非侵襲ハイパーサーミアがん治療のための金ナノ粒子と生体系とラジオ波の相互作用を評価するためのプロトコル
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Summary
私たちは、13.56MHzの高周波（RF）の両方の非生物学的および生物学的システムにおける金ナノ粒子コロイドと電気分野（ 試験管内 / 生体内 ）の相互作用を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。これらの相互作用は、癌治療における用途のために研究されている。
Abstract
既存の対応物よりも毒性および侵襲性癌療法が非常に望ましい。最小限の毒性を引き起こす、身体深部に浸透RF電界フィールドの使用は、現在、非侵襲性癌療法の実行可能な手段として研究されている。これは、内在化ナノ粒子（NPを）有するRFエネルギーの相互作用は、最終的には細胞壊死で終わる、セルの（温熱療法）を引き起こす可能性が過熱する熱を放出することが想定される。
非生物学的システムの場合、我々は、高濃度のNPコロイドによって遊離熱を定量化に関する詳細なプロトコルを提示する。生物系は、in vitro実験の場合には、我々は、効果的に、バルク媒体の加熱アーチファクトが有意にデータを不明瞭にすることなく、RFエネルギーに癌細胞を露出させるために接着されなければならない技術および条件を記載している。最後に、我々は詳細な方法論Fを与えるまたは異所性肝癌腫瘍を用いたin vivoマウスモデルで 。
Introduction
（それらの固有の電気誘電率）の生体組織によるRFエネルギーの吸収は、最終的には温熱により細胞死をもたらす時間の関数として高められた組織温度をもたらす。それは、癌温熱療法は、癌細胞内に内在化し、隣接する健康な無傷の、正常細胞を残して、RF熱変換体として作用する標的化ナノ材料の使用によって最適化することができると仮定される。いくつかの報告が既にNPの様々な癌壊死1-4助剤として有効なRF熱源として作用することが示されている。
両方のインビトロおよびインビボ RF実験に使用した場合にこれらの点は、金のNP（AuNPs）3-5、カーボンナノチューブ1、及び量子ドット6において、図7は、刺激的な特性を示している。 RF場に露出これらのNPの加熱機構の正確な性質は、依然として、一連の議論されているがAuNPsを使用した基本的な実験は、NPのサイズと集約状態の両方で大きな意義を置いている。これは、RF場8にさらされたときの直径を有するのみAuNPs <10ナノメートルで加熱することが示された。 AuNPsが凝集している場合にも、この加熱機構を大幅に減衰する。この集約状態は、効果的なRF療法4用endolysomal細胞内コンパートメント内AuNPコロイド安定性を最適化する際に重要視しin vitroモデル内で検証されました。ただし、このデータを収集し、評価するために使用される技術及び実験的な原理は、特にNPコロイドからRF熱プロファイルを検証する場合には、問題となる可能性がある。
いくつかの報告のNPが懸濁されているバックグラウンドイオン性懸濁液のジュール加熱は、主RFの熱発生源ではなく、それ自体のNP 9-12であり得ることを示している。私たちの最近の論文8は、Tを検証したが彼は10ナノメートル未満の直径のAuNPsからの熱を生成する際に、RF相互作用の使用は、この記事の中で、より詳細にこれらのプロトコルを記述することを目指しています。
また、in vitroおよび肝臓癌モデルのin vivo実験の両方において高体温の熱AuNPs薬としての有効性を評価するために必要なプロトコルおよび技術を実証する。我々は、クエン酸をかぶったAuNPsの単純なコロイドに主に焦点を当てているが、同技術は、抗体と化学療法 – 共役複合体のような他のAuNPハイブリッドに適用することができます。これらの原則に付着していることで実験者がうまくいけば、急速に効果的なRF誘導感熱温熱剤であることがあらゆるナノ材料の可能性を評価することができるはずです。
Protocol
完全な実験の概要を図1に示されている。 さらなる詳細は、以下の手順1〜3に示されている。 1。 NPコロイドの高周波加熱を評価する：例としてAuNPs 一般に、各NPサンプルが調査され、第一のバックグラウンドイオン及び汚染物を除去するために脱イオン（DI）水を用いて遠心分離フィルターを通して試料を数回洗浄する。すべてのイオンおよび汚染物質が洗い流されている液体が、DI水と同様の高周波加熱速度（時間）がAuNP懸濁液から削除されています。この精製プロセスはまた、得られるNPのより高い濃度を可能にする。なお、この例ではAuNPsを用いているが、基本的な原理は 、他のNPの材料に適用することができることは注目に値する。 一例として、直径5nmの市販のAuNPsの500ミリリットル瓶を浄化した後、電気-Fiは13.56MHzのRFフィールドにそれらをさらすELD強度90 kVの/ M。 〜6 50kDaの遠心フィルターチューブの間に株式AuNPソリューションとスプリットから125ミリリットルを取る。 3,000 rpmで遠心分離する。 2分5秒。より多くの保存溶液で濾過液リフィルフィルタを削除。