アウェイク行動マウスにおける慢性神経録音のためにマイクロドライブアレイの構築

インビボで細胞外神経信号を記録するための微小技術の使用は、神経^1,2に長いと評価された伝統がある。自由に動物を行動で多くの脳領域からの電気的活動を記録する機能は、しかし、神経信号の集録、解析、差別するためのソフトウェアパッケージは³より洗練された、ユーザーフレンドリーになるとますます一般的になりつつある最近の技術であり^{、 4。}ソフトウェア側の技術の進歩はまた、マウスなどの小型哺乳類で記録するために十分にスケールダウンされた植込み型デバイスの重量とバルクの減少を伴ってきた。軽量（主にプラスチック）成分を使用することによって、研究者は^5-7脳領域の様々を対象とする電極やtetrodesの独立した位置決めを可能にするマイクロドライブを構築することができる。などであっても深部脳構造、扁桃体⁶と線条体^5は 、日常的に適切に長いドライブねじの選択を対象とすることができます。これらの記録技術は^、9研究者は、高忠実度の神経信号を取得できるように、単一のニューロンの電気的活動に登録されている細胞内に^8を記録した。移植後¹⁰まで2ヶ月のためにマイクロドライブのこれらのタイプを使用して、我々は成功したマウスからのシングルユニットを記録している。また、デバイス（約1.5〜2.0グラム）の軽量な性質は、多くの行動のタスクにおける非移植したマウスに匹敵する行動のパフォーマンスをもたらしました。特に、移植したマウスは、新規な物体認識タスク¹⁰とオブジェクトの場所のタスク（未発表データ）の通常性能を示すことを実証した。

複数tetrodesに結合されたマイクロドライブの使用は、研究者がネットワークレベルで神経活動を監視し、分析することができまた、脳内の複数の単一のユニットから記録中。これらtetrodesと録音はユニット識別目的のためのいくつかの主要な利点を有しており、高精度の取得と複数のシングルユニット¹¹の識別を可能にします。私たちは、製造と金プレート四極管バンドル、その後駆動可能電極キャリアにロードする方法について説明します。我々は説明しドライブキャリアのいずれかのタイプが市販されており、他の資源のかなりの投資をすることなく、複数のキャリアおよび4極配置を収容することができ、単純で容易に拡張可能な、ドライブ設計である。

1。四極管作製

1. カリフォルニアファインワイヤーから絶縁さ12.5ミクロン（0.0005 "）直径コア白金イリジウム線を使用して起動します。ワイヤの長さは、ターゲット構造に適した長さに切断されるべきである。例えば、少なくとも30 cmの長さにワイヤーをカット背側海馬台または海馬を標的とするため。
2. 長さ15cmになり二つの平行線があるように、中央に上の線を折る。長さ7.5センチメートルの4つの並列配線を形成するために、水平アームを介して、この線の中点をドレープ。次に4本のワイヤの束を作成し、ドレープワイヤーの下部にラバーコーティングされたクリップを取り付ける。
3. それは紡績工程中に解除されますようにワイヤーがピンと張ったではなく、あまりにもピンと張ったり、ベアリング重量であることを確認しながら、電動テトロードスピナーにラバークリップを配置します。
4. "手動"モードにテトロードスピナーを切り替え、時計回りの方向に線を回転させる "右"にジョイスティックを押してください。スピナー四極管を形成するために、4本のワイヤーのタイトなバンドルを作成し、約2 Hzで回転します。
5. ジョイスティックの "戻る"を押すことで停止し、80時計回りに回転を適用します。これは電動スピナーを一時停止します。次に、四極管の緊張を解放するために、20を反時計回り（ "左"）回転を適用します。ワイヤの長さ当たりの回転の最後の数は、ミクロン当たり8回転でなければなりません。
6. VGボンドコートを溶融によって一緒にワイヤーを融合するために、400度の最大値に達する低い設定1、上加熱銃を使用。ワイヤからヒートガン約2センチ持ち、いくつかの異なる角度から、約5秒間、上下線の直線の長さを銃を実行します。絶えずヒートガンをスイープし、これはHML断熱材を溶融し、ワイヤがバンドル内に融合するようになりますように、任意の単一の場所、それを保持していないことを確認してください。
7. 四極管（水平アーム近く）の上部にカットを行い、次に下部のクリップから四極管を解放。四極管の一端の4つの別々のワイヤが存在するように、単一ループをカットし、これらのワイヤを電気的に後の工程において金ピンや回路基板に接続される。
8. ドライブが完了するまで、ストレージのための無塵保持ボックスに完成四極管を配置します。

