我々は、海洋アメフラシの神経系の解剖を説明アメフラシ麻酔の後、短期·組織培養のための神経細胞、およびパッチクランプ法を介した単一細胞イオン電流の録音の分離。
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この記事について
サマリー
要約
海洋腹足類軟体動物アメフラシカリフォルニは、学習と記憶の研究において特に重要で、神経系機能のモデルとして由緒ある歴史を持っています。このような研究のための一般的な準備は、感覚と運動ニューロンを最小限解剖動物、または個々の感覚と運動ニューロンの技術的に精巧な神経細胞の共培養にそのまま残されているものです。あまり一般的では公称均質ニューロンの小さなクラスターは短期培養における単一細胞に解離されている孤立したニューロンの準備です。そのような単離された細胞は、パッチクランプ技術、およびこれらのコンダクタンスの目標変調を用いたイオン電流の生物物理学的特徴付けに有用である。このような培養物を調製するためのプロトコルが記載されている。プロトコルは胸膜と頬神経の容易に識別グルタミン酸感覚ニューロンを活用して、それらの解離と最小限のメンテナンスを説明I血清を含まない数日間のn文化。
概要
海洋opistobranch軟体動物、 アメフラシは 、何十年もの間、有用な神経生物学的モデルとなっています。これは最高の馴化と古典的条件7,8のモデルとして知られています。このモデルでは学習と記憶に関する研究は、彼がArvidカールソンとポールグリーンガード10と共有賞で、エリックR.カンデル2000年に生理学·医学ノーベル賞を受賞した。この無脊椎動物の神経系の要素が付加左神経と筋肉との動物から解剖されている削減の準備からの電気録音を、関与する研究は、 アメフラシの個々の神経細胞の役割を解明に役立っています。しかしアメフラシでの学習を構成する精密な分子メカニズムの識別は、多くの場合、個々のドナー動物から1つずつ取得し別の技術、感覚ニューロンと運動ニューロンの長期共培養を採用し、培養皿21でシナプスを形成させ。
我々は、他の1,3,6、14、15、16は、名目上均質なニューロンのクラスタの解離短期間培養物を作るためにニューロンは、このモデルで対象とすることができる同定ならびに長期の実験では、その耐久性の容易さを利用しているている私たちは、パッチクランプ構成で電圧クランプの下にイオン電流を勉強。多くのアメフラシニューロンは長続き実験操作のための時間を可能にするためにパッチクランプを繰り返しラウンドに立ち上がる。技術は、腹部の神経節の神経分泌袋細胞、解離我々はここで説明する胸膜と頬神経節の感覚ニューロンとしてニューロンのためではなく、非常に大規模なニューロン>60μmの径などのL7またはR2などに便利です腹部神経節。我々は他の場所に記載感覚ニューロン共培養とは異なり、私たちの文化でアメフラシ血清を使用しない。この手順を使用して得られたほとんどのニューロンはtに対してプロセスがなくてもなります彼は全体のセル電圧記録を促進する文化の中で最初の48時間、しかし、その後、新芽や栄養素、および/または成長因子の不足から、死ぬ前におよそ14日間軸索と他のプロセスを詳しく説明します。
この手法は、頬や胸膜神経の生理的に文書化された地域から皿当たり50〜100のニューロンの初代培養を生成します。このプロトコルは、多数の実験は、動物ごとに複製が必要な実験で単一細胞生理学の側面を研究する研究者にとって有用です。それは一致した治療群と対照培養物から研究その利益を可能にして、左右hemigangliaに標的細胞の解剖学的分離に起因する文化のペアを生成します。
プロトコルは、頬神経の頬Sクラスター（BSC）ニューロン、および胸膜神経節の胸膜ventrocaudal（PVC）のニューロンを対象としています。これらの細胞は、全体セル電圧の記録および表示ローバスに適したサイズであるTグルタミン酸応答。議論の方法論は、 アメフラシ神経系の中で最も神経に適しています。
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プロトコル
1。細胞調製
- 1日目に、動物の重さと麻酔。
- 30グラム、1キロの動物を計量。等張のMgCl 1:1海水の5-10動物ボリュームで麻酔。このような添付airstone付き電動アクアリウムエアーポンプとしてエアレーションと1時間6H 2 0。
- 解剖の供給を準備します。
