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方法論記事

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

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DOI:

10.3791/50483

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2013年6月26日

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

この記事について

サマリー

本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示 in vitroで急性海馬スライス。このプロトコルは95％の成功率を8時間より長く非常に安定した長期的な長期増強（LTP）の記録を可能にする。

要約

長期増強（LTP）は、シナプスの強さの増加によって特徴付けられるシナプス可塑性の一種であり、メモリ符号化に関与すると考え。 LTPは広く研究されている急性海馬スライスのCA1領域において誘発。しかしこの現象の維持段階の基礎となる分子メカニズムはまだよく理解されていない。これは、異なる研究室で使用されるさまざまな実験条件が一因である可能性があります。確かに、LTPの維持期は酸素、温度や湿度などの外部パラメータに強く依存する。また、解剖後にスライス平面、スライスの生存の向きなどの内部パラメータに依存しています。

すべてのこれらのパラメータの最適化は非常に再現性が非常に安定した長期増強の誘導を可能にします。この方法論は、さらに安定した増加に関与する分子メカニズムを探索するための可能性を提供しています海馬スライスにおけるシナプスの強さである。また、神経生理学的現象のin vitroでの調査での実験条件の重要性を強調しています。

概要

今日では、メモリは神経回路レベルで保存し、リコールされている方法の複合体の限られた理解があります。ただし、メモリ記憶の統一仮説が利用可能であり、広く受け入れられている。メモリは、中枢神経系のニューロン間のシナプス結合の強さの変化として記憶される。自分自身で、シナプス可塑性の研究は、主に2画期的な発見の恩恵を受けています。 （1）精実験、ブリスとロモ1では、そのまま麻酔ウサギを使用して、海馬のperforantパスを簡単に高周波数（1秒、100 Hz）での配信は刺激が長続きを引き起こしたことを（いくつかの発見時間）関連のシナプス結合の増加。この魅惑的な現象は、1975年2ダグラスとゴダードによって"長期増強"やLTPと呼ばれていました。 （2）その後、それは人為的にin vitroで生き維持同様の現象が、脳切片（0.6 mm）の中でトリガできることがわかった。最も広く研究さLTPは、いわゆるCA1領域の錐体ニューロンにおいて誘発生じる電界興奮性シナプス電位を記録しながら、軸索の束（いわゆるシェーファー側枝）に1つまたは複数の破傷風菌を提供することにより、 インビトロで観察された。 LTP誘導のメカニズムは、主に明らかにされている。 AMPA受容体のリン酸化（その効率を増加させる）と、シナプス後膜3に余分なAMPA受容体の組み込み：基本的には、NMDA受容体を介してCa 2 +の流入は、2つの結果を有する酵素を活性化する。対照的に、LTPの維持期のメカニズムは、30〜60分間、より多くの時間スライスのための健康を維持するために、実験的にはるかに困難であるため、特に、不明な点が多い。

研究の多くは、LTPのメカニズムの理解に専念してきており、興味深い理論が年間4-11にわたって詳述されている。しかし、国連ゴマ今、シナプス強度の安定した増加を根底に正確な分子メカニズムは解明されていない。これは、準備のためにさまざまなテクニックを使用して、異なる研究室で以前の結果を再現することが困難と海馬スライスの維持が一因である可能性があります。彼らの方法論の論文では、Sajikumar ら 12は、実験ラット海馬スライスの準備のための条件、安定したLTPの記録の重要性を強調した。このビデオでは、マウス海馬スライスでは非常に安定したLTPを記録することができるように長年にわたって我々の研究室で開発されたすべての最適化手順を提示します。

この最適化は、マウス13、ラット11 LTPのメカニズムを研究する他の研究室が開発し、正常に使用プロトコルから行われている。これは、経験豊富な研究者が成功率が高いと成体マウスでは非常に長期的なLTPを誘導し、記録することができます。 P誘発性LTPのhysiological基礎は慎重にチェックし、14を実証した。この方法論の論文では、解剖の手順が深くスライス興奮性を修正することができますが、温度や酸素のような実験条件のいずれかの変更は、LTPメンテナンスに多大な影響を及ぼす可能性があることを示している。また、すべてのこれらのパラメータの正確な制御が初心者の学生のために数ヶ月の訓練を必要とすることを強調しなければなりません。

