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方法論記事

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

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DOI:

10.3791/50529

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2013年8月15日

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

この記事について

サマリー

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析は、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量方法を提供するものである。この方法は、マッピング·タンパク質結合部位およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子をスクリーニングするために適用することができる。

要約

細胞内のタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法のうち、二分子蛍光相補（BIFC）は比較的簡単と小文字が区別されます。 BIFCは、蛍光タンパク質の二非蛍光フラグメント（金星、黄色蛍光タンパク質の変異体は、ここで使用されている）を使用した蛍光の生産に基づいている。非蛍光金星断片（VNとVC）が原因でVN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3相互作用と機能的蛍光タンパク質の形成に蛍光降伏、2相互作用するタンパク質（この場合は、AKAP-LBC及びPDE4D3）に融合されている細胞内。

BIFCは、タンパク質複合体の細胞内局在と蛍光強度に基づいてタンパク質相互作用の強さについての情報を提供します。しかしながら、タンパク質 - タンパク質相互作用の強さを定量化するために顕微鏡を用いBIFC解析には時間がかかり、タンパク質発現と相互作用における不均一性に起因幾分主観的である。フローサイトメトリーを結合することによってBIFC方法論分析は、蛍光BIFCタンパク質 - タンパク質相互作用信号は、正確に短時間で細胞の大量のために測定することができる。ここでは、AKAP-LBCとの相互作用に必要とされるPDE4D3でマップ地域にこの方法論の適用を実証する。このハイスループット法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子のスクリーニングに適用することができる。

概要

65万タンパク質-タンパク質相互作用は、正常な細胞機能1,2を維持するために重要な役割を果たし、ヒトインタラクに存在することが推定される。他にも共免疫沈降（共IP）、細胞溶解物からのタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための金本位、いくつかのタンパク質断片相補アッセイ（PCA）は、セル3の内部タンパク質-タンパク質相互作用の検出感度を向上させるために開発されてきた。技術はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、および二分子蛍光相補（BIFC）4,5が含まれています。それぞれの潜在的な相互作用タンパク質パートナー（この例では、我々はAKAP-LBC及びPDE4D3を使用してください）​​に融合されています。BIFCは蛍光タンパク質（YFP変異体ここでは金星を使用します）の二つの断片の促進協会に基づいています。 fで可視化することができる機能的な蛍光の細胞結果内部の関心の二つのタンパク質の相互作用ライブまたは固定された細胞の6,7,8を使用luorescence顕微鏡。他のPCAに比べ、BIFCは、生きた細胞で細胞内局在を検討する可能性のある、高感度かつ少ない技術的に困難である。この技術の主な欠点は、しかしながら、一度形成された蛍光タンパク質複合体が逆転することができないことである。したがって、動的なタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための優れた方法ではない。本稿では、金星の蛍光強度をモニターすることによってAKAP-LBCでPDE4D3の相互作用部位をマッピングするBIFC使用。 （自動ハイスループット機械を用いて行われていない場合）、時間がかかり、労働集約的である蛍光顕微鏡を用いた従来の分析と比較して、フローサイトメトリーは、短時間9上で不均一な集団における細胞の数千の簡単な定量的な分析を提供10。ここで、フローサイトメトリー分析 - BIFCおよび共IP伝統的なサイドバイサイドの比較を行うことにより、我々は、2メートル示すethodsは、比較可能なデータを提供するが、フローサイトメトリー分析は、BIFC少ない時間がかかり、目的の細胞に限られている場合に、より有用であり得る少ない材料を使用する。