- このような生地のピンとしてステンレス鋼ストレートピン、クリーンな解剖トレイを組み立てます。 +ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、（ 表1、表3を参照ASW）人工海水を含むいくつかのペトリ皿を組み立てます。
- 準備ができて低電力顕微鏡を持っている。きれいな解剖器具などリブ鼻や細かい手術鉗子として、準備、および罰金と大手術ハサミを持っている。使用前に70％isopropolアルコールで楽器をスプレーし、乾燥させます。
- 解剖トレイ上の位置動物。
- 解剖トレイの位置動物腹側を下に。ピン動物体壁とparapodial国境が、背側表面を露出させる、尾と頭を避け、性器溝の縁を通じ
- 実行速度の遅い冷たい水道水で背面をすすぐ。性器の溝に沿って、頭の上にスクイーズボトルから70％isopropolアルコールの光のストリームを適用します。
- 最初の切開を行います。
- シャローを切り取るながら低消費電力顕微鏡を用いた（ 表2を参照）、性器溝が前方シェルマージン由来する点を観察する反射光を、張った状態、リブ·鼻鉗子この原点の左に組織の倍とホールドちょうど良い角度のハサミで性器の溝の右側に体壁の円滑な、平坦な領域を介してすべての道を穴。
- 血リンパは、時にはそれと腹部神経節と胃を運んで、穴から注ぐことが観察されるべきである。
- 切開を展開します。
- 目を拡大し、大きなハサミを使用して腸をニッキング避けるために下刃を上向きに引っ張りながらrhinophores間のポイントに前方に電子切開、。内臓は、切開の外にこぼれることが観察されます。
- 神経を取り除きます。
- トレイの位置を変更し、頭部領域に顕微鏡再び焦点を合わせる。
- クリーン鉗子と細かいハサミを使用して、ある時点でのグループとして胸膜ペダルと大脳基底核を除去するために食道の周りにリングに頭部神経節を形成する神経を切断することによって頭部神経節を削除します。
- 食道の腹側に付着した頬神経節を削除します。
- この神経節から4大神経接続詞その問題を切断することによって腹部神経節を削除します。
- 興味のある神経を分離します。
- 神経節の少なくとも直径に等しい関心の各神経節に付着結合子の長さを残して、離れて頭部神経節をトリム、これは酵素遅らせますオーバー消化次のステップで目的の細胞の。
- 清潔なピンセットでリンスの間を移動する、ASWの2リンス+ P / Sを各ターゲット神経節を置く。
- PVCの細胞を標的とする場合は、右のペダルhemiganglionに装着右胸膜hemiganglionを残しており、同様に左ペダルhemiganglionに装着左胸膜hemiganglionを残す。
- 不要な神経と受け入れ研究実践によると、動物の残りの部分を破棄します。
- 酵素的に神経を消化。
- 各神経節の場合は、3.75 mgのディスパーゼ、1mgのヒアルロニダーゼ、15ミリリットルのポリプロピレン製コニカルチューブにASW + P / Sの1ml当たり0.3グラムコラゲナーゼタイプXIから成る酵素溶液1mlを準備します。
- 場所は、酵素溶液中の神経をすすぎ、しっかりとキャップを取り付けてください。約23℃（室温）で一晩13-5時間低速でロータリーシェーカー（ 表2参照）にその側にチューブを置きます。
- 準備をする培養皿。
- 顕微解剖（2日目）の前に、組織培養フード内でポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされた培養皿を準備します。 〜25分間35mmディッシュの中央に〜0.5ミリリットルPDLを（滅菌水の0.2 mg / ml）で追加します。
- 滅菌水で3回PDLをすすぐ。乾燥することができます。プレートUV-殺菌。
- 2日目は、ニューロンを分離します。
- PDLでコーティングされ、それ以外の場合は乾いたシャーレ内にメディアの島を作成するASW + P / Sの約0.5mlの滅菌UVだった35ミリメートル皿の中心を埋める。これは、組織培養フードの外側に、ベンチで行うことができる。一皿はhemiganglion由来する各セルクラスタのために準備されるべきである。
- SYLGARDコーティングによって作ら準備が直径100mmの解剖皿を持ち、ピンとプローブとして使用するいくつかのサイズの微細な解剖ピンを装備5ミリメートル深い解剖表面を、（ 表3参照）硬化。 ASW + P / S、そして最後Fi付き、その後、70％isopropolアルコールでこの料理をすすぐASWとのそれのll + P / S.