2。カスタムマイクロドライブアセンブリ

1. 最初のマイクロドライブ（複数可）を保持する基盤を構築する。それが固定と頭蓋骨の正中線に沿って配置されている場合は移植マイクロドライブのベースは一般的に最も安定しています。このプロトコルは、4つのポリアミドチューブキャリアを保持するために、単一のマイクロドライブと基盤を構築する手順を説明します。必要に応じて、追加のマイクロドライブとチューブを簡単に追加することができます。
2. プレキシガラスのアクリル（厚さ5mm）を、砂を約20mm角部分、それが頭の上に移植された後にマウスがドライブに自由に移動できるようになります形状にアクリルで始まる。
3. 次に、駆動ユニットを組み立てる。カスタマイズされた3を使用します。ドライブのネジを運ぶでしょう0.3 X 6.3ミリメートルの真鍮のガイド。垂直に一緒にまず、半田2真鍮ガイド。水平片はアクリルベースに接着されながら垂直真鍮のガイドは、ドライブのネジと電極を保持します。
4. 一緒に真鍮の部分はんだ付けした後、ガイドの上部を通って、デルリンプラスチックブロックにフィリスターヘッド真鍮のネジを渡すことによって、ドライブ自体の組み立てを始める。正方形のブロックは、糸穴がガイドから非常にわずかに突出したブロックの一面になり、わずかに中心を外れた（0.2ミリメートルによる）となるように設計されている。これは、電極を担持ポリアミド管が座ります側である。
5. ナットはほぼガイドの底に触れてまでガイド内部デルリンブロック、およびすべての方法を通じて、ネジで、六角真鍮ナットを通します。完全にナットを締めないでください。代わりにナットとネジを結合するために、端にはんだの少量を溶かすが、半田anytに注意しないとされてガイド興。今すぐねじ山に沿って垂直に、ねじを回転させるデルリンブロックアップ（時計回り）に移動する必要があり、上下（反時計回り）。はんだ付けナットを過ぎ突出スレッドを切り落とした。
6. ドライブが組み立てられた後、アクリルベースに戻って、電極駆動は次のようになります幅3mmのスロットをカット。スロットを通して水平真鍮ガイドを渡し、その後ベースに作品を保護するためにcryanoacrylate接着剤を使用。
7. 所定の位置に固定するために万力でアクリルベースを置きます。ベースの上に、電子インタフェースボード（EIB）を配置し、2つのネジ穴の位置をマークします。 EIBSは、電極ワイヤとプリアンプヘッドステージとの間の信号接続を提供するマイクロチップである。 1.5ミリメートル先端のドリルビットを使用して、慎重にベースの上に所定の位置にEIBを保持するネジのためにマークで穴を開ける。穴にEIBとスレッド2真鍮のネジを置きます。
8. POLYAMの4 7ミリメートル長い部分をカットするミクロ解剖ハサミを使用してくださいIDEチューブ。折り畳まれた実験室のテープ部分に互いに隣接して4本のチューブを並べる。それらを一緒に参加しますが、自分自身の中にチューブ糊を取得していない注意を取るためにセンターへのシアノアクリレート適用します。入社管は完全に乾燥させます。
