この研究では、主な目的はカーボンナノチューブ(CNT)の細胞への取り込みと最終的なエキソサイトーシスを監視することでした。この観点から、ここでは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを使用して、統計的に関連性のある数の細胞におけるCNTの定量と局在を可能にする独自の方法を提案しました。
方法論記事
マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる細胞内カーボンナノチューブの局在と相対定量(英語)
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
カーボンナノチューブ(CNT)のような炭素ベースのナノ材料は、このタイプのナノ粒子に属しており、炭素が豊富な細胞構造と区別することは非常に困難であり、事実上、細胞および組織レベルでの分布を評価する定量的方法はまだありません。ここで提案するのは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメーター(ImageStream、Amnis)を使用して細胞内のCNTを検出および定量できる革新的な方法です。この新開発のデバイスは、細胞のハイスループットと高解像度イメージングの両方を統合しているため、各細胞の画像を直接流して提供し、統計的に関連性のある画像分析を提供します。各細胞画像は、明視野(BF)、暗視野(DF)、および蛍光チャンネルで取得され、各細胞の光吸収、散乱光、蛍光のレベルと分布にそれぞれアクセスできます。次に、分析は、実験の各条件で取得された7,000〜10,000個の細胞の各画像のピクセルごとの比較で構成されます。CNTの局在化と定量化は、CNTのいくつかの固有の特性のおかげで可能になります。実際、CNTは、BF上に強く吸収されたダークスポットとして、DF上には明るいスポットとして、正確な共局在で現れます。
この方法論は、ナノマテリアルと細胞との間の相互作用に関する研究にかなりの影響を与える可能性があります。このプロトコルは、光を十分に強く吸収(および/または散乱)できるナノマテリアルの広範囲に適用できます。
概要
過去数十年の間に、ナノ粒子の位置付けは幅広い用途で重要性を増してきました。特に、カーボンナノチューブ(CNT)は、さまざまな診断および治療用途のナノツールとしてますます探求されています。CNTは、その特定の電気的、熱的、および分光学的特性により、さまざまな薬物や造影剤の送達媒体として作用したり、組織工学1に関与したりすることができます。
しかし、そのようなナノマテリアルの潜在的な毒性についての懸念は、主に生物内のCNTの運命が非常に物議を醸しているため、まだ議論の余地があります。確かに、生細胞や組織でそれらを検出および定量するための適切な方法が不足しています:例えば、ラマン分光法、光音響法、近赤外フォトルミネッセンスイメージングなどの技術が提案されていますが、いずれの方法もナノチューブの種類やその環境によって制限があります2-8。
ここで、提案された方法は、細胞内のナノ粒子の検出と定量に適用できる可能性があります。これを可能にしたのが、フローサイトメトリーと高解像度イメージングの両方を組み合わせたデバイスであるImageStreamです。これは、多数の細胞(最大5000イベント/秒)を取得する利点と、統計データと各細胞の高解像度画像(0.5μmの空間分解能)を同時に取得する利点を兼ね備えています。一般に、画像はCCDカメラを使用して収集され、セルの2次元グレースケール表現です。光は、画像内の各ピクセルについて定量化され、蛍光または細胞内サイズ(例えばBFなど)を持つ成分のいずれかの強度と位置の両方を識別し、したがって、細胞の外観9,10に基づいて細胞を識別する強力な能力を可能にする。
ここでの目標は、細胞内のCNTの分布と挙動を定量的に評価できるナノ計測法を設計することでした。特に、この方法は、細胞によるCNTの細胞への取り込み、処理、およびエキソサイトーシスを研究するために開発されました。我々は、まずCNTの複雑な細胞内輸送を証明し、次にこれらのナノマテリアルの細胞間での移動を証明した:細胞内在化されたCNTは、ストレスを受けると宿主細胞から逃れ、細胞外空間に広がり、ホモタイプであろうとヘテロタイプであろうと、ナイーブ細胞によって再内在化される11
