この研究では、主な目的はカーボンナノチューブ(CNT)の細胞への取り込みと最終的なエキソサイトーシスを監視することでした。この観点から、ここでは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを使用して、統計的に関連性のある数の細胞におけるCNTの定量と局在を可能にする独自の方法を提案しました。
方法論記事
マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる細胞内カーボンナノチューブの局在と相対定量(英語)
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この記事について
サマリー
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要約
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カーボンナノチューブ(CNT)のような炭素ベースのナノ材料は、このタイプのナノ粒子に属しており、炭素が豊富な細胞構造と区別することは非常に困難であり、事実上、細胞および組織レベルでの分布を評価する定量的方法はまだありません。ここで提案するのは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメーター(ImageStream、Amnis)を使用して細胞内のCNTを検出および定量できる革新的な方法です。この新開発のデバイスは、細胞のハイスループットと高解像度イメージングの両方を統合しているため、各細胞の画像を直接流して提供し、統計的に関連性のある画像分析を提供します。各細胞画像は、明視野(BF)、暗視野(DF)、および蛍光チャンネルで取得され、各細胞の光吸収、散乱光、蛍光のレベルと分布にそれぞれアクセスできます。次に、分析は、実験の各条件で取得された7,000〜10,000個の細胞の各画像のピクセルごとの比較で構成されます。CNTの局在化と定量化は、CNTのいくつかの固有の特性のおかげで可能になります。実際、CNTは、BF上に強く吸収されたダークスポットとして、DF上には明るいスポットとして、正確な共局在で現れます。
この方法論は、ナノマテリアルと細胞との間の相互作用に関する研究にかなりの影響を与える可能性があります。このプロトコルは、光を十分に強く吸収(および/または散乱)できるナノマテリアルの広範囲に適用できます。
概要
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過去数十年の間に、ナノ粒子の位置付けは幅広い用途で重要性を増してきました。特に、カーボンナノチューブ(CNT)は、さまざまな診断および治療用途のナノツールとしてますます探求されています。CNTは、その特定の電気的、熱的、および分光学的特性により、さまざまな薬物や造影剤の送達媒体として作用したり、組織工学1に関与したりすることができます。
しかし、そのようなナノマテリアルの潜在的な毒性についての懸念は、主に生物内のCNTの運命が非常に物議を醸しているため、まだ議論の余地があります。確かに、生細胞や組織でそれらを検出および定量するための適切な方法が不足しています:例えば、ラマン分光法、光音響法、近赤外フォトルミネッセンスイメージングなどの技術が提案されていますが、いずれの方法もナノチューブの種類やその環境によって制限があります2-8。
ここで、提案された方法は、細胞内のナノ粒子の検出と定量に適用できる可能性があります。これを可能にしたのが、フローサイトメトリーと高解像度イメージングの両方を組み合わせたデバイスであるImageStreamです。これは、多数の細胞(最大5000イベント/秒)を取得する利点と、統計データと各細胞の高解像度画像(0.5μmの空間分解能)を同時に取得する利点を兼ね備えています。一般に、画像はCCDカメラを使用して収集され、セルの2次元グレースケール表現です。光は、画像内の各ピクセルについて定量化され、蛍光または細胞内サイズ(例えばBFなど)を持つ成分のいずれかの強度と位置の両方を識別し、したがって、細胞の外観9,10に基づいて細胞を識別する強力な能力を可能にする。