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プロトコル

全ての動物の手順は、研究における動物のケアと使用のための衛生規制の国立研究所に合わせて、地元の倫理委員会の契約に行った。

1。人工脳脊髄液の調製

同メディアは、解剖カットし、休息期間と電気生理学的記録中にスライス（1ml /分）灌流するために使用されます。このメディアは124のNaCl、4.4 mMのKClを、26 mMの炭酸水素ナトリウム、1mMののNaH 2 PO 4、2.5mMのCaCl 2を、1.3のMgSO 4、10mMのD-グルコースから構成されている。

  1. 溶液（1 M）に既にあるMgSO 4を除くACSF 2Lのための異なるコンポーネントを重量を量る。標準溶液を使用すると、 硫酸マグネシウム、粉末で吸湿性が高いための Mg 2 +の正確な濃度を確実にすることができます。のCa 2 +：の Mg 2 +比が大幅にLTP誘導とメンテナンスに影響を及ぼす14ので、それらの割合は常に尊重されなければならない。
  2. ガラス中のCaCl 2を除いてすべてのコンポーネントを置くには、メスシリンダー、蒸留H 2 Oで2 Lにもたらす
  3. 精力的にかき混ぜる。すべてが溶解するときに、タンク（95％O 2、5％CO 2）に取り付けられた水槽のバブラー、チューブを介してカーボゲンを追加する。数分待ってから、pHは重炭酸塩緩衝液の作用によって7.4に固定されて塩化カルシウムを追加します。
  4. 冷蔵長方形のガラス皿で600ミリリットルを維持し、°C皿の周りに氷を4にクールダウン。このメディアは、海馬の解剖のために使用されます。
  5. 残り1400ミリリットルをフィルタリングし、三角フラスコに保つ。

2。電気生理学的リグと脳スライス記録商工会議所の調製

灌流回路は、2蠕動ポンプ、リザーブタンク及びtから他のポンピング使用される流体からの新鮮な流体をポンピングするいずれかの形成されている彼はビンにチャンバーを記録。新鮮な流体は、それが重力（ 図1A）によってインターフェース記録チャンバに到達する前に再酸素化と温め、自家製灌流システムに追加される。インタフェース記録室はFST（ファイン科学ツール、バンクーバー、カナダ、 図1B）によって設計されました。組織切片は、リムーバブルウェル環に結合して不織布​​ネットフィルタ上に配置され、連続的に吸引ウェル針の高さを調整することにより、インターフェイス条件下で維持することができる。自家製プラスチックその端部でブロックチューブと横方向穿孔（0.5 mm）をチャンバ内のレベルの安定性を高めるために、吸引針に固定されている。記録ヘッドは、記録ヘッド（水滴の形成を減少させるため）に偏向口から湿った空気を通過させることによって湿潤環境を維持するのに役立ちガス分散石を含む水浴上に取り付けられている。浴および媒体温度を連続的にDC電流番目のレベルを変えることによって制御される水浴中で荒いシリコーンゴム埋ヒーター素子。水浴と記録ウェルのサーミスタは、チャンバ温度はこれらのサイトに設定し、正確に監視できるようにする。

チャンバの加熱システムは、全体のリグの温度を制御するグローバル加熱システムにより完成される。ソフトウェアは、エジンバラ（大学の研究者によって開発されたwww.etcsystem.com ）モニターと酸素空気の温度、脳切片、電極および長期的録音（ 図1C）のための安定した環境を提供し、残りのリグをイコライズ。マウス海馬スライスに使用温度は28℃です。