で囲まれています。
以前の研究では、CNTの機能化と凝集状態12によって、能動的または受動的な細胞取り込みの異なるメカニズムが発生する可能性があることが示されました。ここでは、多層CNTを1,3-双極子環化付加およびアミド化によって官能基化し、次に蛍光プローブであるイソチオシアネート中で蛍光(FITC)で誘導体化しました。透過型電子顕微鏡では、それらは細胞質に個別に局在するか、または主にエンドソームおよびリソソームコンパートメントに見られる束として細胞によって内在化されているように見えます11。ImageStreamでは、クラスター化されたCNTは、BF上のダークスポットとDF上の明るいスポットとして高い相関性で現れるため、CNT標識細胞と制御細胞を明確に区別できます。一方、CNTで官能化された蛍光マーカーが発する蛍光シグナルの分布は、共局在化が進んでいませんでした:実際、消光現象のためと思われるのですが、緑色蛍光スポットはBFやDFのスポットと必ずしも一致しません。これは、第一に、ImageStreamによるCNTの検出には蛍光プローブが必須ではない、第二に、CNTの定量と局在 の両方を完全に代表するものではないことを示しています。
この方法は、ナノ粒子の統計的相対定量を提供するだけでなく、細胞内のCNTの局在に関する情報も提供します。つまり、例えば、細胞内部のCNTと原形質膜に結合したCNTを区別することを意味します。細胞画像上にCNTを局在させる能力は、従来のフローサイトメトリー解析の限界を明確に克服しています13。この手順は、細胞の特定の領域に適合するマスクを作成し、ロードされたCNTに対応するダークスポットを選択することによってここで開発されました。
一般的に言えば、この方法は、使用されるナノ粒子が光を強く吸収(および/または散乱)できるという条件で、細胞内の視覚化または定量化を必要とする広範な実験に適用できます。
プロトコル
1. 水分散性カーボンナノチューブ(CNT)の作製
- 最初のCNTを細胞培養水に分散させてから、20°Cの浴水超音波装置で20分間超音波処理します。CNTが蛍光プローブで官能基化されている場合は、実験全体を通してCNTをできるだけ光から保護します。
2. CNTによるセルのラベリング
- 10%のウシ胎児血清と1%のペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地の25cm²プレート上で、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(HUVEC)(例えば)を増殖させます。
- 0、10、20、50 μg/mLの濃度のCNT溶液を完全培地で調製し、細胞を37°Cで20時間、または4°Cで20時間(25 cm²のプレートに2 mLのCNT懸濁液)でインキュベー トします。
3. 細胞の固定
- その後、インキュベーション培地を取り出し、細胞をPBSで洗い流し、トリプシン処理し、完全なDMEM培地で細胞を再懸濁します。1,200rpmで5分間遠心分離します。
- まず培地をパラホルムアルデヒド4%で4°Cで1時間交換し、次にPBSで保存します。必要に応じて、プロセスのこの段階で細胞を4°Cで数日間、サイトメトリー分析まで保存できます。
- 各サンプルには、50 μlのPBSに濃縮された約106個の細胞が含まれている必要があります。分析中に凝集体が発生しないように正しく懸濁し、50 μmメッシュの染色剤でろ過します><。 注:細胞を保存するためには、各ステップを非常に穏やかに実行する必要があります。
4. ImageStream の取得
マルチスペクトルイメージングフローサイトメーターImageStreamを使用して細胞の画像を取得します.
いくつかの点を尊重する必要があります。
- 適合した倍率を選択します(ここでは40倍の対物レンズが使用されます)。
- 蛍光色素を使用する場合:
- 蛍光色素を含まない対照サンプルを調製します.