- 消化された神経の顕微解剖を準備します。
- 解剖皿に消化胸膜ペダルと頬神経節を含む酵素溶液を注ぐ。
- 反射した光の下で黒の表面に対して顕微鏡のステージ上にお皿を置きます。
- 添付された結合組織を使用して、各胸膜ペダルhemiganglionの背側を突き止める。組織は柔らかく、ストレッチの不寛容になります。
- PVCニューロンを顕微解剖。
- きれいな細かい鉗子の2ペアを使用して、プローブとして鉗子の一組で細かい解剖ピンを保持し、胸膜hemiganglionからPVCの細胞を単離する。酵素消化は、削除またはPVCクラスタをカバーする結合組織鞘を離れて壊れ、まだ細胞が互いに付着することになります。
- 解剖の底に細胞クラスタ落下させた後、ペダル胸膜結合18からこれらの細胞を分離するために、プローブを使用ディッシュ。
- 培養皿にニューロンを転送します。
- 静かに気泡を導入しないように注意しながら、その後、培養皿のメディア島にゆっくりとそれを分配する、少し火磨か使い捨てガラスパスツールピペットの先端にクラスタを吸引することによって準備された35ミリ培養皿に細胞クラスタを転送ピペットに。独立した培養皿に他のhemiganglionと場所のPVCクラスタの分離を繰り返します。
- BSCニューロンを顕微解剖して転送。
- 目的の細胞を倹約するために注意して、頬神経腹側を上にしてピン。頬神経節10の2 BSC細胞クラスターとステップ1.12を繰り返します。
- BSCクラスタを含む2皿とPVCクラスターを含む2皿：PVCとBSCニューロンの単離ニューロンクラスターを含む4培養皿を生成します。神経節の残りの部分を破棄し、100ミリメートル解剖皿を脇に置きます。
- Dissoc細胞クラスターをイアテ。
- 低消費電力の顕微鏡のステージ上に細胞を含む培養皿を置き、カバーを取り外します。
- 優しく鉗子で開催された微細な解剖ピンと細胞クラスターに隣接する培養皿の底部をフリックでPVCクラスタを解離する。プラスチックの斑点を掘るしようとしているかのようにフリックは、皿の底のプラスチックにピンの先端を掘っている。プラスチックとの摩擦は、ピンポイントを解放すると、パーカッション波が離れて細胞の近くの塊を壊す媒体を介して産生される。
- 5-10フリックは、ほぼ完全に細胞を解離するために必要な、しかし、それは細胞が機械的な薄手では破壊されないように、あまりにもフリックではなく、細胞の小さなクラスターを残した方がよいこともできる。
- カバーやその他の培養皿で繰り返し交換してください。
- 細胞培養に保管してください。
- に解離細胞とその中心にメディアアイランドを含む培養皿を置きこのような150×25ミリメートルラウンドプラスチックシャーレとして空気の循環を、許可し、17℃にインキュベーターセットにこの料理を置き大型コンテナ
- チャンバ内の湿度の源としての水のオープン皿をインストールします。邪魔されずに一晩にしておきます。細胞はシャーレの中央にポリ-D-リジンコーティングに付着する。
- 洪水培養皿。
- 3日目に、ゆっくりとASW + P / Sの2.5 mlで料理をあふれさせる反転した細胞培養顕微鏡を用いて細胞を調べ、数える。 17℃のインキュベーターに保管してください。
2。電気生理学
方法は、（ 例えばザクマンとネーアー、1995）、多数のテキストに16を説明してきたそのクランプ標準パッチです。このプロトコルは、細胞上の≤100pFの容量、またはセル<プロトコルの3日目と4の間に60μmの径を動作します。プロセスなしで細胞が記録のために最適である。次の特殊consideratイオンが適用されます：
- 大きな細胞はβ= 0.1に設定Axopatch 200Bアンプの構成設定と対応することができる。非常に大きな電流の活性化は、細胞が電圧クランプをエスケープすることがあります。 ASWのソリューションは、（不浸透性N-メチル-D-グルカミンクロライドで置換された、NaClの例フラクション）塩の含有量に置換全細胞電流振幅を低減するために使用することができる。
- 繊維充填ホウケイパッチピペットピペットプラーで引っ張られ、450 mMの塩化カリウムや他の塩からなる細胞内液（ICS）と途中で埋めます（ 表1を参照）が適しており、約0.5〜1 Mオームの抵抗値を持っている必要があります。特定のイオン電流の分離が所望される場合、例えば、この溶液中のK電流、K +の非存在下でのNa +電流は、例えばセシウム+などの他のイオンと交換することができる。 Cl -のより自然なICSが望まれているなら、透過性アニオンとICSの交換も保証されて9。