  1. 20分の最小用蒸留H 2 Oとのすべての灌流回路をすすぎ、暖房システムを起動します。
  2. 回路内カーボゲンバブリングを開始します。カーボゲンをfを通して自家製灌流チューブに到着ILTERキャンドルと記録室下水浴した。水浴中の流量は、流量計により制御される。流速が遅すぎる場合、組織が低酸素となる可能性がある。流量が高すぎると逆に、ガスが十分に温められ、そして組織の乾燥につながる加湿ないかもしれない。高いガス流量はまた、浸透圧ショックに至る下水浴から組織の上に噴霧水の可能性を高めることができる。これは、偏向口の出口にナイロンメッシュのビット（100μm）を添加することによって防止することができる。
  3. 回路を排出し、濾過ACSFでいっぱい。
  4. 保持チャンバー内のスライスをサポートするリングを置く。 500から750ミクロンの範囲のメッシュ開口部を有する不織布ネットフィルタは、2つの部分から成る樹脂、エポキシ接着剤で引き伸ばされ、リングに取り付けられている。不織布ネットフィルタは87％のポリアミドおよび13％エラスタン（パンティ15デン）で構成されている。接着剤はリンの表面にレリーフの形成を避けるために慎重に適用しなければならないgであった。
  5. 慎重に回路からすべての気泡を除去。
  6. 吸引針のネジで記録チャンバー内ACSFのレベルを調整します。蠕動ポンプの速度は、入口ポンプの1ml /分および出口ポンプ用5ml /分に調節される。

灌流システムは、硬質耐振動テーブル上に配置され、ファラデーケージに囲まれている。

3。解剖エリアの調製

手術器具：＃11ブレードとメス、小さな標準解剖はさみ、春のはさみ、湾曲したピンセット、2ハイデマンspatulaeとスプーン。

補足資料：ギロチン、underpad、カミソリの刃でマッキルウェーン組織チョッパー、ろ紙、ゴム乳首付ガラスパスツールピペット、2プラスチック製パスツールは広口、ペトリ皿、金属製のシリンダーとのいずれかをピペット直径7mm（ 図2A）。

    冷たいACSF（ステップ1で調製したもの）でいっぱい解剖皿に、ろ紙に包まれた染色皿から冷蔵ガラス蓋を浸す。慎重に水槽バブラー（ 図2A）を介し気泡や含酸ACSFを削除します。
  1. 使用のために楽器をレイアウトします。組織チョッパープレートと蒸留水とエーテル（ 図2B）で洗浄し、新しいカミソリの刃でろ紙の三層を追加します。それが紙に触れたときにカミソリの刃を水平にする必要があります。ブレード力が極大値の約3分の1に極大値および速度の半分に調整される。
  2. あなたはその後、時間を持っていないので、すべてが（楽器、温度...）準備ができているか注意深く確認してください。
  3. 冷たいACSFでいっぱいパスツールピペットで解剖を噴霧する誰かを尋ねる。
  4. 断頭前ネンブタールIP（100 mg / kg）を、マウスを麻酔。ハロタン麻酔を使用することもできる。我々は両方の方法とobtaを比較した同じ結果をINED。断頭を麻酔下で実施する必要がなく、頸椎脱臼を用いることもできる。しかし頸椎脱臼は、動物の苦痛を避けるために、非常に良い練習が必要です。
  5. 冷たいACSF連続シャワーの下で可能な限り迅速にunderpadに解剖。

4。脳の取り外し

  1. 銃口上の1つの手の人差し指と親指で、まだ頭を押さえながら、ギロチンカットのエッジで開始し、前頭骨に吻方ランニング頭の上の真ん中に沿って解剖ハサミで切開をする。
  2. 完全に頭蓋骨プレートを露出させ、頭の尾側の筋肉を除去するために、ヘッドの各側面に皮膚の筋肉を切って。
  3. 解剖ハサミで、両側に側頭筋をカットし、側頭プレートに沿って、その後横方向に、途中で正面のプレートをカット。次に、2つのPL間、後頭骨に少しカットをするATES。
  4. それぞれの側では、後頭部プレートの尾ベースでカット。
  5. 春のはさみと矢状縫合に沿ってカットします。
  6. 鉗子で、お互いからそれらを離れて広めることで頭蓋骨の半分を削除します。
  7. メスで、単に嗅球後に横方向にカットし、小脳はその後風邪ACSFと解剖皿に抽出された脳を突入直前。