-
で使用される各蛍光色素について、単色ポジティブコントロールで細胞を調製します。 あなたのサンプルに加えます。 - レーザー488nmを使用してFITCを励起し、チャネル02を使用して蛍光発光を収集します(バンドパス480-560nm)。さらに、明視野(BF)と暗視野(DF)にそれぞれチャネル01と06も使用します。
5. ポストプロセッシング - IDEAS 解析ソフト (Version 4.0)
- 取得したすべてのイベントの中で、分析は最初に単一セルの母集団に限定する必要があります:「アスペクト比」(つまり、幅/高さ)と「セル領域」(BF上のセルに適用されるパラメータ)を表すバイパラメトリックドットプロットを使用します(図1)。次に、標準領域でアスペクト比が1に近い関心領域に含まれる単一細胞を、多細胞イベント(大面積でアスペクト比が小さい)およびデブリ(非常に小さな領域)から識別します。
- 焦点が合った平面内の細胞を選択するには、コントラストの高いCNT標識細胞に適したバイパラメトリックドットプロットを使用します:BF画像に「コントラスト」と「RMS勾配」(画像の鮮明度品質を測定する)をプロットします - これにより、BF画像で低rms勾配と低コントラストの両方を示す焦点のない細胞を除外できます(図1)。
-
- 「find the best feature」を使用して、ラベル付きセルとラベルなしセルの間の最適な統計的分離を提供するパラメーターを決定します。私たちの研究では、平均ピクセルオブジェクトの特徴が最適なパラメータです(図2)。
- このパラメータと正規化された周波数を使用してヒストグラムをトレースし、試験した濃度の取り込みCNTの量を比較します(図3)。
- バイパラメトリックグラフ「BF上の平均ピクセルオブジェクト」(表記:平均Pixel_Object(M01,Ch01,Tight)_Ch01)と「DF上の強度」(Intensity_MC_Ch06)をトレースして、これら2つのパラメータ間の相関関係を調べます(図4)。
- 定量化は、マスクによっても評価されます。
- CNTはBF上では強く吸着するダークスポットとして現れるため、まず、本研究では0-533の低強度の画素を限定して選択し、CNTに正確に収まる閾値マスクを作成します(マスク1、表記:Intensity(M01, BF, 0-533))(図5)。閾値強度の選択は、標識された細胞と対照細胞を比較して行われます。
- 逆に、DF(マスク2、表記:強度(M06、DF、150-4095))の高輝度(この場合は150-4095)の画素でもマスクフィッティングを作成します(図6)。
- マスクの面積 (1 または 2;(表記:Area_Intensity(M01, BF, 0-533)マスク1用):異なる濃度でのCNTの内部化を相対的に定量化します(図7)。
- これら 2 つのマスク間の相関の程度を確認します (「マスク 1 の面積」と「マスク 2 の面積」のバイパラメトリック プロットのおかげです) (図 7)。
- セル内のCNTをローカライズするための他のマスクを作成します。
- セルの内部にフィットするマスク:Erode(M01、7) - セル全体(M01)(図8)のマスクに対応し、さらに7ピクセル(図9)の侵食。
- ブール方程式のみを使用してメンブレンに適合するマスク:M01で、Erode(M01,7)ではない - 内部(Erode(M01,7))からセル全体(M01)を減算したマスク(図10)。
- 膜上の暗いピクセル(CNTに対応)を考慮するには、マスクを作成します:Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)(図11)。
- セルのコレクションに適用されたさまざまなマスクを視覚化して、ラベル付きセルとラベルなしセルの関連性を確認します(図12)。
- 膜上の黒いピクセルを選択してマスクに特徴領域を適用します 'Area_Intensity(M01, 7), BF, 0-533)'いわゆる黒い領域。 これにより、メンブレン上のCNTの定量が可能になります.