ここでの目標は、細胞内のCNTの分布と挙動を定量的に評価できるナノ計測法を設計することでした。特に、この方法は、細胞によるCNTの細胞への取り込み、処理、およびエキソサイトーシスを研究するために開発されました。我々は、まずCNTの複雑な細胞内輸送を証明し、次にこれらのナノマテリアルの細胞間での移動を証明した:細胞内在化されたCNTは、ストレスを受けると宿主細胞から逃れ、細胞外空間に広がり、ホモタイプであろうとヘテロタイプであろうと、ナイーブ細胞によって再内在化される11
で囲まれています。
以前の研究では、CNTの機能化と凝集状態12によって、能動的または受動的な細胞取り込みの異なるメカニズムが発生する可能性があることが示されました。ここでは、多層CNTを1,3-双極子環化付加およびアミド化によって官能基化し、次に蛍光プローブであるイソチオシアネート中で蛍光(FITC)で誘導体化しました。透過型電子顕微鏡では、それらは細胞質に個別に局在するか、または主にエンドソームおよびリソソームコンパートメントに見られる束として細胞によって内在化されているように見えます11。ImageStreamでは、クラスター化されたCNTは、BF上のダークスポットとDF上の明るいスポットとして高い相関性で現れるため、CNT標識細胞と制御細胞を明確に区別できます。一方、CNTで官能化された蛍光マーカーが発する蛍光シグナルの分布は、共局在化が進んでいませんでした:実際、消光現象のためと思われるのですが、緑色蛍光スポットはBFやDFのスポットと必ずしも一致しません。これは、第一に、ImageStreamによるCNTの検出には蛍光プローブが必須ではない、第二に、CNTの定量と局在 の両方を完全に代表するものではないことを示しています。
この方法は、ナノ粒子の統計的相対定量を提供するだけでなく、細胞内のCNTの局在に関する情報も提供します。つまり、例えば、細胞内部のCNTと原形質膜に結合したCNTを区別することを意味します。細胞画像上にCNTを局在させる能力は、従来のフローサイトメトリー解析の限界を明確に克服しています13。この手順は、細胞の特定の領域に適合するマスクを作成し、ロードされたCNTに対応するダークスポットを選択することによってここで開発されました。
一般的に言えば、この方法は、使用されるナノ粒子が光を強く吸収(および/または散乱)できるという条件で、細胞内の視覚化または定量化を必要とする広範な実験に適用できます。
プロトコル
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1. 水分散性カーボンナノチューブ(CNT)の作製
- 最初のCNTを細胞培養水に分散させてから、20°Cの浴水超音波装置で20分間超音波処理します。CNTが蛍光プローブで官能基化されている場合は、実験全体を通してCNTをできるだけ光から保護します。
2. CNTによるセルのラベリング
- 10%のウシ胎児血清と1%のペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地の25cm²プレート上で、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(HUVEC)(例えば)を増殖させます。
- 0、10、20、50 μg/mLの濃度のCNT溶液を完全培地で調製し、細胞を37°Cで20時間、または4°Cで20時間(25 cm²のプレートに2 mLのCNT懸濁液)でインキュベー トします。
3. 細胞の固定
- その後、インキュベーション培地を取り出し、細胞をPBSで洗い流し、トリプシン処理し、完全なDMEM培地で細胞を再懸濁します。1,200rpmで5分間遠心分離します。
- まず培地をパラホルムアルデヒド4%で4°Cで1時間交換し、次にPBSで保存します。必要に応じて、プロセスのこの段階で細胞を4°Cで数日間、サイトメトリー分析まで保存できます。
- 各サンプルには、50 μlのPBSに濃縮された約106個の細胞が含まれている必要があります。分析中に凝集体が発生しないように正しく懸濁し、50 μmメッシュの染色剤でろ過します><。 注:細胞を保存するためには、各ステップを非常に穏やかに実行する必要があります。
4. ImageStream の取得
マルチスペクトルイメージングフローサイトメーターImageStreamを使用して細胞の画像を取得します.
いくつかの点を尊重する必要があります。
- 適合した倍率を選択します(ここでは40倍の対物レンズが使用されます)。
- 蛍光色素を使用する場合:
- 蛍光色素を含まない対照サンプルを調製します.
