Method Article

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

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二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析は、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量方法を提供するものである。この方法は、マッピング·タンパク質結合部位およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子をスクリーニングするために適用することができる。

Abstract

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細胞内のタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法のうち、二分子蛍光相補（BIFC）は比較的簡単と小文字が区別されます。 BIFCは、蛍光タンパク質の二非蛍光フラグメント（金星、黄色蛍光タンパク質の変異体は、ここで使用されている）を使用した蛍光の生産に基づいている。非蛍光金星断片（VNとVC）が原因でVN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3相互作用と機能的蛍光タンパク質の形成に蛍光降伏、2相互作用するタンパク質（この場合は、AKAP-LBC及びPDE4D3）に融合されている細胞内。

BIFCは、タンパク質複合体の細胞内局在と蛍光強度に基づいてタンパク質相互作用の強さについての情報を提供します。しかしながら、タンパク質 - タンパク質相互作用の強さを定量化するために顕微鏡を用いBIFC解析には時間がかかり、タンパク質発現と相互作用における不均一性に起因幾分主観的である。フローサイトメトリーを結合することによってBIFC方法論分析は、蛍光BIFCタンパク質 - タンパク質相互作用信号は、正確に短時間で細胞の大量のために測定することができる。ここでは、AKAP-LBCとの相互作用に必要とされるPDE4D3でマップ地域にこの方法論の適用を実証する。このハイスループット法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を調節する因子のスクリーニングに適用することができる。

Introduction

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65万タンパク質-タンパク質相互作用は、正常な細胞機能1,2を維持するために重要な役割を果たし、ヒトインタラクに存在することが推定される。他にも共免疫沈降（共IP）、細胞溶解物からのタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための金本位、いくつかのタンパク質断片相補アッセイ（PCA）は、セル3の内部タンパク質-タンパク質相互作用の検出感度を向上させるために開発されてきた。技術はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、および二分子蛍光相補（BIFC）4,5が含まれています。それぞれの潜在的な相互作用タンパク質パートナー（この例では、我々はAKAP-LBC及びPDE4D3を使用してください）​​に融合されています。BIFCは蛍光タンパク質（YFP変異体ここでは金星を使用します）の二つの断片の促進協会に基づいています。 fで可視化することができる機能的な蛍光の細胞結果内部の関心の二つのタンパク質の相互作用ライブまたは固定された細胞の6,7,8を使用luorescence顕微鏡。他のPCAに比べ、BIFCは、生きた細胞で細胞内局在を検討する可能性のある、高感度かつ少ない技術的に困難である。この技術の主な欠点は、しかしながら、一度形成された蛍光タンパク質複合体が逆転することができないことである。したがって、動的なタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための優れた方法ではない。本稿では....

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Protocol

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1。細胞トランスフェクション

  1. プレート細胞トランスフェクションの前日に、免疫のために少数の細胞をプレーティングする。
    1. 免疫蛍光の場合：6ウェルプレート、コートガラスカバースリップ（1ウェルあたり）少なくとも4時間、37℃で0.02％ゼラチンで、培地で1回洗浄し、各ウェルのために、プレート1×10 5 HEK 293T 2ミリリットル完全増殖培地中の細胞[ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えた10％FBS]。
    2. 6ウェルプレート（0.3×10 5 HEK 293T細胞を、24ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットル完全増殖培地中で2ミリリットル完全増殖培地中でウェルプレート1.2×10 5 HEK 293T細胞/：フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために）。
  2. 製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションのためにDNAを準備のEffectene（キアゲン）を免疫するために使用されます。通過LT1（MIRUS）をフローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析のために使用される。使用されるDNAの量を以下に示す。
    24ウェルプレート（NG） 6ウェルプレート（ngの）

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Results

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AKAP-LBCとPDE4D3構築物（ 図1B）はそれぞれ、VNおよびVC断片と融合させた。 AKAP-LBCと機能YFP蛍光（ 図1A）でPDE4D3結果の相互作用。ここでは、PDE4D3でAKAP-LBC-結合部位をマッピングするBIFCメソッドを使用します。上流に保存された領域1（UCR1）、上流の保存された領域2（UCR2）と触媒領域（CAT）PDE4D3の結合部位をスクリーニングするために使用されたため、完全長（FL）、UCR1とUCR2プラスCAT、PDE4ファミリータンパク質間で保存されているAKAP-LBCへ。 VN-AKAP-LBC及びVC-PDE4D3フラグメント異なる強度（ 図1C）と蛍光のHEK 293T細胞の結果での発現。 BIFCはUCR1とUCR2両方+ CAT AKAP-LBCでPDE4D3の相互作用に寄与することを示しています。 AKAP-LBC-UCR1相互作用から生じる大きな蛍光強度は、AKAP-LBC-UCR2 + CATと比較した場合、PDE-UCR1はPDE-UCR2 + CATより良いAK.......

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Discussion

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BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのシンプルかつ高感度な方法である。この方法は、新しいタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために使用することができない、しかし、それは細胞内タンパク質 - タンパク質相互作用を確認することと機能的特性を研究するために特に便利である等のタンパク質複合体の細胞内局在として、タンパク質 - タンパク質相互作用部位のマッピング、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調節することができる小分子/ペプチドのスクリーニング。 VNとVC断片は、非蛍光性であるため、バックグラウンド蛍光は、このように、このアッセイの感度を助ける低い。時間はVN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用を成熟/安定化させるために必要とされる、このようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用の可視化に遅延があり、最適なの時点従って、経験的に決定する必要があるかもしれません。これは、VN-タンパク質-VC-タンパク質相互作用は可逆的ではないことにも注意すべきで、そのため残念ながら、現在の金星BIFCとこのアッセイがtは適していません構築oがタンパク質 - タンパク質相互作用の動的な動力学を研究する。

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Disclosures

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgements

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我々は、重要な実験的な評価と議論のためUICでオブライアンラボに感謝します。臨床およびトランスレーショナルサイエンスグラントUL1TR000050ためのUICセンター - この作品は、トランスレーショナル研究を進めるためのGKCとナショナルセンターに米国心臓協会グラント11SDG5230003によってサポートされていました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬
>Dulbecco’修正されたイーグル’Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/streprep), 100xInvitrogen15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen16000-044
Anti-Flag antibodySigmaM2, F1804
Anti-HA antibodyCovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A、T9026
抗 GFP 抗体Clontech632569
細胞培養プレート、6 ウェル組織培養処理済み サーモフィッシャーサイエンティフィック130184
HEK 293T 細胞ATCCCRL-11268
Maxiprep プラスミド精製キット、高速Qiagen12663
ダルベッコ’S リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、滅菌済み 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA、0.05% (w/v)Gibco25300
FACS 染色用ポリスチレン丸底チューブBD Biosciences352052
パラホルムアルデヒドFisher ScientificS74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP-36931
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-15
フィッシャーファイネストプレミアムカバーガラスフィッシャーサイエンティフィック12-548-5P
EQUIPMENT
>CO2 エアジャケット インキュベーターNuAIR DH オートフロー
共焦点顕微鏡 LSM510 METACarl Zeiss, Inc.
電気泳動およびトランスファーユニットBiorad
Cyan ADP Flow CytometerBeckman Coulter

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. ....

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Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

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