9. EIBチップが垂直で、ドライブが上向きに突き出たデルリンブロックに水平に配置されるように、ドライブ·ベースを90度回転させます。解剖顕微鏡を通して見ると、慎重に軽くたたくデルリン顔にシアノアクリレート少量のその後接着剤で4入社チューブを置きます。接着剤はドライブを移動しようとする前に、完全に設定することができます。
10. ポリアミドチューブを安全に固定し、アセンブリ全体がガイドに触れたり、任意の抵抗を満たすことなく、スムーズに動くことをしていることをテストします。
11. 次に、接地ネジを準備し、EIBにアース線を接続する。真鍮のネジ（3/32 "）を取って、わずか1〜2スレッドが残るまで、スレッドをダウンサンディングによってグランドネジを作る。これがなければなりません〜このネジなど1mmで頭蓋骨内に配置され、脳組織を貫通するように意図されていない。
12. 銅線の30ミリメートルの長さをカットし（正確な長さは頭蓋骨の動物の地面をどこに配置するかに依存します）。銅線は100でなければなりません - 500μM（0.004から0.02 "）の直径では、これは38 AWGスルー24 AWGワイヤとほぼ同等である銅線の両端に半田フラックスを適用し、一方の端に、半田接地ネジに。ワイヤー。もう一方の端に、半田EIBゴールドピンには、このアース線は保留にしておいて、移植手術中に後でEIBに接続することができます。
13. 次のステップは、ポリアミドチューブを介して電極を導き、EIBチップ上のチャネル孔に接続することである。完全にチューブが彼らの一番上の位置にあるように、時計回りにドライブのネジを回します。
14. 単一の電極のため、Stableohm 50μM線の50ミリメートル長さをカットし、1のポリアミドチューブを介してそれを導く、それが鉤状回を標的とするための管端（過ぎて少なくとも2.0ミリメートルを延長することができますか海馬）。チューブにワイヤーを貼り、任意の線の動きを阻止、チューブの上部にシアノアクリレートの小滴を適用します。次に、ゴールドピンを使用してEIBチャネル穴にワイヤーの緩い端を接続します。細かいハサミで余分な線を切り落とす。他の微小電極について、この手順を繰り返します。
15. tetrodesを接続するための、収納ボックスの1完成した四極管を取り出します。 1ポリアミド管を通して四極管の融合終わりを導き、それが管端（鉤状回または海馬のために）過去に少なくとも2.0ミリメートルを拡張することができます。チューブに四極管を貼り、あらゆる移動を防止する、筒の上部にシアノアクリレートの小滴を適用します。四極管のもう一方の端にある4つの緩いワイヤーを取ると金のピンを使用してEIBチャネル穴に各ワイヤを接続します。余分な線を切り落とす。他tetrodesについて、この手順を繰り返します。