-
で使用される各蛍光色素について、単色ポジティブコントロールで細胞を調製します。 あなたのサンプルに加えます。 - レーザー488nmを使用してFITCを励起し、チャネル02を使用して蛍光発光を収集します(バンドパス480-560nm)。さらに、明視野(BF)と暗視野(DF)にそれぞれチャネル01と06も使用します。
5. ポストプロセッシング - IDEAS 解析ソフト (Version 4.0)
- 取得したすべてのイベントの中で、分析は最初に単一セルの母集団に限定する必要があります:「アスペクト比」(つまり、幅/高さ)と「セル領域」(BF上のセルに適用されるパラメータ)を表すバイパラメトリックドットプロットを使用します(図1)。次に、標準領域でアスペクト比が1に近い関心領域に含まれる単一細胞を、多細胞イベント(大面積でアスペクト比が小さい)およびデブリ(非常に小さな領域)から識別します。
- 焦点が合った平面内の細胞を選択するには、コントラストの高いCNT標識細胞に適したバイパラメトリックドットプロットを使用します:BF画像に「コントラスト」と「RMS勾配」(画像の鮮明度品質を測定する)をプロットします - これにより、BF画像で低rms勾配と低コントラストの両方を示す焦点のない細胞を除外できます(図1)。
-
- 「find the best feature」を使用して、ラベル付きセルとラベルなしセルの間の最適な統計的分離を提供するパラメーターを決定します。私たちの研究では、平均ピクセルオブジェクトの特徴が最適なパラメータです(図2)。
- このパラメータと正規化された周波数を使用してヒストグラムをトレースし、試験した濃度の取り込みCNTの量を比較します(図3)。
- バイパラメトリックグラフ「BF上の平均ピクセルオブジェクト」(表記:平均Pixel_Object(M01,Ch01,Tight)_Ch01)と「DF上の強度」(Intensity_MC_Ch06)をトレースして、これら2つのパラメータ間の相関関係を調べます(図4)。
- 定量化は、マスクによっても評価されます。
- CNTはBF上では強く吸着するダークスポットとして現れるため、まず、本研究では0-533の低強度の画素を限定して選択し、CNTに正確に収まる閾値マスクを作成します(マスク1、表記:Intensity(M01, BF, 0-533))(図5)。閾値強度の選択は、標識された細胞と対照細胞を比較して行われます。
- 逆に、DF(マスク2、表記:強度(M06、DF、150-4095))の高輝度(この場合は150-4095)の画素でもマスクフィッティングを作成します(図6)。
- マスクの面積 (1 または 2;(表記:Area_Intensity(M01, BF, 0-533)マスク1用):異なる濃度でのCNTの内部化を相対的に定量化します(図7)。
- これら 2 つのマスク間の相関の程度を確認します (「マスク 1 の面積」と「マスク 2 の面積」のバイパラメトリック プロットのおかげです) (図 7)。
- セル内のCNTをローカライズするための他のマスクを作成します。
- セルの内部にフィットするマスク:Erode(M01、7) - セル全体(M01)(図8)のマスクに対応し、さらに7ピクセル(図9)の侵食。
- ブール方程式のみを使用してメンブレンに適合するマスク:M01で、Erode(M01,7)ではない - 内部(Erode(M01,7))からセル全体(M01)を減算したマスク(図10)。
- 膜上の暗いピクセル(CNTに対応)を考慮するには、マスクを作成します:Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)(図11)。
- セルのコレクションに適用されたさまざまなマスクを視覚化して、ラベル付きセルとラベルなしセルの関連性を確認します(図12)。
- 膜上の黒いピクセルを選択してマスクに特徴領域を適用します 'Area_Intensity(M01, 7), BF, 0-533)'いわゆる黒い領域。 これにより、メンブレン上のCNTの定量が可能になります.