5。海馬の解剖

  1. 脳は解剖皿に漬された後、真ん中に挿入メスで互いに二つの半球を断つ。
  2. 海馬の解剖は、双眼手術用顕微鏡（X25、 図2A）を通して、視覚的制御下spatulaeを用いて行われる。 1半球では、慎重に側脳室を見て構造を広げた。脳幹と間脳を取り外します。これは、一方の側の前頭皮質でspatulaeを適用することによって、オン間脳で行われます反対側。 spatulaeと海馬に手を触れないようにし、組織切片の間にそれをストレッチしないように注意してください。
  3. 心室にへらを挿入することによって、優しく皮質（アウェイロール）の海馬を押し出すその後円蓋を断つ。
  4. 海馬が抽出されると、過剰な皮質組織と残りの血管を取り除く。

6。スライスの切断

  1. 広口プラスチック製パスツールピペットを用いて、そのアルベア表面上（凸側）をスプーンで海馬を転送します。
  2. 標準のプラスチック製パスツールピペットを用いて余分な水分を取り除きます。
  3. 垂直方向にほぼチョッパーのろ紙（ 図2B）に触れスプーンを先端とその後スプーンを戻す急速にろ紙に触れることによって、スプーンから海馬をオフにドロップします。
  4. 海馬を配向し、チョッパーと400μmの横断それをスライス（海馬の向きについては、図2C参照カミソリの刃に比べて膿）。できるだけ早く行動する。
  5. スライスされた海馬とろ紙を取り出し、スライスを少し広げるために金属製のシリンダーのまわりでそれを包む。その後、ACSFのスプレーとの自由スライスが標準的なプラスチックパスツールピペットを使用しており冷たいACSFでいっぱいペトリ皿にそれらを収集。

7。インターフェイスにおけるスライスのインキュベーション

  1. 標準のプラスチック製パスツールピペットでスライスを選択し、迅速に記録室に配置します。スライスは、28でインターフェイスで、直接レコーディング室で解剖のトラウマから回復℃まで
  2. スライスは、最も可能性の高いシンクします。スライスレベルに達し、それが浮くようにそれを高めるために液面を下げる。
  3. レベルを下げながら、正しい位置にスライスを入れます。スライスは常にCA1領域における電極のポジショニング（2刺激と一つの記録電極）を容易にするために、同じように配向されている。
  4. 時停止流体がインタフェースである。スライスの周りの媒体の "メニスカス"は、メディアの十分なレベルを示す。ネットフィルタは、メディアで飽和したが、完全に水没しないようにする必要があります。
  5. 穴のあいた蓋の上に置かろ紙で覆わ室に保管してください。
  6. 28少なくとも1.5時間スライス休ませ℃に

8。シナプス応答の記録

  1. 電極を記録：ACSFで満たされたときガラスキャピラリーはMΩ2-5の先端抵抗を得るために引っ張られる。濾紙の小片は、電極の先端の周囲に配置され、骨ワックスを凝縮を低減するために先端に印加される。刺激電極：12.5ミクロン径の白金イリジウムバイポーラクラスタ電極はFHC（USA）から購入する。適切なケアで、各電極（ 図1B）は、少なくとも30回使用することができます。
  2. CA1領域の角質放線に電極を置き、すべての電極が並んでアップ（ 図3A）。電極は、ナリシゲのマイクロマニピュレーターとスライスの表面の下で75から150程度に低下する。 2刺激電極はシェーファー側枝2つの別個の束を刺激するために配置されます。電極はスライス上に降下している場合、濾紙は慎重室を閉じ、すべての周りに配置されています。
  3. 二相性刺激（半波あたり0.08ミリ秒のパルス持続時間）はSIU-V分離ユニットに接続された芝生刺激に一定の電圧で行われる。最大応答は2 Vから最大12 VのフィールドEPSPのに刺激強度を増加することによってチェックさWPI ISO-80アンプで1000倍に増幅し、10 Hzから10 kHzでフィルタリングされます。信号は、次に、ナショナルインスツルメンツ/ D変換器を介してPCに送信される。刺激、データ収集と分析がWinLTPプログラム（使用して実行されwww.winltp.comを ）。フィールドEPSPを、入力アウトで得られた最大振幅の40％で計上されている曲線を置く。スライスごとに、fEPSP斜面はLTP誘導に先立つ30分かけて平均勾配に対して正規化されています。
  4. LTPは、第二の経路は対照として機能し、一方の経路上でのテスト刺激の強度で単一列（100ヘルツ）を適用することによってトリガされる。

