マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Lyuba Khavrutskii; Joanna Yeh; Olga Timofeeva; Sergey G. Tarasov; Samuel Pritt; Karen Stefanisko; Nadya Tarasova

doi:10.3791/50541

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方法論記事

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

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DOI：

10.3791/50541

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2013年8月15日

Lyuba Khavrutskii¹^,² , Joanna Yeh¹ , Olga Timofeeva³ , Sergey G. Tarasov⁴ , Samuel Pritt¹ , Karen Stefanisko¹ , Nadya Tarasova¹

¹Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, ²Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., ³Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, ⁴Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

責任著者： Nadya Tarasova <Nadya.Tarasova@nih.gov>

この記事について

サマリー

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。

要約

タンパク質相互作用の定量的特性評価、特に生命科学、創薬の実質的にすべての分野で必要不可欠である。 K _D判定_の現在利用可能な方法のほとんどは、時間がかかり、高価である生成うち目的のタンパク質を精製へのアクセスを必要とする。我々は、細胞溶解物から標的タンパク質の精製をせずにマイクロ熱泳動（MST）による結合親和性の決定を可能にするプロトコルを開発した。この方法は、非変性条件下でのGFP融合タンパク質および細胞溶解の過剰発現を伴う。 STAT3-GFPへの法の適用は、一過性に初めて異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによく研究転写因子の親和性を決定するために許可されたHEK293細胞で発現。プロトコルは、簡単であり、小分子、ペプチド、DNA、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための、アプリケーションの様々な構造を有することができ、及びproteins。

概要

分子間相互作用の親和性の定量的特性評価は、生物医学研究の多くの分野において重要である。結合定数（K _D）解離だけでなく、創薬に不可欠であるだけでなく、任意の生物学的システム内の任意のバイナリの相互作用の特性評価に重要なパラメータである。このような免疫沈降および酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのタンパク質-タンパク質相互作用の検出のために使用生化学的方法では、親和性は、この特定の複合体が、生体内で与えられた条件の下に存在するかどうかを定義しながら、それらの相互作用は、どのように締まっている私たちを上に通知していない。創薬プロセスにおいては、結合アッセイの開発が必要と頻繁に最も時間のかかる工程の一つである。 K _D判定_の最も一般的に使用される方法は、蛍光偏光^、1表面プラズモン共鳴（SPR）技術^、2放射性リガンド結合^、3等温滴定熱量測定^、4 equilibriを含むウム透析^（ED）、5限外濾過^（UF）、5及び超遠心分離^{（UC）6は、}それらのすべては、標的タンパク質の精製かなりの量を必要とする。マイクロスケール熱泳動（MST）は、微視的温度勾配中の分子の指示動きを検出急速に発展方式です。温度勾配に沿った移動の相対的な変化で生体分子結果の水和殻のいずれかに変化する^。7 MST....