最終的に、膜にのみ吸着されたCNTと内在化されたCNTを区別するには、膜上の黒い領域と細胞全体の黒い領域をプロットします(つまり、「Area_強度(M01、7)、BF、0-533」と「Area_強度(M01、BF、0-533)」)。
手記：FITC蛍光シグナルについても同じタイプの手順が適用されます:FITC蛍光強度の増加とBF上の平均ピクセルシグナルの減少、またはBF上のダークスポットとFITC蛍光強度の共局在を比較します。私たちの場合、蛍光シグナルは一方ではBFのダークスポットと、他方ではDFの明視野と正しく一致しないため、このタイプの分析は適切ではなく、CNTの固有の特性(光吸光度と散乱)が蛍光プローブに関連するシグナルよりも適切であることを示しています。
- 1つの実験条件ですべてのプロットが作成されたら、「統計レポートテンプレート」を作成し、テンプレートを.astファイルとして保存し、すべてのデータファイルをバッチ処理します。
結果
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ImageStream デバイスの原理の概要を図 1 に示します。図2に示すように、明視野(BF)、暗視野(DFまたは側方散乱光)、蛍光チャネルなど、流れている各細胞の複数の高解像度画像を生成し、CNTで標識された3つの異なる細胞を使用します。これらのチャネルのオーバーレイも示されており、一目で相関関係を示しています。
すべての後処理分析が細胞イメージングに基づいていることを考えると、焦点を絞った細胞の選択は研究にとって非常に重要です(図3)。実際、CNTの存在は、非標識細胞と比較してコントラストと勾配の両方に変化を誘発します:重要な量のCNTを内在化した焦点細胞は、rms勾配が低い傾向があり(これは通常、焦点細胞と非焦点細胞の識別に使用される独自のパラメータです)、重要なコントラストもあり、バイパラメトリックプロットが不可欠である理由を説明しています。図3は、非焦点細胞(黄色の領域)と焦点が集まっていない細胞(青色の領域)の区別を示しています。
細胞内在化CNTは、特にBFが強く吸収するダークスポットとして現れる場合に、明確に区別できます(図4の多様な標識濃度の影響を参照)。さらに、BF上の平均ピクセルシグナルを解析し、取り込みの相対的な定量化を行いました:図5のグラフは、CNT標識濃度による有意な増加を示しています(実験条件あたり約7,000細胞の結果)。
次に、CNTの定量化は、BFの制限された範囲の暗いピクセルまたはDFの高強度のピクセル(図6の例を参照)に適用され、CNTの存在から生じるスポットに対応するマスクの使用によっても可能です。したがって、これらのマスクの面積をプロットすると、取り込みの増加だけでなく、強調表示が可能になります(図7では、0〜533の範囲のピクセルを選択してBF上のマスクの面積で例示されています)。
さらに、BFとDFのスポット間の相関は、DF強度とBF平均ピクセル信号(図8)をプロット(マスクに依存しない解析)、またはBFのマスクの面積(マスク1)とDFの面積(マスク2)をプロットすることで評価できます。
細胞内のCNTの局在化のために作成された手順に関して、図9Aは作成されたさまざまなマスクを示しています。ローカリゼーションマスクの堅牢性(デフォルトのセルマスクの侵食に基づく)は、ラベル付きセルとラベルなしセルのコレクションで視覚的に確認する必要があることに注意してください。すべてのサンプルに同じマスクが使用されます。
細胞膜上の黒点の総面積と細胞全体の黒点の総面積をプロットすると、37°Cで20時間インキュベートした細胞の内在化のスコアが得られます。4°Cで2時間のインキュベーションを行った場合と比較して(図9Bを参照)、CNTは主に4°Cの膜上に位置していることを示しています。 一方、37°Cでは、CNTは細胞の90%以上に取り込まれます。
最後に、蛍光に関して、蛍光スポットとBF(およびDF)上のスポットとの間の相関が低すぎるため、このパラメータはCNTの定量化の指標として使用されませんでした。実際、FITC強度と明視野平均ピクセルの相関は、ピアソン相関係数が-0.2であることを示しています。図10には、蛍光シグナルが明視野の黒点と適切に一致する場合と一致しない場合の2つのケースが示されています。