3。 VersaDriveアセンブリ

1. これがベースで構成され、筐体と、キャップPIEC; 4四極管VersaDriveを構築開始ES。
2. 10mmで1ポリアミドチューブをカットし、4極キャリア上の最小の穴を介してそれを導く。管は非常にわずかにキャリア（0.5㎜）を越えて拡張することができます。エポキシは、チューブ自体に行くことを許可しないように注意しながら、所定の位置に接着剤ポリアミドチューブに5分エポキシを使用してください。他の3つのチューブとのキャリアのためにこれを繰り返します。
3. エポキシが完全に設定した後、VersaDriveベースの4つの穴の1つを介してポリアミドチューブを導く。すべての4つの管は、その穴からしたら、外側の穴から虫ピンを押して、これは行に4極キャリアを保持し、上を走行するキャリアのためのレールとして機能します。他の3つのキャリアのためにこれを繰り返します。
4. キャップはベースをカバーし、4極キャリアがキャップ内に存在するように、キャップを取ると、4虫ピンでそれを並べる。キャップ内の適切なスルーホールと4極キャリアにスレッド1ミリメートル×5ミリメートル小ねじ。これは、キャリアを上下に移動させるための駆動ねじであろう。代表他の3本のネジのためにこれを食べる。
5. 四極管キャリアは彼らの一番上の位置にあるとポリアミドチューブはキャップ開口部を通して見えるようになるまで時計回りにすべてのネジを回します。細かいミクロ解剖ハサミを使用して、（1 mm）のすぐ下の4つのすべてのポリアミドチューブは同じ長さになるようにベースをチューブをカット。
6. 慎重に解剖顕微鏡、ポリアミドチューブを通して糸1四極管を使用した。ねじれたり曲がっなどの管を通ってそれの進歩は、それが非常に困難な完全を通して四極管を通すようになりますようにそれは完全にストレート四極管線を保つことが重要です。他の3つのtetrodesについて、この手順を繰り返します。
7. すべてtetrodesが彼らのチューブになったら、慎重にそれぞれのチューブ内tetrodesを確保し、各チューブの上部にシアノアクリレートの小滴を適用します。キャリア間またはキャップから突き出ている緩い四極管線の任意のシアノアクリレートを得るためではない注意してください。
8. 彼らは唯一のチューブを越えて拡張するようにtetrodesをカット2.0ミリメートル（鉤状回または海馬のために）。その後VersaDrive治にドライブベース（4虫ピンが挿入されている）に配置します。治具の残りの半分は、チャネル接続を行うためのすべてのコンセント穴がありVersaDriveキャップを保持します。
9. 完全tetrodesがその最も低い位置にあるように、反時計回りにドライブのネジを回します。
10. ゴールドソケットに4極配線を接続する前に、最初のキャップにアース線を接続してください。 VersaDriveキャップは、孔の二列の中心位置における接地接続のための2つのピン孔を有している。少なくとも30ミリメートル（どこで地面を配置する頭蓋骨に依存）の銅線をカットし、これらのセンター穴の1つを介してそれを導く。銅線は100でなければなりません - 500μM（0.004から0.02 "）の直径では、これは38 AWGスルー24 AWGワイヤとほぼ同等である場所に銅線をキャッチし、余分な線をトリムする穴から金レセプタクルを押します。銅線の他端には、フラックスを適用solde接地ネジにrがこのワイヤ端（2.11を参照してください）​​。第二のアース線について、この手順を繰り返します。
11. 次に、すべての緩い四極ワイヤ（全部で16あるはずです）キャップにそれぞれのレセプタクルのスルーホールを導く。それは1つの四極管で始まり、その真上になってしまい、適切な4穴に個々のワイヤをスレッド化するのが最善です。彼らは壊れやすく、あまりにもしっかりと把持した場合簡単に圧着できるので、個々の四極管線は光の圧力で処理する必要があります。虫ピンの穴を並べてキャップを取り付け、ベースに圧入。
12. キャップから突き出四極管のワイヤーで、場所で四極管線を捕捉し、電気的接続を行うための金のレセプタクルを圧入。金レセプタクルが押下されると、ワイヤの約50％が（上記キャップ）切り取られる。キャップの上部から突き出たまま余分な線をトリムします。まれに（5％未満）、ダウン金レセプタクルをプッシュすると、ワイヤーを粉砕しますと切断チャンネルで、その結果、レセプタクルの下それを破る。この切断は、インピーダンステストと電気めっきの手順（4.7を参照）までは実現されない場合があります。
13. 他の3つのtetrodes用圧入プロセスを繰り返します。トップにそれらを戻すと、ドライブの動きがスムーズであることを保証するために時計回りにドライブネジを回します。

