協会（HC）とNIH助成R01EY019034（XL）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagent
moxifloxacinAlcon Labs, Inc.NDC 0065-4013-030.5 %, Rx のみ
プロパラカイン 塩酸塩Bausch LombNDC 24208-730-060.5 %, Rx
のみ 点眼液 USPBausch LombNDC 24208-730-06.5%, Rx のみ
ケタミンButler Schein Animal HealthNDC 11695-0550-1100 mg/kg
キシラジンアイオワ州 LLOYD Inc. NADA139-23610 mg/kg
アトロピン硫酸塩溶液アルコンラボNDC 61314-303-021 %, Rx only
Equipment
スリットランプ, TOPCON Visual Systems IncSL-3Epowered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtualCerebralMechanics Inc.
光動態検査装置CerebralMechanics Inc.
眼圧計、TonoLab、マウス用コロニアル医療供給
加熱パッドサンビームプロダクツ株式会社722-810
アルゴンレーザー コヒーレント株式会社ウルティマ 2000SE
DECAPICONE プラスチックコーンホルダー Braintree Sci Inc.マウス用MDC-200

参考文献

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