すべての500ミリリットルがフィルタリングされるまで繰り返します。 DI水の同じような量で濾過液を交換し、約8倍（またはフィルタリングされたバッファのRF時間DI水と同等になるまで）を繰り返します。ノート、UV-Visの分析はまた、汚染物質の吸収ピークを監視するために使用することができる。バッファ汚染物質が各フィルタに、ピペットを約0.5ミリリットルのDI水を完全に除去され、繰り返しピペッティングによりAuNPsを再懸濁したら。これは完全にフィルタからAuNPsを削除し、完全な再懸濁を可能にすべきである。 1 15ミリリットルエッペンドルフチューブにすべての6懸濁液を兼ね備えています。 AuNPsを精製し、濃縮された後、ICP-OES、および/またはICP-MS、UV-VISとconcentratio上のデータのためのゼータ電位を使用してサンプルを分析するnおよびNP安定性であった。 SEMおよび/またはTEM分析は、形態学的データを得るために使用することができる。これらの技術についての詳細なサンプル調製は、文献4に見出すことができる。 Kanzius高周波これまでの研究8に記載されているシステム、またはこのシステムの導出、（無サンプルプレゼントに）空気中のRF電界がなるように1.3ミリリットルの円筒状の石英キュベットを置く〜キュベット内部の90 kVの/ Mを用い。標準生理食塩水試料（0.9％NaCl）をするための電界は、〜1.1 kVの/ mまで減少するであろう。これらの比較は、異なるシステム間で行われることを可能にするために使用されるおおよその条件である。 ピペット石英キュベットに精製されたAuNPコロイド1,000 mg / Lの試料を1.3ミリリットルとRFフィールドにこれを紹介する。これは、特注のテフロン（登録商標）サンプルホルダーを使用することによって行うことができる。 120秒またはサンプルが電気アークや急激な沸騰を防ぐために、70℃に達するまでの期間、RFフィールドにサンプルを公開しています。カナダ赤外線カメラ·関連ソフトウェアを使用して熱画像データ（および制御領域）pture。この手順を3回繰り返します。 DI水バッファからAuNPsを抽出するために別の50 kDaの遠心フィルターを通して試料を濾過する。 3回は再び、RFフィールドにバッファを再公開します。 AuNPコロイドおよび背景DI水バッファ間のHRの差がAuNPs自身のために人事を決定します。 AuNPに〜0.25℃/秒の依存人事を与える〜0.3℃/秒と0.05℃/秒の時間得ることを期待しています。 試験管内/ vivo実験用の1.3ミリリットルの水に、フィルタからの残りAuNPsを再懸濁します。 2。ナノ支援RF誘発性高体温：in vitro試験 これらのインビトロ研究は、2D単層を形成し、癌細胞型の任意のタイプに適用することができる。この実験では、ヒト肝細胞癌は、Hep3B細胞由来の使用。 プレート〜5万CEL増殖培地1mlの12ウェルプレートの前面3つのウェル中のls。 （コントロールとしてのNPの研究と3枚のために3枚を使用してください）この6回繰り返します。 NPSを導入する前に24時間、37.5℃でインキュベートする。 5分間のバイオセーフティキャビネット紫外線露光を用いて最初にNPSを殺菌する。 それぞれにうまく千mg / LのAuNP溶液0.1mlを導入し、さらに24時間のままにしておきます。 3対照細胞プレートの各ウェルに0.1mlの水を加え、さらに24時間のままにしておきます。 24時間後に細胞培地を吸引し、任意の表面に結合したAuNPsを除去してPBSで洗って、合格しています。細胞培地を交換してください。セルは現在、RF被爆の準備ができている。 RFフィールド内の各12ウェルセルパックを置きます。細胞は31℃に冷却するまで待ちますRF発生器の電源を入れ、3.5分間さらす。細胞培地の最終温度は〜37℃になりますRFフィールドをオフにします。細胞を除去し、分析の前に24時間、インキュベーターに配置します。 <李>インキュベーターと吸引細胞培地から細胞を取り出します。 MTT試薬の0.4ミリリットルでなく、各ウェルに細胞培地の1.6ミリリットルを追加します。 4時間細胞をインキュベートする。培地を吸引し、ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlで置き換える。ベンチロッカーに細胞プレートを配置し、DMSOは、MTT試薬を可溶化することを可能にするために10分間のままにしておきます。最後に、光学的にピペット100 96ウェルプレートにそれぞれの液とは、そのようなSPECTROstarナノプレートリーダーなどのプレートリーダーを用いて570nmでよくお読みください。 3。ナノ支援RF誘発性高体温：in vivo試験 これらのインビボ研究は、同所性または異所性マウスモデルにおいて、固形腫瘍を形成する任意の種類の癌にも適用することができる。この実験は、異所性腫瘍をBALB-CヌードマウスモデルでのHep3B肝癌細胞を使用する。 注：すべてのin vivo実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されます。また、実証されているプロトコルは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指導と承認の下で行われた。 