9。セットアップの清掃

  1. 少なくとも10分間、過酸化水素（H 2 O 2）の3％溶液で全ての回路をすすぎ、その後ドレイン。回路は、注意深く実験を開始する前に、蒸留水でリンスする。他のラボではクリーニングのためにのみ蒸留水を使用しますが、水のみを使用しているとき、我々は配管システム内の暗い残留物の堆積を気づいているように、H 2 O 2を使用することは絶対に必要ではありません。
  2. 記録室の下に水浴の水を交換してください。
  3. 5分間アルコール風呂は刺激電極のヒント。

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結果

この方法は、成体C57BL/6Jマウス（JANVIER SAS、フランス）14からの急性海馬スライスに誘起長期的な長期増強の特性を分析するために使用されている。驚くべきことに、実験条件の改善がLTPを見るための新しい方法につながっている。我々は、シナプス強度の長期的な増加は、新しいタンパク質の合成を必要としなかったことを示した。

ここでは、LTP誘導がスライスの生存と興奮性に依存することを示す。海馬の解剖が遅すぎたり有害だった、スライスは興奮性が増加し、多シナプス応答は（ 図3B）LTP誘導後に観察することができた。この場合には、LTP誘導はあまり効果的であったと相乗作用が維持されていない。

私たちも、スライスで明らかに健康な、技術的条件は、単一によって誘導されるLTPの期間に大きな影響を持っている、という事実を強調したいと思います刺激の列車。以前の刊行物に、我々のグループは、短時間のLTPがスライス15のリカバリ条件を変更することにより、長期的なも...

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ディスカッション

我々は我々の研究室で開発され、LTP録音11,17に大きな専門知識を有する他の研究室で使用される方法の組み合わせに起因するプロトコルを開発した。このプロトコルは、成体マウスの海馬に適合され、どの年齢やバックグラウンド遺伝子型の動物において使用することができる。また、アルツハイマー病18,19のような神経変性疾患を開発するトランスジェニックマウスにおけるLTPの分析を行うことができます。

ラット海馬スライスのためにこのプロトコルの使用率は、いくつかの適応を必要とすることができます。例えば、ラットで行われた研究のほとんどは、32℃の代わりに28℃の温度を使用マティスら 20は、老化マウスまたはラットの海馬スライスを調製するための別の方法を提案した。

材料と方法

C57BL/6JマウスはJANVIER SAS（フランス）から来たが、同じ結果がカールからC57BL/6Jマウスを用いて得られる...

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開示事項

利害の衝突は宣言されていない。

謝辞

我々は技術支援のためにバーナードFoucartに感謝します。この作品は、科学研究のためにベルギーの基金（FRS-FNRS）で医療研究のためのエリザベート王妃基金によってサポートされていました。アニエスヴィレは、科学研究のためにベルギーの基金で研究員です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/材料
>NaClSigma - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KClSigma - AldrichP9333
D-グルコースSigma - AldrichG7528
NaH2PO4シグマ - AldrichS9638
MgSO4 1MSigma - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
CarbogenAir Liquide (Belgium)
CapillariesWPI, Inc. (UK)TW150-4
Stimulating ElectrodesFHC (USA)CE2B30
手術器具FST (ドイツ)
濾紙 84 g/m2SartoriusFT-3-105-110
MeshLycra15 den
GlueUHUplus endfest300
Instrument
AmplifierWPI, Inc. (UK)ISO-80
インターフェース記録室FST (ドイツ)
蠕動ポンプGilson (USA)Minipuls 3
Temperature controllerUniversity of Edinburghwww.etcsystem.com
Tissue ChopperMcllwain
スティミュレーターグラス (アメリカ)S88X + SIU-V
プログラム解析WinLTPwww.winltp.com
マイクロマニピュレーター成重MM-3 and MMO-220A
手術顕微鏡ライカマイクロシステム
A/DコンバーターナショナルインスツルメンツNIPCI-6229 Mシリーズ

参考文献

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