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プロトコル

1。細胞トランスフェクション

  1. プレート細胞トランスフェクションの前日に、免疫のために少数の細胞をプレーティングする。
    1. 免疫蛍光の場合：6ウェルプレート、コートガラスカバースリップ（1ウェルあたり）少なくとも4時間、37℃で0.02％ゼラチンで、培地で1回洗浄し、各ウェルのために、プレート1×10 5 HEK 293T 2ミリリットル完全増殖培地中の細胞[ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えた10％FBS]。
    2. 6ウェルプレート（0.3×10 5 HEK 293T細胞を、24ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットル完全増殖培地中で2ミリリットル完全増殖培地中でウェルプレート1.2×10 5 HEK 293T細胞/：フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために）。
  2. 製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションのためにDNAを準備のEffectene（キアゲン）を免疫するために使用されます。通過LT1（MIRUS）をフローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために使用される。使用されるDNAの量を以下に示す。
    24ウェルプレート（NG） 6ウェルプレート（ngの）
    CFP-ベクトル 10 50
    VN N-AKAP-LBC 200 1000年
    VC N-PDE4D3-FL（フルレングスPDE4D3） 2.5、5、10、20、40、80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1（UCR1ドメインを含むPDE4D3 N末端 ​​断片） 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT（UCR2と触媒ドメインを含むPDE4D3 C末端断片） 100
    トランスフェクションのEffectene（6ウェル）を用いた。
    1. プラスミドDNAの指示された量+ 100μlのBuffer EC〜4μlのエンハンサー、ミックスを追加し、室温で5分間インキュベートする。
    2. 5μLのEffectene、ミックスを追加し、10分でインキュベート室温。細胞に滴下追加。
    TRANSIT-LT1を用いたトランスフェクション（6-well/24-well）：
    1. 滅菌チューブ内のOpti-MEM I無血清培地の250μl/50μlにプラスミドDNAの指示量を追加します。
    2. 穏やかに混合するために希釈したDNA混合物およびピペットに移行-LT1試薬を追加します。 （TRANSIT-LT1試薬：DNA比はDNA1μgの当たりTRANSIT-LT1試薬3μlのです）。
    3. 室温で30分間インキュベートし、細胞に滴下加える。

2。フローサイトメトリー、ウェスタンブロットや免疫細胞のための準備

  1. 24時間トランスフェクション後、細胞を採取する前に、落射蛍光顕微鏡下で蛍光を確認してください。
  2. フローサイトメトリー解析のための細胞調製：
    1. 24-well/6-wellプレートは0.5ミリリットル/ 2ミリリットル氷冷PBSで細胞を洗浄します。
    2. 50μl/250μlの0.05％トリプシンを用いて細胞を切り離し。
    3. 200μL/ 1ミリリットルDMEM培地でトリプシンを中和。
    4. 共同5分間500×gで遠心分離によってllect250μlの細胞（両方とも、24ウェルおよび6ウェルプレートの場合）、ウェスタンブロット分析のために残っている細胞（1ml）を使用する。
    5. フローサイトメトリー分析のための氷の上で250μlのFACSバッファー[PBS + 0.5％（w / v）のBSA + 2mMのEDTA]、店舗で再懸濁した細胞。フローサイトメトリー分析が即時ならない場合細胞もまた（PBS中）を1％ホルムアルデヒド中で固定することができる。
  3. ウェスタンブロット分析のための細胞調製する：フローサイトメトリー分析のための細胞調製物を並行して行う。
    1. 2 mlの氷冷PBSで1×細胞を洗浄、細胞溶解緩衝液[10mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 6.95、150mMのNaCl、5mMのEDTA、5mMのEGTA、1％トリトンX-100]の100μLを添加して細胞を溶解する。
    2. 4℃で21,000×gで10分間遠心分離によって細胞溶解物を収集℃で
    3. 、ブラッドフォードタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を定量、SDS-PAGE用レーンあたり等量のタンパク質をロードし、イムノ用ニトロセルロースに移す。
  4. 免疫用細胞調製。
    1. 2ミリリットルPBSで3倍の細胞を洗浄し、室温で10分間、3.7％パラホルムアルデヒド（PBS中）1mlに細胞を固定し、その後5分間2ミリリットルPBSで3回洗浄する。
    2. 封入剤を使用して、スライドガラス上にスリップをカバーマウント。必要に応じて、マニキュアを使用してカバースリップの端をシールします。
    3. 4でスライドを保管°C検査の前に。

3。フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡

  1. フローサイトメトリーは488nmで、波長405nm、及び642 nmの固体レーザーを備えたベックマン·コールター（シアン）ADPを使用して行われる。サミットソフトウェアは、取得および分析のために使用されている。
    1. 標準ビーズを用いたフローサイトメーターのキャリブレーションを行います。
    2. ゲー生細胞集団のためのリニアスケールでプロット前方散乱（FSC）/脇散乱（SSC）。
    3. ゲー非集約生細胞集団のためにプロット電圧/ FSCパルス幅。
    4. プロットcount/FL6（CFP fluorescencゲー非集約ライブCFP-陽性細胞のログスケールでE、405 nm）を。
    5. BIFC強度のログスケールでプロットcount/FL1（YFP蛍光488 nm）を。
    6. FSC、SSC、FL1とFL6光電子増倍管（PMT）各信号のしきい値を設定するには、電圧を調整、YFP-CFP-ダブルネガティブサンプルを実行します。
    7. 将来オフライン補償単一の正（両方YFP +とCFP +）サンプルを実行する
    8. 分析のために少なくとも10,000ゲーテッドイベント（非集約ライブCFP +細胞）を取得。
  2. 免疫蛍光顕微鏡ツァイスLSM 510共焦点顕微鏡を用いて行われる注：それは間のすべての設定（ズーム等、ピンホール、検出器利得は、増幅器のオフセット、フレームサイズ、走査速度、走査平均値、およびレーザパワー）一貫性を保つために重要であるすべてのデータの適切な比較のためのサンプル。