図 1.ImageStreamの一般的な操作性の概要 マルチスペクトルイメージングシステムは、明視野、暗視野、蛍光の3つの異なるモードで最大12枚の画像/細胞を取得します。セットアップは、405、488、560、658nmの5つの励起レーザーで構成されています。光は、異なる対物レンズ(この研究では40倍対物レンズを使用)でキュベット内を流れる細胞から収集され、角度配列のロングパスフィルターのセットで構成されるスペクトル分解要素に中継されます。細胞画像を収集するCCDカメラは、画像のストリーキングを避けるために、Time-Delay-Integrationと呼ばれる技術を使用して操作されます。拡張被写界深度(EDF)はオプションです。
図 2.ImageStreamが多様なチャネル(明視野(BF)、暗視野(DF)、蛍光(FITC)、およびそれらのオーバーレイ)を通じて捕捉したカーボンナノチューブ(50 μg/mL)で標識した細胞の画像ギャラリー。細胞内リソソーム内に閉じ込められたCNTは、明視野画像上に大きな黒い斑点として現れます。逆に、暗視野と蛍光画像に明るいスポットを作成します。
図 3.焦点が合っている細胞の選択。BF画像上の二変量平均平方根(rms)勾配対コントラストを表す二変量ドットプロットにより、焦点が合っていない細胞を除外できます。ここでは、黄色の領域は焦点が合っていないセルを表し、焦点が合ったセルは青で表されます。焦点が合っていない細胞は、明視野画像上での低コントラストと低勾配rmsの両方を特徴としています。rmsグラディエントに加えて、コントラスト機能は、CNTで標識した後に焦点を絞った細胞を識別する必要があります。
図4.ImageStreamによって視覚化されたCNTの用量依存的な取り込み。 明視野画像上の黒点の数と面積は、細胞とのインキュベーション中のCNTの投与量とともに増加しています(0〜50μg/mlの範囲)。制御セルには黒い斑点がないことに注意してください。
図5. 明視野画像に基づくCNT取り込みの相対定量化。 全細胞を特徴とするマスク「オブジェクト」に適用された平均ピクセル特徴のヒストグラムは、用量依存的な振る舞いを明確に示しており、これを定量化に使用できます。R9シリーズはCNT陽性細胞を囲んでいます。
図6.BF上の黒いスポットとDF画像の明るいスポットを選択するマスクの作成。 BF画像ではCNTが強く吸着するダークスポットとして現れるため、本研究では0-533の低強度の画素を選択するための閾値マスクを作成しています(マスク1、表記:Intensity(M01, BF, 0-533))。逆に、DF画像(マスク2、表記:強度(M06, DF, 150-4095))に高輝度(この場合は150-4095)の画素をあてはめたマスクフィッティングを用いて、高散乱領域に対応するDF上の輝点を選定します。
図7.CNTの用量依存的な取り込みは、BF画像上の黒点領域の定量化によって実証されています。 BFに適用した閾値マスク(マスク1)を用いると、細胞ごとに黒点の面積を定量化することができ、用量依存的な分布を示すことができます。
図8. BF(吸収)画像とDF(散乱)画像に基づくCNT定量法は相関しています。 左図は、BF画像の平均ピクセルとDF画像の平均ピクセルで、CNT(50 μg/ml)で標識された細胞に対して良好な相関を示しています(ピアソン相関係数r = -0.68)。右は、CNT(50 μg/ml)で標識された細胞のBF上のダークスポットをフィッティングするマスクの領域とDFの明るいスポットをフィッティングするマスクの領域を示しています。ピアソン相関係数はr = -0.83で、7,000個のセルの値がプロットされています。
図9.特異的マスクを使用した細胞内のCNT局在。 (A)マスクは、細胞の特定の位置、つまり左から右へ、細胞全体、膜のみ、および細胞の内側に適合するように作成されます。別のマスクは、しきい値強度(マスク1、表記:強度(M01、BF、0-533))のおかげで黒いスポットに適合します。(B)CNTの局在の評価は、A.で説明したローカリゼーションマスクを使用して、細胞のさまざまな局在化上の黒点の面積を測定することによって得ることができます。CNTs(50μg/ml)とのインキュベーションを37°Cと4°Cの両方で行い、インターナリゼーション経路を阻害しました。膜上の黒い領域と細胞全体の黒い領域を表すグラフは、4°Cで膜上のCNTが用量依存的に吸収されるのに対し、CNTの完全な内在化は37°Cで有効であることを示しています。