4。電極先端のゴールドメッキ

1. かかわらず、どのようなタイプの使用されている微小電極の電極の先端は、先端インピーダンスを低減するために、金メッキである必要があります。これにより、確実に単体活動電位を記録し、識別する能力を最大化する。 Neuralynx nanoZデバイスを使用して電極インピーダンスをテストします。 nanoZ、インピーダンスを測定し、自動化された電気めっきを可能にし、コンピュータベースのデバイスです。
2. 最初に彼らの最も低い位置に（反時計回り）ダウンマイクロドライブのネジを回す。その後、しっかりとの低下ができますクランプでマイクロドライブをマウント金めっき液に電極チップ。
3. SIFCOゴールド液と蒸留水と他の塔と1デルリンタワーを埋める。金溶液に電極チップを下げます。
4. WindowsベースのコンピュータにnanoZ USBケーブルを接続してから、nanoZプログラムを開きます。このプログラムは、インピーダンス測定値を与え、マイクロドライブの接続された各チャンネルで金メッキを実行します。
5. ドロップダウンデバイスに移動した後、ウィンドウの下部にある "接続が確立された"と表示され、nanoZを選択します。次に、ドロップダウンメニューでテストするための適切なアダプタを選択します。 "テストインピーダンス"をクリックし、1004 Hzの（40サイクル、0ミリ秒の一時停止）を試験周波数に設定してください。自分MΩ測定値と、使用可能なすべてのチャネルを示し、 "プローブレポート"ウィンドウが開きます "テストプローブ"をクリックします。ディスクのアイコンをクリックするか、 "ファイル"を選択することにより、これらのインピーダンスの値を保存し、 "レポートを保存"。
6. 次に、 "DC電気めっき"をクリックして割り当て次の値：モード=マッチインピーダンス、電流= -1.0μA、ターゲット= 350kΩの1,004 Hzで、5失点、5秒間隔、2秒休止をメッキ。
7. "オートプレート"をクリックします。プログラムは最初にそのチャネルに指定された電流を適用し、各チャンネルのインピーダンスを読み取られ、インピーダンスを再テストし、ターゲットインピーダンス（または低い値）に達するまで、必要に応じて、現在適用されます。目標は、電極インピーダンスを低減することであるが、チャネルが100kΩの値を下回る電気めっきすることが可能である。このような場合には、四極における隣接ワイヤが互いに短絡されていることが可能である。この問題が発生した場合は、超過金粒子、再テスト、そのチャネルのインピーダンスを削除してから、電気を繰り返す現在の極性（+ 1.0μA）を逆転。 325kΩの - 4 12.5μMワイヤの束上の典型的な最終的なインピーダンス値は、150から及ぶ。
8. 350kΩの下にメッキされていない任意の単一のチャネルがある場合、電気めっきプロセスを繰り返します。プログラムは、すでに目標を達成しておりませんがありますだけプレートチャンネルチャンネルをスキップします。
9. いったんすべてのチャネルが許容インピーダンスにメッキされている、nanoZプログラムを閉じて、デバイスを切断します。めっき液の電極を上げて、過剰金粒子を洗い流すために、蒸留水デルリン塔にヒントを下げる。
10. 電極は、その上部位置まで上昇されるまで時計回りにドライブネジを回します。今、マイクロドライブと電極が移植のための準備が整いました。