- 細胞は室温で可能> 1時間にわたる録音で堅牢です。録音は文化の中で24〜48時間に対応した、3日目とプロトコルの4に最適である。 48時間後に細胞表面にあるため糖衣の精緻化にたぶん、ギガオームシールを形成する難しさ、およびプロセス伸長によって引き起こされる空間クランプ問題がある。細胞は<14日で完了することができるような毒性などの非パッチクランプ研究、、のために、便利な、しかしである。
- ASWと他のソリューション重力供給溶液装置から分配されるだけでなく、細胞内の溶液を、を通して濾過されるべきギガオームシール形成を妨害微粒子を除去するために0.2ミクロンAcrodiskフィルタ（ 表3）注射器に取り付けられた。
- 例えば、D-アスパラギン酸（D-ASP）アゴニストを使用する際に脱感作が生じ、したがってアゴニストのアプリケーションの間で〜1〜2分が推奨されます。逆に、増強は、多くの場合、迅速な繰り返しアプリで観察される例えば、L-グルタミン酸（L-グルタミン酸）などのアゴニストの陽。
- 例えば、L-Gluのようなアゴニスト活性化電流はpicospritzerピペットでアゴニストを適用することによって研究することができる。このピペットは、パッチピペットと同じように引っ張られ、ASWにアゴニストが含まれています。このピペットの先端は、重力供給溶液装置の流出パイプの下方に配置され、流出管（ 図2F）から45°の角度で、アゴニストは速やかに細胞から洗い流さされ、脱感作が最小化されるとき。アゴニストピペットは90°またはパッチピペットへのよりの角度を作成する必要があります。
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結果
このプロトコルにおいて対象となる神経節内の感覚ニューロンの位置は、BSC及びPVCニューロンは、 図1に示されている。 BSCのニューロンは頬神経節の腹側に2対称の楕円形のクラスター、そのまま神経節（ 図1A）で頬塊から離れて対向する面に配置されています。 PVCニューロンは中心軸（ 図1B）に向かって胸膜神経節の背面の周りをラップする二国間の、V字型のクラスターを形成。右または左のクラスタが発生の約1％で、個々の動物では欠けているが、これらの感覚ニューロンは、神経節内のステレオタイプの場所の利点を持っている。 図1Aの大円輪郭に示すように、BSC及びPVCニューロンクラスタは、細胞膜の濃いオレンジ色や周辺の細胞と比較して相対的に小さいサイズによって識別可能である。
文化の中で、これらのニューロンは、めっき後のプロセスなしでしばしば日です（ 図2A）と、1日後、その日パッチクランプに最適です、と。それは、細胞が全て...
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ディスカッション
解離技術はグリアや他の未確認の細胞の小さな数字が点在50〜100孤立したニューロンを含む感覚ニューロンの文化を生み出す、ここで説明。プロトコルの中で最も重要なステップは、神経、酵素溶液中に残存する時間であり、そして、個々の細胞にクラスターを分解する消化細胞塊の解離をフリック。酵素消化（ステップ1.8）が使用可能温度で最適化する必要があります。 23°遅い振とうしながら℃で、13時間はBSCクラスターwhile15時間の消化のために十分であるPVCクラスタに最適です。培養皿に低い細胞収量は細胞転写工程（1.11と1.12）のどちらかの間またはフリックステップ（1.13）中の酵素が不足時刻、またはあまりにも機械的な破砕に起因することができます。培養基質まで固執する細胞の故障だけでなく、文化の中で簡単な生存は通常すぎて機械的破壊によるものです。 CULの汚染トゥーレスにも発生することができ、最高の麻酔動物がよく解剖器具が汚れていない、すすぎ、興味のある神経はASWのいくつかのリンス+ P / Sを通されていることをされていることを確実にすることによって対処されるこれは、解剖手順の異なる部分の間に器具を洗浄し、アルコールクリーンする必要がある、...