図10. FITC画像上の蛍光輝点とBF上のCNT誘起黒点の共局在。 蛍光の明るいスポットは、BFの黒いスポットと常に共局在しているわけではありません。表示された最初の 2 つのセルには正しく一致しますが、最後の 2 つのセルには一致しません。
ディスカッション
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1. 変更とトラブルシューティング
この研究では、最初の目的は、細胞内のCNTの量と局在を評価することでした。共焦点顕微鏡は、蛍光マーカーFITCで官能化したCNTの細胞内分布を評価するためのアプリ オリ な金法であった可能性があります8,14。ただし、主な欠点は、単一細胞イメージングに制限があるため、統計的に関連するデータが不足していることです。実際、短時間(<分)で多数の細胞(5,000〜10,000)をスクリーニングすることにより、統計的に堅牢な結果が得られ、細胞内分解能(0.5μm)で各細胞の画像を提供する高解像度イメージングによっても強化されます。これにより、1枚の画像解析に基づいて大量のデータを分析することができます。
従来のフローサイトメトリーと比較して、ImageStreamのユニークな利点は、各細胞のマルチスペクトル 画像 と信号強度のピクセルごとの比較を提供することです。したがって、ImageStreamは、ハイスループットフローサイトメトリーの統計的検出力と、分析された各細胞の共焦点イメージングの分析上の利点を組み合わせています。これは、細胞内のCNTのラベルフリーの相対定量と局在化に不可欠です。
2. プロトコル内の重要なステップ
重要なステップは、各研究に最も適したパラメータの選択で構成されます。私たちの場合、最良の方法は、ナノチューブの吸収特性と散乱特性に基づいて分析することでした:BFの暗いスポットの局在とDFの明るいスポットとの良好な相関関係は、開発された方法が適切で信頼できることを裏付けています-そして、細胞イメージングなしでは不可能だったかもしれません。
3. 技術の限界
細胞内のCNTの可視化が可能だったのは、CNTがエンドソームの細胞内小胞に蓄積する傾向があり、その後、強い吸収および散乱スポットとして現れる傾向があるからにすぎないことを強調しなければなりません。個々のナノチューブは、この方法に基づいて検出すべきではありませんが、最終的には蛍光で検出される可能性があり、これは明確な制限を構成します。第二に、定量は「絶対的」ではなく、異なる標識濃度に対して、および対照の非標識細胞と比較して相対的です。一部の定量的特徴(平均ピクセル、強度 など)は絶対パラメータですが、他の量的特徴はマスクの選択(しきい値マスク、ローカリゼーションマスク)に依存します。
4. 既存手法との意義
蛍光に関しては、ImageStream分析により、FITCの明るい信号と他のチャネル上のスポットとの間のCNTクラスターの共局在が不十分であることが浮き彫りになりました。したがって、蛍光はCNTの定量化と局在化の信頼できる指標ではなかったようです。それにもかかわらず、主に蛍光定量に基づく従来のフローサイトメトリーの限界を克服し、マルチスペクトルハイスループットImageStreamは、細胞内のカーボンナノチューブの局在化を提供しながら、統計的な ラベルフリー 定量への道を開きます。
5. 今後の応用
このハイスループットの統計的ナノ計測法は、細胞と相互作用するときに光の高い吸収と散乱を示すあらゆるナノ材料に一般化できます。したがって、ナノバイオインターフェース、ナノ毒物学、およびナノ医療の研究に重要な用途がある可能性があります。
開示事項
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
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この作業は、ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04)、Region Ile de France (契約番号 E539)、および CNRS の支援を受けました。オープンアクセスはEMD Milliporeによって支払われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ImageStream |  アムニス |
参考文献
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