腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス S.ネズミチフス菌バクテリア

サマリー

これらの実験の目的は、弱毒化の増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである S.ネズミチフス菌細菌コロニー。このビデオでは、腫瘍細胞の準備と注入、細菌の準備と注入、全動物の発光イメージング、腫瘍切除、および細菌のコロニーカウントをカバーしています。

要約

これらの実験の目的は、弱毒Sの増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである腫瘍の内部で成長菌細菌コロニー。

我々は、OVCAR-8（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）、ヒト卵巣癌細胞系の皮下注射によってマウスにおける異種移植モデルの腫瘍を発生した。

私たちは、S.の弱毒株を変換可視化²用プラスミド構成的に発現ルシフェラーゼ（luxCDABE）と： ネズミチフス菌 （SL1344 ^phoPQ-1 ELH430）。マウス^1〜本質的に非病原性を維持しながら、これらの株は、特に腫瘍を植民地化する。

測定可能な腫瘍が確立した後、細菌は、投与量を変化させた尾静脈を介して静脈内注射した。腫瘍局在化、細菌の遺伝子発現を用いた60時間かけてリアルタイムでモニターしたvivoイメージングシステム（IVIS） であった 。各時点で、腫瘍を均質化し、切除し、そして遺伝子発現データとの相関のための細菌コロニーを定量するために播種した。

併せて、このデータは、腫瘍の内部に成長する細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスの定量的尺度を与える。

概要

合成生物学は、過去10年間で急速に進んでおり、現在はエネルギーと健康に重要な問題に影響を与えるように配置されている。しかしながら、臨床分野への展開は安全上の懸念及びin vivoでの遺伝子回路の設計基準を開発するの有無によって遅くされている。加速高い衝撃の医療アプリケーションでは医療インフラ、管理されたラボ環境の外に機能する遺伝子回路、安全かつ臨床的に受け入れられる微生物ホストと直接インタフェースする方法を利用して必要になります。

菌株の数は、腫瘍において優先的に増殖する能力に起因する癌治療のために研究されてきた。これらは、C.が含まれているノビイ、大腸菌、V. cholorae、B.ロンガム 、およびS.ネズミチフス^3-8。S.彼らは^9-12ヒト臨床試験の数は、安全性と寛容性を示してきたようにネズミチフス菌は、特定の関心を生成しました。これらbacteri最初にホストの免疫系の刺激を介して、癌細胞代謝に必要な栄養素の欠乏による抗腫瘍効果を作成することが示された。治療上の貨物の生産は後で遺伝子改変を通して追加されました。これらの研究は、腫瘍治療のための細菌の使用における重要な進歩を表しているが、既存の努力の大半は、典型的に高い投与量、オフターゲット効果、およびホスト抵抗^13-16の開発の送達をもたらす高レベルの発現に依存している。

さて、合成生物学は、高度なセンシングと配信^17-20を実行できる計算に設計遺伝子回路を利用することによって、プログラム可能な貨物の生産を追加することがあります。これらの回路は、腫瘍特異的な刺激を感知し、必要に応じて貨物の生産を自己調節する送達システムとして機能するように設計することができる。しかし、 生体内でこれらの回路の機能を研究することはこれまで挑戦してきました。

ve_content ">プラスミド、合成回路の共通のフレームワークであるため、我々は、マウスモデルを用いたin vivoでプラスミドベースの遺伝子発現のダイナミクスを特徴づけるための方法を説明しますこれらのメソッドは、タイムラプス発光イメージングと生体内分布の定量的測定を利用しています一緒に、これらのアプローチは、臨床応用のための生体内でのプラスミドベースのネットワークを研究するためのフレームワークを提供します。

プロトコル

1。細胞調製

1. 標準的な細胞培養技術を用いて継代細胞系。この実験では、OVCAR-8細胞（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）を用いた。 100％ - 80のコンフルエントターゲットに細胞を成長させる。
2. 5分間5ミリリットルトリプシンで細胞をインキュベートし、その後、5ミリリットルRPMI培地+ FBS、トリプシンを不活性化するために追加します。
3. 収穫と血球のセルを数える。 5×10 ⁷細胞/ ml、またはフラスコ当たり約200μlの目標濃度でフェノールレッド不含DMEMに再懸濁する。
4. 減少増殖因子マトリゲル（BD Biosciences社）15％を追加して、移植まで氷上で細胞懸濁液を保つ。

2。腫瘍移植

1. イソフルラン3％を使用した4週齢の雌NCR / nuマウスを麻酔し、深い麻酔を確保するために、約5分待ちます。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。
2. 1ミリリットルの注射器で細胞を（腫瘍あたり100μl）をロードし、27 1を添付/ 2ゲージの針。
3. 2国間後肢フランク注射部位のそれぞれについて、テントを作るとベースで細胞を注入するためにピンセットで優しく肌を持ち上げます。血を生産、あまりに深く浸透しないように注意してください。優しくはねずにシリンジをピンセットで取り除いてください。
4. 2の腫瘍直径まで20日 - - 4ミリメートルに達した10毎日腫瘍の成長を監視します。