<p class="jove_content">マイクロドライブを注入し、目的脳のターゲットに電極を下げた後、例えばNeuralynxリンクス-8などの増幅されたデータ収集システムは、神経信号を記録するために必要とされる。マウスの背側の鉤状回からの活動電位（しばしば呼ばれる "スパイク"）に示されている局所電場電位（LFPsの）と単一ユニットの代表的な神経録音<strong>図2</strong>。 LFP信号が3 kHzでサンプリングされ、バンドパス0.1〜500ヘルツ（間に濾過した<strong>図2A</strong>と<strong> 2B</strong>）。<strong>図2A</strong>不十分な接地信号と4連続サンプリングLFPチャネルを示しています。これらの信号は非常に騒々現れ、簡単に与えられた振幅範囲内で飽和します。<strong>図2B</strong>シータ範囲（4-12 Hz）の中ではっきりと見えるネットワーク振動で十分に接地LFP信号から4チャンネル、の例を示しています。 LFP信号はNeuroExplorer（バージョン4.0）データ解析ソフトウェアを使用して、 "1Dデータビューア"で可視化した。</p><p class="jove_content">シングルユニットスパイクチャンネルは0.5から9 kHzの間にフィルタ30 kHzで、バンドパスでサンプリングされた。 tetrodesを使用することの主な利点は、推定上の個々のニューロンからの信号が改善された装置識別するためのいくつかの記録ポイント間の三角測量できるようにすることである。の左側のパネル<strong>図2C</strong> 4つの電極ワイヤがレコーディングセッションを通して本質的に同一のスパイク波形を登録しているので、悪い四極管の記録の例を示します。千個々のスパイクの波形（上<em> N</em> = 1458）が黄色で表示平均波形と、tetrodesの各チャネルのために互いの上に重ねられた。このパターンは、効果的に、単一の記録電極として機能するようにワイヤの束を引き起こす可能性が四極管製造（絶縁溶融工程の間）の間に一緒に配線の融合によるものであった。これは、このパターンが参照アーチファクトによるものであったか、またはすべての4つの電極から等距離にあるソースが信号に責任があったという可能性もある。これらの可能性は排除できないが、それらを最小限に抑えることができる。通常はアンプシステム内で、記録チャネルは、基準チャネルであることがユーザーに割り当てることができます。これは問題のあるグランド接続と参照をトラブルシューティングするために役立ち、得られた低ノイズの録音の柔軟性を可能にします。の右パネル<strong>図2C</strong>オーバーレイスパイク波形を示す優れた四極記録の一例を示している（<em> N</em> = 1939）は、4つの4極配線間で異なる振幅の推定ユニットから。スパイク記録パターンのこのタイプは、その後のオフラインでクラスタリングし、分離時の改良された装置識別を可能にする。スパイク波形はPlexonオフラインソーター。（バージョン2.8.8）を使用して可視化した。</p><p class="jove_content"<strong>表1。</strong> tetrodesとマイクロドライブを構築するために使用される材料と試薬。</p><p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"<img src="/files/ftp_upload/50470/50470fig1.jpg" alt="Figure 1"><strong>図1。 VersaDrive 4アセンブリを完了した。</strong>この写真は4 tetrodesが下から延び、2つのグランド配線は両側から突出して完成したVersaDriveを示しています。上部の緑色のチップがVersaDriveに直接差し込むとNeuralynxアンプシステムに接続するために使用されOmneticsアダプタです。</p><p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"<img src="/files/ftp_upload/50470/50470fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50470/50470fig2highres.jpg"><strong>図2。代表的な局所電場電位と単一ユニットのスパイク波形。</strong>ローカルフィールドポテンシャル（LFP）とマウスの背鉤状回に移植電極から得られる単一ユニットのレコーディング。<strong> A.</strong>トレースは悪い電気地面と4連続してサンプリングしたチャンネルから示さLFP信号の10秒を表しています。<strong> B.</strong>トレースはシータ範囲（4-12 Hz）の中で目に見えるネットワーク振動で安定した、継続的なベースラインを示し、適切なアースを持つ4つの連続してサンプリングしたチャネルから、LFP信号の3秒を表しています。シータ活動のエピソードは、灰色のバーでマークされています。<strong> C.</strong>左側のパネルには、推定される個々のユニットから匹敵するスパイク波形を表示してすべての4つのチャンネルを、貧しい四極スパイクパターンの一例を示しています。右側のパネルには、4つのチャネル間の波形の範囲との良好な四極管スパイク波形の一例を示しています。各四極チャネルの平均波形を黄色で表示され、スケールバーは、2ミリ秒（X軸）、200μV（y軸）。<a href="https://www.jove.com/ja/files/ftp_upload/50470/50470fig2large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するにはここをクリック</a>。</p>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。