Method Article

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

DOI:

10.3791/50541

⸱

August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

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マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。

Abstract

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タンパク質相互作用の定量的特性評価、特に生命科学、創薬の実質的にすべての分野で必要不可欠である。 K D判定の現在利用可能な方法のほとんどは、時間がかかり、高価である生成うち目的のタンパク質を精製へのアクセスを必要とする。我々は、細胞溶解物から標的タンパク質の精製をせずにマイクロ熱泳動（MST）による結合親和性の決定を可能にするプロトコルを開発した。この方法は、非変性条件下でのGFP融合タンパク質および細胞溶解の過剰発現を伴う。 STAT3-GFPへの法の適用は、一過性に初めて異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによく研究転写因子の親和性を決定するために許可されたHEK293細胞で発現。プロトコルは、簡単であり、小分子、ペプチド、DNA、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための、アプリケーションの様々な構造を有することができ、及びproteins。

Introduction

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分子間相互作用の親和性の定量的特性評価は、生物医学研究の多くの分野において重要である。結合定数（K D）解離だけでなく、創薬に不可欠であるだけでなく、任意の生物学的システム内の任意のバイナリの相互作用の特性評価に重要なパラメータである。このような免疫沈降および酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのタンパク質-タンパク質相互作用の検出のために使用生化学的方法では、親和性は、この特定の複合体が、生体内で与えられた条件の下に存在するかどうかを定義しながら、それらの相互作用は、どのように締まっている私たちを上に通知していない。創薬プロセスにおいては、結合アッセイの開発が必要と頻繁に最も時間のかかる工程の一つである。 K D判定の最も一般的に使用される方法は、蛍光偏光、1表面プラズモン共鳴（SPR）技術、2放射性リガンド結合、3等温滴定熱量測定、4 equilibriを含むウム透析（ED）、5限外濾過（UF）、5及び超遠心分離（UC）6は、それらのすべては、標的タンパク質の精製かなりの量を必要とする。マイクロスケール熱泳動（MST）は、微視的温度勾配​​中の分子の指示動きを検出急速に発展方式です。温度勾配に沿った移動の相対的な変化で生体分子結果の水和殻のいずれかに変化する。7 MST....

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Protocol

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1。細胞溶解物の準備

このプロトコルは、任意のGFP融合タンパク質を発現する接着細胞を対象としています。必要とされる細胞数は、低タンパク質発現のレベルに応じて、最大20×10 6細胞〜6 10とで変えることができる。例えば、HEK細胞を過剰発現するGFP-STAT3の溶解物を、1mlの溶解緩衝液で70％コンフルエントに近い10 T75フラスコ中で培養した細胞を処理することによって調製した。しかし、この溶解物MST実験に蛍光の最適なレベルを提供するために150倍に希釈しなければならなかった。細胞溶解プロトコルは、調査中の性質と蛋白質の細胞内局在化に強く依存する。洗剤を使用しているため、タンパク質の不安定性の望ましくない場合は、超音波処理は、以下に説明するように、最良の選択かもしれません。別の添加剤は、タンパク質の修飾反応を防ぐために、溶解緩衝液に添加することができる。EDTAは、リン酸化を防ぎ、バナジン酸ナトリウムので、チロシンプロテインホスファターゼの阻害diumフッ化セリン/スレオニンホスファターゼの阻害剤である。

  1. 溶解バッファーを準備します。以下の組成がうまくための簡単​​に抽出する細胞質タンパク質：25mMトリス塩酸、pHは8.0、および2mM AEBSF、0.3μMアプロチニン、130μMのベスタチン、から構成される（シグマアルドリッチP2714、100倍希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル1mMのEDTA....

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Results

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オリゴヌクレオチドに結合非リン酸化STAT3タンパク質の親和性を測定する。

STAT3-GFPを発現するHEK293細胞を、DNA結合アッセイのために蛍光標識されたSTAT3の供給源として使用した。細胞溶解物をRIPA緩衝液（20×10 6細胞/ ml）を用いて調製した。結合研究のために、溶解物を結合反応（約20nM）の蛍光タンパク質の最適なレベルを提供するようにMST-DNA結合緩衝液で150倍希釈した。非トランスフェクトHEK293細胞であっても、非希釈した溶解物の非検出可能であることが判明したバックグラウンド蛍光を評価するために使用されている。しかしながら、バックグラウンド蛍光は、他の発現系においてより顕著にすることができるので、監視されなければならない。リガンド結合せずに11混合物および溶解物からなる試料の滴定一連調製されている。各サンプルは、希釈細胞溶解液15μlのとconcentratを変えるのオリゴ液15μlのが含まれていたイオン。 50mMのNaCl;; 2.5のMgCl 2、および0.02.......

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Discussion

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タンパク質の発現および精製は、しかし、ほとんどの現在使用されている方法により相互作用'K Dを決定するために必要な労力を要しかつ高価な工程である。 MSTの適用が大幅に相互作用の定量的な特性評価を簡素化し、加速するため、タンパク質精製を避けることができます。このような膜タンパク質及び転写因子などの困難な発現及び精製タンパク質の場合に特に顕著な利点を提示する。

MSTの主要な制限と要件は、緑色蛍光タンパク質との融合体としてタンパク質を発現する能力である。しかし、GFP-融合したヒトおよびマウスタンパク質の大部分を発現させるための構築物は、市販されている。 GFP融合タンパク質はまた、広くトラフィッキング及び分解研究のために使用されているので、MST試験と組み合わせて "ダブル義務"を果たすことができる。

タンパク質ウェブの必要性の欠如に加えてK D判定の従来の方法と比較した場合、すべての試薬 ​​およびバッファー組成のわずかな変化に鈍.......

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Disclosures

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。本書の内容は、必ずしも、保健社会福祉省の見解あるいは政策を反映していない、また、商号、商用製品、または組織の言及は、米国政府による承認を意味するものではありません。

Acknowledgements

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からとフェデラル·ファンド; NCIとCalidrisピュー間共同研究契約、; OTに米国癌協会助成IRG 97-152-17この作品は、部分的にNIH、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました契約HHSN26120080001E下の国立がん研究所、NIH、。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RIPAバッファーミリポア20-188他のメーカーのバッファーも同様に機能します
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP2714
モノリス NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
モノリス NT.115 キャピラリートレイNanoTemper Technologies GmbHT001
モノリス NT.115 標準処理キャピラリーNanoTemper Technologies GmbHK002
NT制御ソフトウェアNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT分析ソフトウェアNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
卓上型冷蔵遠心分離機Eppendorf5417Rその他のマイクロチューブ冷蔵遠心分離機
Protein LoBind Tube 0.5 mlエッペンドルフ22431064

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

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Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

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