最終的に、膜にのみ吸着されたCNTと内在化されたCNTを区別するには、膜上の黒い領域と細胞全体の黒い領域をプロットします(つまり、「Area_強度(M01、7)、BF、0-533」と「Area_強度(M01、BF、0-533)」)。
手記：FITC蛍光シグナルについても同じタイプの手順が適用されます:FITC蛍光強度の増加とBF上の平均ピクセルシグナルの減少、またはBF上のダークスポットとFITC蛍光強度の共局在を比較します。私たちの場合、蛍光シグナルは一方ではBFのダークスポットと、他方ではDFの明視野と正しく一致しないため、このタイプの分析は適切ではなく、CNTの固有の特性(光吸光度と散乱)が蛍光プローブに関連するシグナルよりも適切であることを示しています。
- 1つの実験条件ですべてのプロットが作成されたら、「統計レポートテンプレート」を作成し、テンプレートを.astファイルとして保存し、すべてのデータファイルをバッチ処理します。
結果
ImageStream装置の原理の概要を図1に示す。本装置は、フロー状態にある各細胞の明視野（BF）、暗視野（DFまたは側方散乱光）、および蛍光チャンネルを含む複数の高解像度画像を生成する。その例を、CNTでラベル付けされた3種類の異なる細胞を用いて図2に示す。また、これらのチャンネルを重ね合わせた画像も示されており、一見して相関関係が確認できる。
すべての後処理解析が細胞イメージングに基づいているため、フォーカスが合った細胞の選択が研究において極めて重要となります（図3）。実際、非標識細胞と比較して、CNTの存在はコントラストと勾配の両方に変化をもたらします。大量のCNTを取り込んだフォーカス済みの細胞は、rms勾配が低くなる傾向があります（通常、フォーカス済み細胞の識別に用いられる唯一のパラメータはこれです）。 対比 （フォーカス外の細胞）だけでなく、重要なコントラストも提供し、なぜ2パラメータープロットが不可欠であるかを説明します。 図3 フォーカスが合っていない領域（黄色い領域）との識別が示されています。 対 焦点が合った細胞（青色領域）。
細胞内に取り込まれたCNTは明確に判別でき、特にBFでは強く光を吸収する暗いスポットとして現れます（さまざまなラベル化濃度の影響については、図4を参照してください）。さらに、BF上の平均ピクセル信号を解析して取り込み量を相対的に定量化したところ、図5のグラフに示されるように、CNTのラベル化濃度に伴って有意に増加することが分かりました（1つの実験条件あたり約7,000個の細胞における結果）。
次に、マスクを使用することでもCNTの定量が可能です。このマスクは、BF（明視野）の暗いピクセルの限定的な範囲、またはDF（暗視野）の高強度ピクセル（Figure 6の例を参照）に適用され、これらはCNTの存在に起因するスポットに対応します。したがって、これらのマスクの面積をプロットすることで、取り込みの増加を明確に示すことができます（Figure 7において、0-533の範囲のピクセルを選択したBF上のマスク面積で例示されています）。
さらに、BFとDFのスポット間の相関は、DF強度をBFの平均ピクセル信号に対してプロット（図8参照）（マスクに依存しない解析）、またはBF上のマスク面積（マスク1）をDF上の面積（マスク2）に対してプロットすることで評価できます。
細胞内におけるCNTの局在化のために作成された手順に関して、図9Aに作成されたさまざまなマスクを示します。局在化マスク（デフォルトの細胞マスクの浸食に基づく）の堅牢性は、標識された細胞および未標識の細胞のコレクションを用いて視覚的に確認する必要があることに注意してください。すべてのサンプルに同じマスクを使用します。
細胞膜上の黒いスポットの総面積のプロット 対 細胞全体に対して行うことで、20時間 incubation した細胞における内部移行のスコアを算出します。 37 °C 〜での2時間のインキュベーションと比較して 4 °C （参照 図9B）；これは、CNTの大部分が膜上の〜に位置していることを示しています。 4 °C一方、～では 37 °C CNTは90%以上の細胞に取り込まれている。
最後に蛍光についてですが、蛍光スポットとBF（およびDF）上のスポットとの相関が極めて低いため、このパラメータはCNTの定量指標としては使用しませんでした。実際に、FITC強度と明視野の平均ピクセル値の相関におけるピアソン相関係数は-0.2でした。図10では、蛍光信号が明視野の黒いスポットと適切に一致している例と、そうでない例の2つのケースが示されています。