3。細菌の準備

1. -80℃の冷凍庫ストック又は冷蔵プレートから3ミリリットルLB培地+アンピシリン中の細菌の一晩培養を開始します。この実験では、使用されるS.ネズミチフス菌株ELH430（SL1344 PhoPQ-のaroA-）。
2. 午前中は、フィルタリングLBに文化1:100に希釈し、OD600 0.4に成長 - 0.6。
3. スピンダウンとリンで3回洗浄する生理食塩水（PBS）は、バッファリングされ、0.1の最終OD600（1×10 ⁷細胞/ ml程度）で再懸濁します。

4。細菌インジェクション

1. 動物を麻酔あなたの利き手に向かって指している尾を持つその側にDポジション。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。
2. 温水または熱ランプを用いて尾静脈を拡張する。
3. 1ミリリットルのシリンジ内細菌（マウス当たり100μlの）をロードし、90度弱の先端を曲げる。
4. 尾静脈とシリンジ先端を合わせ、浅い深さ（全く抵抗を感じないはず）に浸透し、細菌を注入する。成功した注射用血流の変位を観察する。

5。マウスイメージング

1. 誘導室に動物を麻酔はその後イメージングプラットフォーム上の各マウスを置きます。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。時点との間の定量的な結果を保証するために正確な位置決めを維持する。
2. IVISスペクトラムイメージングシステム（キャリパーライフサイエンス）を使用して、画像の動物。それらの間のイメージング以上1動物、場所光バリア、クロスilluを防止する場合mination。動物は、細菌の局在を確認するために、腹側の第1の結像されるべきである。
3. 画像の動物は背IVISの実験期間（36時間）ごとに2時間を使って。与えられたROIのタイムコースを生成します。

6。細菌の生体内分布を定量

1. 吸収おむつで背中にCO ₂と場所を使って動物を安楽死させる。
2. 2後肢脇腹皮下腫瘍を露出するために動物を回します。腫瘍を分離除去するために周囲の皮膚組織をカット。ピンセットで腫瘍を保持し、逆はさみの動きを使って皮膚を除去。皮膚の大部分が分離されたときに、完全にピンセットを用いて腫瘍を取り除く。
3. 予め秤量マイクロチューブ内の臓器を置きます。これらのチューブの質量が大きく異なりますので、それは定量的な結果のためにそれらを事前に比較検討することが重要です。

7。細菌の生体内分布を定量

1. 各時点で、消費税のために、腫瘍重量を量る。
2. 500μlのPBS + 15％のグリセロールを追加し、組織特異Tearor（BIOSPEC）を使用してホモジナイズする。サンプル間のエタノールでホモジナイザー3回すすいでください。
3. 段階希釈し、細菌コロニーカウント用のプレートを生成します。単板を使用し、事前区分プレート上にプレートを複数の希釈に。

結果

このプロトコルを使用して、我々は腫瘍標的細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスに関するデータを生成することができる。全体的なワークフローを図1に要約する。

第一段階では、細菌（緑）画像のレポーターとしてルミネッセンス（青）で遺伝子発現を測定するためにIVISを用いて動物を注入する。

次に、第二段階では、我々物品は、均質化、およびコロニー数についてのプレート腫瘍は、腫瘍の成長細菌の数を決定する。

菌株によって生成された生物発光を可視使用IVIS（ 図2）である。 5×10 ⁵の周り最小植民投与量（ 図2A）を注入した投与量の信号が増加。すべての場合において、弱毒化細菌はいずれか一方のみの腫瘍特異的に定着するか、またはマウスにおいて成長しなかっすることができる。信号がnormaliに輝きユニットを用いて定...

ディスカッション

この手順を用いて、腫瘍を定着細菌の増殖および遺伝子発現動態のタイムコースを生成することができる。これらの測定は、定期的にバッチ培養又はマイクロ流体デバイスにおいてインビトロで行われるが、それらはインビボで行うことがはるかに困難である。

これらの方法を適用することができるいくつかの変更がある。我々はマウスモデルを生成するためにOVCAR-8細胞株を使用しながら、他の細胞株の数を同等に使用することができる。例えば、luciferized細胞株は、腫瘍および細菌ルシフェラーゼチャネルの3D局在を可能にすることを使用することができる。我々は、バイラテラル後肢脇腹モデルを使用しながらさらに、異なる数および注入部位の位置が異なる現象を研究するためのモデルを生成するために使用することができる。例えば、もし腫瘍の大きさは重要な変数である、細胞の連続希釈物を調製することができ、Smalの生成、同時に異なる部位に注入LERと大きいサイズの腫瘍。最後に、我々はSを使用しながらネズミチフス菌株ELH430、Sの他の株...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 ml シリンジ	BD Biosciences 309602
3/10 cc インスリン シリンジ	BD バイオサイエンス	309301
PrecisionGlide ニードル	BD バイオサイエンス	301629
RPMI ミディアム 1640 (1X)、液体、L-グルタミン配合	Invitrogen	11875-119
アンピシリン	シグマ アルドリッチ	A0166-5G
LB 寒天ブロス	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani ブロス	BD Biosciences	244610