適切な増殖培地で、組織培養フラスコ中で適切な数の細胞（〜100 k）を成長させる。細胞培養の間、5％CO 2、37℃インキュベーターでインキュベートする。 トリプシンで細胞を処理（フラスコから分離するために）、すべての25μlのための200万個の細胞の溶液を生成します。 （氷上）マトリゲル等量を追加し、最終的な注射液を調製し、十分に混合。マウスの背中に所望の位置に、このソリューションを注入し、腫瘍が目的のサイズ（ほとんどの細胞のための2-4週）に成長するために適切な時間を待つ。 RF被曝の前に、BALB-cヌードマウスは、固形腫瘍が子宮外に0.5〜1センチメートル直径を負担する必要があります。 ANAEことにより（この場合、BALB-Cヌードマウス）が使用されたマウスを作製IP注射によるケタミンおよびキシラジンの溶液でそれらをsthetizing。マウスは眠って下落している一方で、37℃に温度制御された室内に保管してください全部で20匹のマウスは、全て同様のサイズ軸受腫瘍を必要とされるであろう。無AuNP注射で両グループ：残りの10匹は、RF-曝露と非RF-曝露のコントロールの間で分割され、一方10匹のマウスを（後者は、PBS注射のみ）と一緒にしてAuNPsせずに使用されます。 いったん適切に麻酔、27 Gの針を1-CCの注射器を使用して、腫瘍に直接AuNPsを注入する。 AuNP液をPBSの0.1ミリリットルで200 mg / LでのAuの濃度である必要があります。注射後、血液を吸収し、拭き、アルコールで注射部位を拭くために、外科綿棒を使用しています。 次いで、RF発生器の受容頭部に処理されるべきマウスを取り付ける。腫瘍が送信ヘッドに最も近くなるようにマウスを配置しなければならない。処置されるべきされていない領域を遮蔽、ならびに感度銅テープと、目、耳、手足などの分野をTIVE。電荷の蓄積が発生しないように銅テープを適切に接地面と接触していることを確認してください。また、露光領域は、所望の治療部位の大きさよりも少なくとも1cmのギャップを持っている必要があります。 位置赤外線熱カメラ、腫瘍および治療領域が表示されるように。 5分間のRFをオンにします。生じた温度曲線を記録します。治療は、直ちに温度を超える42℃の停止処理を実現した場合。 彼らが意識的になるまでのRF曝露後に暖かい室内での麻酔からマウスを回復する。 （ – 3.4.1 3.3.1ステップ）48時間後に同じマウスで実験を繰り返す。 実験後、制度的なプロトコルと手順に従ってマウスを安楽死させる。腫瘍の重量を記録します。組織学的分析のためにホルマリンを使用して腫瘍を固定し、パラフィンに埋め込む。腫瘍切片は通常、ウィットに染色される例えば Ki-67の時間ヘマトキシリン-および治療 の有効性を測るに関連するターゲットについては、カスパーゼ3 などを切断した。
Representative Results
1。例としてAuNPs：NPコロイドのRF加熱を評価する。 セクション1.1に従った後 – 1.2.3を5 nmおよび10 nmの直径AuNPsの高濃縮、安定し、かつ精製されたソリューションを持っていることを期待しています。として購入したストック溶液を500ミリリットルから1,000ミリグラム/ Lの濃度で溶液の少なくとも4ミリリットルを得ることを期待図2に示されているようにAuNPsこの?…
Discussion
これらのプロトコルは、実験者が完全に（この場合AuNPs）は、癌治療のためのRF誘導性高体温を増加させることができるためにナノ物質程度を分析することを可能にする。第一のプロトコルは、特に高濃度精製AuNPサンプルから熱産生を分析して扱っています。他のグループは、主にAuNPsがAuNPs自身9-11にせずに懸濁させるバッファから熱産生を報告しているが、それらのRFシステムは、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（U54CA143837）、NIH、MDアンダーソンがんセンターサポート助成金（CA016672）、V財団（SAC）、およびKanzius研究財団（SAC、エリー、ペンシルバニア州）からの無制限の研究助成金によって賄われていた。私たちは、行政の支援のために、外科腫瘍科、MDアンダーソンがんセンターのクリスティーン·アッシュに感謝します。
Materials
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-OES | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer |
References
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Cite This Article
Corr, S. J., Cisneros, B. T., Green, L., Raoof, M., Curley, S. A. Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy. J. Vis. Exp. (78), e50480, doi:10.3791/50480 (2013).