図1. ImageStreamの概要と一般的な動作原理マルチスペクトルイメージングシステムにより、明視野、暗視野、蛍光の3つの異なるモードで、1細胞あたり最大12枚の画像を取得します。装置構成は、405、488、560、658 nmを含む5つの励起レーザーで構成されています。キュベット内を流れる細胞からの光は、さまざまな対物レンズ（本研究では40X対物レンズを使用）で集光され、角度配列のロングパスフィルターセットで構成される分光分解素子に伝えられます。細胞画像を収集するCCDカメラは、画像のブレ（ストリーキング）を避けるためにタイムディレイインテグレーション（TDI）と呼ばれる手法を用いて動作します。拡張被写界深度（EDF）もオプションとして選択可能です。
図2. カーボンナノチューブ（50 μg/mL）で標識した細胞をImageStreamを用いて各種チャンネル（明視野（BF）、暗視野（DF）、蛍光（FITC）、およびそれらの重ね合わせ画像）で撮影したイメージギャラリー。 細胞内のリソソームに封じ込められたCNTsは、明視野画像では大きな黒い点として現れる。対照的に、暗視野および蛍光画像では明るい点として現れる。
図 3. フォーカスが合った細胞の選択。BF画像における二乗平均平方根（rms）勾配対コントラストを示す二変量ドットプロットにより、フォーカスが合っていない細胞を除外できる。ここで、黄色い領域はフォーカスが合っていない細胞を、青い領域はフォーカスが合った細胞を表している。フォーカスが合っていない細胞は、明視野画像において低コントラストかつ低勾配rmsという特徴を持つ。CNTによるラベル化後にフォーカスが合った細胞を識別するには、rms勾配に加えてコントラスト特性が必要となる。
図4. ImageStreamにより可視化したCNTsの用量依存的な取り込み。細胞とのインキュベーション中、CNTsの用量（0-50 µg/mlの範囲）が増えるにつれて、明視野画像上の黒い点の数と面積が増加している。コントロール細胞には黒い点が見られないことに留意すること。
図 5. 明視野像に基づくCNT取り込みの相対定量。細胞全体を示すマスク「object」に適用した平均ピクセル値のヒストグラムは、定量に使用可能な用量依存的な挙動を明確に示している。R9の範囲はCNT陽性細胞を囲んでいる。
図 6. BF像上の黒色スポットおよびDF像上の明色スポットを選択するマスクの作成。CNTはBF像において強吸収の黒色スポットとして現れるため、本研究では0-533の間の低強度を持つ限定的な範囲のピクセルを選択する閾値マスクを作成した(Mask 1, 表記: Intensity(M01, BF, 0-533))。対照的に、DF像において高強度（本例では150-4095）のピクセルに適合するマスク(Mask 2, 表記: Intensity (M06, DF, 150-4095))を用いて、高散乱領域に対応するDF上の明色スポットを選択した。
図 7. BF画像上の黒色スポット領域の定量化により、CNTsの用量依存的な取り込みが示されている。BFに適用したしきい値マスク（mask 1）を用いて、個々の細胞の黒色スポット領域を定量化したところ、用量依存的な分布が認められた。
図8. BF（吸収）画像およびDF（散乱）画像に基づくCNT定量法には相関がある。 左側は、BF（明視野）像の平均ピクセル値を示す。 対比 DF画像上の強度は、CNTでラベル化された細胞において良好な相関を示し（50 µg/ml（ピアソンの相関係数 r = -0.68）。右側は、BF上のダークスポットに適合させたマスクの領域。 対比 CNTでラベル化した細胞のDF（暗視野）像におけるマスク適合輝点の領域（50 µg/ml）。ピアソン相関係数はr = -0.83である。7,000個の細胞からの値をプロットしている。
図 9. 特定のマスクを用いた細胞内におけるCNTの局在化。(A) 細胞の特定の部位に適合するようにマスクを作成した。左から順に、細胞全体、細胞膜のみ、および細胞内部である。また、閾値強度に基づき黒色スポットに適合する別のマスクを作成した (Mask 1, 表記: Intensity(M01, BF, 0-533))。(B) Aで述べた局在化マスクを用いて、細胞の異なる部位における黒色スポットの面積を測定することで、CNTの局在化を評価できる。内部移行経路を阻害するため、CNT (50 µg/ml) によるインキュベーションを 37 °C と 4 °C の両方で実施した。細胞膜上の黒色面積に対する細胞全体の黒色面積を示すグラフは、4 °C ではCNTが細胞膜に濃度依存的に吸着することを示し、37 °C ではCNTの完全な内部移行が効果的に行われることを示している。