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
NIH P40 OD010952、Korein財団、SLCとATKのメイタグフェローシップへマイアミフェローシップ大学によって資金を供給。作者は感謝アメフラシのための国家資源のスタッフを認めるだけでなく、図のための顕微鏡写真を提供したローレンSimonitisとハンナペック、。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 人工海水対潜水艦戦艦 | Σ-Aldrich | アソート | (mM):417 NaCl、10 KCl、10 CaCl2(2 H2O)、5MgCl2(6H2O)、15 HEPES-NaOH、pH 7.6 |
| 細胞内溶液 | Σ | ソート | (mM):450 KCl、 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシンがASWに1:100 | Lonzo Walkersville, Inc.に追加されました。 | 17-603E | 5,000単位/mlのペニシリンと5,000mg/mlのストレプトマイシン |
| 性ディスパーゼII | ロシュ診断 | 10165859001 | |
| ヒアルロニダーゼ | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| コラゲナーゼXI型 | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-グルタミン酸(L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-アスパラギン酸 (D-ASP) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA) | バイオモール | 100002-268 | |
| L-ASP | Σ | A6683-25G | |
| α-アミノ-3-ヒドロキシル-5-メチル-4-イソオキサゾール-プロピオン酸(AMPA) | Sigma | A6816-5MG& | nbsp; |
| L-Glu R拮抗薬 | 各種 | ||
| 寒天 | |||
| キヌルネート | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | シグマ・アルドリッチ | A5282 | |
| DL-2-アミノ-5-ホスホノペンタエン酸(NMDARアンタゴニスト) | |||
| 2-プロパノール | VWRSP | BDH1133 | |
| 塩素化液 | シグマ | アソート | 25gFeCl3+25ml濃縮HCl + 50mlH2O |
| ガードシリコーン2液性ポリマー | ワールド精密機器(WPI) | SYL184 | 小さな解剖皿用のピンアウト面を提供します |
| 解剖用の0-40倍ズーム倍率顕微鏡 | ワイルド | ||
| TQ FOI-150 | Techniquip 150ワット光ファイバー | マイクロオプ | |
| RotoMix 50800 オービタルミキサー | |||
| Nikon Diaphot倒立位相差顕微鏡(4倍、20倍(オプション)、40倍対物レンズ) | SR Research Ltd. | アイリンクII | |
| テクトロニクス・デジタル・オシロスコープ | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 データ取得・解析ソフトウェア | Molecular Devices | ||
| Windows XP以上のオペレーティングシステムを搭載したPC | PCソリューション | ソリッドステートハードドライブ(80GB)と低ノイズモニターを備えたThinkserver | |
| レーミング/ブラウンP87マイクロピペットプーラー | Sutter Instruments、Novato、CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B クランプアンプ、静電容量補償範囲 1-1000 pF; プリアンプ | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon機器 Axopatch 200Bプリアンプ用電極ホルダーアセンブリ | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| ピコスプリッツァー、圧力と持続時間のために調整可能なN2によって駆動 | カーハニフィン、クリーブランド、オハイオ州 | ||
| TMC Micro-G 除振テーブル | アメテック | ||
| ファラデーケージ | カスタム製造 | ||
| バーレー圧電クラムシェルマイクロマニピュレーター | バーレーインスツルメンツ;Thorlabs | は現在PCS-5000; -6000シリーズ+ | |
| 成茂M-152手動マニピュレーター(灌流システムおよびピコスプリッツァー用) | 米国 | nbsp; | |
| フィラメントピペットガラス、外径1.5 mm、内径0.84 mm - | WPI | 1B150-3 | |
| 3インチの長さ | |||
| Ag/AgClハーフセル | WPI | EP4 | |
| 15 ml遠心分離管、35-2097 BD Falcon *遠心分離管 | VWRSP | 21008-918 | |
| 角度付きはさみ | ファインサイエンスツール | 15006-09 | |
| デュモスターファイン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11295-00 | |
| 35 mmファルコン組織培養皿 | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | は、sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| 動物解剖トレイ | 各種 | ||
| 15 mLの遠心分離管、35-2097 BDの鷹 | VWRSP | 21008-918 | 6穴の重力供給の灌流システムのための |
| ねじ穴の端が付いているアルミニウム クリップ | 物店 | 灌流システムのための | |
| 23のゲージの針(ポイントを離れて手動でファイルをかける) | VWRSP | 灌流システムのための | |
| ポリエチレンの管 0.022" ID x 0.042" OD; 427411 | Becton-Dickinson | のための灌流システム | |
| H-7 マイクロキャップ灌流アレイ用スタンド/ホルダー | ナリシゲ USA | 灌流システム | |
| 用 一方向弁 | 灌流システム用 | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | 灌流システム用 | |
| 吸引用18ゲージ針(ヤスリオフポイント) | |||
| ポリエチレンチューブ | コールパーマー | 4.27436E+11 | |
| ファイン解剖ピン | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| キャピラリーチューブキン | ブル71900-100 | 、ブンゼンバーナーの炎でファイヤーポリッシュされ、U字型で、ECSモデリングクレイクラフトストア | |
| 分離された地上浴 | 製造 | ||
| パスツールピペット | VWRSP | 14672-412 | |
| ピペット電球 | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodiskシリンジ | フィルターVWRSP | 28144-040 | |
| 厚肉1.5mm径ホウケイ酸フィラメントガラス | WPI | 1B150F-3 | |
| 高純度窒素ボンベと分岐レギュレータ | ー | ||
表1-3。試薬、材料、機器のリスト. |
参考文献
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