4。データ解析（サミット·ソフトウェアを使用して実行）

  1. acquisitと同様の分析プロトコルを設定する適切なゲーティングのイオン：
    生きた細胞のためのFSC / SSCドットプロットにゲート1。
    非集約生細胞のゲート1のFSC /パルス幅でゲート2。
    非集約CFP +生細胞のゲート3のカウント/ CFPでゲート3。
  2. YFP +とCFP +シングルポジティブ細胞を用いYFPとCFP信号を補償します。
  3. CFP / YFP陽性細胞に再決定するカットオフのライン。
  4. エクスポートYFPはCFPの蛍光強度（MFI）+データプロットするためのExcelへの細胞を意味する。
  5. AKAP-LBC、PDE4D3の発現レベルにYFP MFIを正規化し、ウェスタンブロットによって決定されるように、α-チューブリン制御を読み込む。

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結果

AKAP-LBCとPDE4D3構築物（ 図1B）はそれぞれ、VNおよびVC断片と融合させた。 AKAP-LBCと機能YFP蛍光（ 図1A）でPDE4D3結果の相互作用。ここでは、PDE4D3でAKAP-LBC-結合部位をマッピングするBIFCメソッドを使用します。上流に保存された領域1（UCR1）、上流の保存された領域2（UCR2）と触媒領域（CAT）PDE4D3の結合部位をスクリーニングするために使用されたため、完全長（FL）、UCR1とUCR2プラスCAT、PDE4ファミリータンパク質間で保存されているAKAP-LBCへ。 VN-AKAP-LBC及びVC-PDE4D3フラグメント異なる強度（ 図1C）と蛍光のHEK 293T細胞の結果での発現。 BIFCはUCR1とUCR2両方+ CAT AKAP-LBCでPDE4D3の相互作用に寄与することを示しています。 AKAP-LBC-UCR1相互作用から生じる大きな蛍光強度は、AKAP-LBC-UCR2 + CATと比較した場合、PDE-UCR1はPDE-UCR2 + CATより良いAK...

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ディスカッション

BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのシンプルかつ高感度な方法である。この方法は、新しいタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために使用することができない、しかし、それは細胞内タンパク質 - タンパク質相互作用を確認することと機能的特性を研究するために特に便利である等のタンパク質複合体の細胞内局在として、タンパク質 - タンパク質相互作用部位のマッピング、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節することができる小分子/ペプチドのスクリーニング。 VNとVC断片は、非蛍光性であるため、バックグラウンド蛍光は、このように、このアッセイの感度を助ける低い。時間はVN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用を成熟/安定化させるために必要とされる、このようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用の可視化に遅延があり、最適なの時点従って、経験的に決定する必要があるかもしれません。これは、VN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用は可逆的ではないことにも注意すべきで、そのため残念ながら、現在の金星BIFCとこのアッセイがtは適していません構築oがタンパク質 - タンパク質相互作用の動的な動力学を研究する。

...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

我々は、重要な実験的な評価と議論のためUICでオブライアンラボに感謝します。臨床およびトランスレーショナルサイエンスグラントUL1TR000050ためのUICセンター - この作品は、トランスレーショナル研究を進めるためのGKCとナショナルセンターに米国心臓協会グラント11SDG5230003によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
>Dulbecco’修正されたイーグル’Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/streprep), 100xInvitrogen15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen16000-044
Anti-Flag antibodySigmaM2, F1804
Anti-HA antibodyCovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A、T9026
抗 GFP 抗体Clontech632569
細胞培養プレート、6 ウェル組織培養処理済み サーモフィッシャーサイエンティフィック130184
HEK 293T 細胞ATCCCRL-11268
Maxiprep プラスミド精製キット、高速Qiagen12663
ダルベッコ’S リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、滅菌済み 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA、0.05% (w/v)Gibco25300
FACS 染色用ポリスチレン丸底チューブBD Biosciences352052
パラホルムアルデヒドFisher ScientificS74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP-36931
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-15
フィッシャーファイネストプレミアムカバーガラスフィッシャーサイエンティフィック12-548-5P
EQUIPMENT
>CO2 エアジャケット インキュベーターNuAIR DH オートフロー
共焦点顕微鏡 LSM510 METACarl Zeiss, Inc.
電気泳動およびトランスファーユニットBiorad
Cyan ADP Flow CytometerBeckman Coulter

参考文献

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