図10. BF上のCNT誘発黒色スポットとFITC画像上の蛍光輝点の共局在。蛍光輝点は、BF上の黒色スポットと常に共局在しているわけではない。提示された最初の2つの細胞では適切に一致しているが、最後の2つの細胞では一致していない。
ディスカッション
1. 変更とトラブルシューティング
この研究では、最初の目的は、細胞内のCNTの量と局在を評価することでした。共焦点顕微鏡は、蛍光マーカーFITCで官能化したCNTの細胞内分布を評価するためのアプリ オリ な金法であった可能性があります8,14。ただし、主な欠点は、単一細胞イメージングに制限があるため、統計的に関連するデータが不足していることです。実際、短時間(<分)で多数の細胞(5,000〜10,000)をスクリーニングすることにより、統計的に堅牢な結果が得られ、細胞内分解能(0.5μm)で各細胞の画像を提供する高解像度イメージングによっても強化されます。これにより、1枚の画像解析に基づいて大量のデータを分析することができます。
従来のフローサイトメトリーと比較して、ImageStreamのユニークな利点は、各細胞のマルチスペクトル 画像 と信号強度のピクセルごとの比較を提供することです。したがって、ImageStreamは、ハイスループットフローサイトメトリーの統計的検出力と、分析された各細胞の共焦点イメージングの分析上の利点を組み合わせています。これは、細胞内のCNTのラベルフリーの相対定量と局在化に不可欠です。
2. プロトコル内の重要なステップ
重要なステップは、各研究に最も適したパラメータの選択で構成されます。私たちの場合、最良の方法は、ナノチューブの吸収特性と散乱特性に基づいて分析することでした:BFの暗いスポットの局在とDFの明るいスポットとの良好な相関関係は、開発された方法が適切で信頼できることを裏付けています-そして、細胞イメージングなしでは不可能だったかもしれません。
3. 技術の限界
細胞内のCNTの可視化が可能だったのは、CNTがエンドソームの細胞内小胞に蓄積する傾向があり、その後、強い吸収および散乱スポットとして現れる傾向があるからにすぎないことを強調しなければなりません。個々のナノチューブは、この方法に基づいて検出すべきではありませんが、最終的には蛍光で検出される可能性があり、これは明確な制限を構成します。第二に、定量は「絶対的」ではなく、異なる標識濃度に対して、および対照の非標識細胞と比較して相対的です。一部の定量的特徴(平均ピクセル、強度 など)は絶対パラメータですが、他の量的特徴はマスクの選択(しきい値マスク、ローカリゼーションマスク)に依存します。
4. 既存手法との意義
蛍光に関しては、ImageStream分析により、FITCの明るい信号と他のチャネル上のスポットとの間のCNTクラスターの共局在が不十分であることが浮き彫りになりました。したがって、蛍光はCNTの定量化と局在化の信頼できる指標ではなかったようです。それにもかかわらず、主に蛍光定量に基づく従来のフローサイトメトリーの限界を克服し、マルチスペクトルハイスループットImageStreamは、細胞内のカーボンナノチューブの局在化を提供しながら、統計的な ラベルフリー 定量への道を開きます。
5. 今後の応用
このハイスループットの統計的ナノ計測法は、細胞と相互作用するときに光の高い吸収と散乱を示すあらゆるナノ材料に一般化できます。したがって、ナノバイオインターフェース、ナノ毒物学、およびナノ医療の研究に重要な用途がある可能性があります。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作業は、ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04)、Region Ile de France (契約番号 E539)、および CNRS の支援を受けました。オープンアクセスはEMD Milliporeによって支払われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ImageStream |  Amnis |
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