老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

サマリー

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。

要約

ヒトの細胞は無限に増殖しない。外部および/または内因合図すると、細胞が老化と呼ばれる安定した細胞周期の停止を死ぬか、または入力します。このようなテロメアの短縮やマイトジェン癌遺伝子の異常発現などのいくつかの細胞のメカニズムは、老化を引き起こすことが示されている。老化は、正常細胞に限定されず、癌細胞はまた、老化することが報告されている。

化学療法薬は、癌細胞の老化を誘導することが示されている。しかし、それは老化が防止または腫瘍形成を促進するかどうか議論の余地がある。それは最終的に患者固有のかもしれないような、癌細胞の老化を評価するための迅速かつ高感度の方法はすぐに必要とされる。

この目的のために、標準的なβ-ガラクトシダーゼアッセイを、現在使用されている方法は、主要な欠点​​を提示する。それは時間がかかり、敏感ではない。ここではリチウムの老化を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを提案セルをVEの。このアッセイは、感受性、迅速であるという利点を提供し、種々の細胞マーカーの免疫標識に結合することができる。

概要

60年代前半とヘイフリックとムーアによるその発見以来、老化はまだ携帯好奇心¹のままです。ヒトの細胞は無限に老化によって、ヘイフリックとムーアは老化の細胞プロセスを造語、増殖しません。老化は、細胞死とは対照的に、細胞は代謝的に活性なままである、安定した細胞周期の停止である。テロメアの短縮、DNA損傷、クロマチン摂動、及びマイトジェン癌遺伝子の異常発現^2：日付には、4つの細胞メカニズムは老化を誘導することが示されている。これは、正常細胞だけでなく、癌細胞だけでなく老化^3を受けることができることを示している。実際のところ、老化を受けている癌細胞をさらに腫瘍進行^4-5に対する障壁を構成することが示された。しかし、いくつかの報告は現在、特定の状況下で、細胞老化にも悪性^6-7を促進することができる、と指摘している。癌CELの老化を研究現在使用されている化学療法薬はin vitroにおいてもin vivoで ⁸だけでなく、がん細胞の老化につながることができるようなLSは、がん研究の衝動になろうとしている。

老化細胞の存在を調査するマスターアッセイは、酸性pHでのβ-ガラクトシダーゼアッセイである。この組織化学的アッセイは最も老化細胞で発生するリソソーム生合成増加を反映している。簡潔には、細胞に適用外因X-....

プロトコル

1。 C12FDG、バフィロマイシンA1、および細胞培養の調製

1. 最終濃度20mMにジメチルスルホキシド（DMSO）中のC ₁₂ FDG粉末を溶解する。 -20℃でアリコートと店舗DMSOは、適切な安全条件で使用されるべきである。
2. 0.1mMの最終濃度DMSO中バフィロマイシンA1粉末を溶かす。アリコートと店で - 20℃バフィロマイシンは、適切な安全条件で使用する必要があります。
3. 37℃、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質、°C、5％CO _2を含む培地で、RPMI 8226細胞株、又は接着否か他の細胞株を養う。実験に必要なセルの数を見積もります。フローサイトメトリー分析の間に十分な数のイベントを記録するために、5×10 ^5個の細胞が必要である。老化細胞の割合を、3つの細胞サンプルが必要とされるかを判断するには、次のようにラベル付けされていないサンプル、C ₁₂ FDGで染色処理した細胞で染色した未処理の細胞をC ₁₂ FDG。
4. シードセル24時間は、従来の細胞は、細胞増殖曲線の対数期内になるように実験を行う。

2。老化の誘導

1. 化学療法薬を添加することにより癌細胞の老化を誘導する。薬物濃度と処理時間を試験した細胞タイプに適合させるべきである。約10

結果

多発性骨髄腫、血液学的悪性腫瘍は、化学療法によって誘導される手順老化を評価した。そのためには、市販のMM細胞株（RPMI 8226）はドキソルビシン、化学療法薬で2日間処理した。次いで、細胞をバフィロマイシンA1処理を施し、更にC ₁₂ FDGと共にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。 図1は、老化細胞の割合C ₁₂ FDGを用いて日以内に決定することができるさまざまなステップやショーを示す図である。非標識細胞をフローサイトメーターで最初に実行された。 図2Aに示すように、関心領域は、死細胞および細胞残屑を排除するためにグラフィックFSC対SSCに設定した。この関心領域内の細胞は、その後、x軸とy軸上のイベント数のC ₁₂ FDG（FL1）の蛍光を表示するヒストグラムにゲートであった。未処理の細胞を分析した。 A赤いカーソルが描かれ、図のようにぼんやりとラベルされた人口の後に設定された2B：老化細胞は、地域に存在.......

ディスカッション

我々はここに住んで、癌細胞における細胞老化を定量化するためのフローサイトメトリーベースの方法を提示した。この方法は、膜透過性化合物、C ₁₂ FDGの使用に基づいており、化合物が細胞によって取り込まれているようので、任意の細胞型において及び限り、種々の処理後に使用することができる。細胞への取り込み時に、C ₁₂ FDGは、老化細胞のリソソームに富んだβ-ガラクトシダーゼによって加水分解される。レーザ励起の後、化合物は、老化細胞の定量を可能にする、緑色蛍光を発する。緑色蛍光のこの定量化は、いずれかのフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡によって行うことができる。しかし、この場合、蛍光細胞は時間を要する、観察者によってカウントされなければならない。 C ₁₂ FDGは、β-ガラクトシダーゼ活性を定量化するために、老化細胞の定量化に加えて、この方法は可能にする、β-ガラクトシダーゼによって加水分解されるので、と酵素の局在は、主にリソソーム小胞に存在する。方法は簡単ですが、注目は、ステップ3に描かなければならない。老化細胞の正常な検出は主にリソソームの右側のpHに依存しています。そうす.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-ドデカノイルアミノフルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド	インビトロジェン	D-2893
ジメチルスルホキシ	ド Σ	D2650
バフィロマイシン A1	シグマ	B1793
ドキソルビシン	サンド
トリパンブルー	シグマ	T8154
RPMI 1640 細胞培養液	ロンザ	BE12-702
子牛胎児血清	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	A94291