我々は、密度勾配遠心分離によりCellTrackerと染料を用いて好中球標識のマウス骨髄からの好中球の単離および精製のためのプロトコールを述べる。これは、下流の機能研究または養子移入と追跡実験の好中球の多数を取得するための、簡易で、迅速かつ再現性のある経済的な方法を表しています。
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この記事について
サマリー
要約
好中球は、自然免疫系の重要なエフェクター細胞である。彼らは急速に急性炎症のサイトで募集し、炎症環境に応じて、保護や病原性の効果を発揮している。それにもかかわらず、免疫における好中球の不可欠な役割にもかかわらず、別の感染症や炎症性の条件で好中球 'エフェクターとimmunopathogenic効果を媒介分子の要因の詳細な理解は、まだ、一部ため、その短い半減期のために、これらの取り扱いとの難しさを欠いている細胞および下流機能的研究と養子移入実験のために好中球の十分な数を取得するための信頼性のある実験プロトコルの欠如。したがって、簡単、迅速、経済的かつ信頼性のある方法は、食作用、殺、サイトカイン産生、脱顆粒及び売買などの機能を評価するためにマウスの好中球の十分な数を収穫するために非常に望ましい。そのために、我々は、高純度と生存したマウスの骨髄からの好中球の多数を分離する任意の研究室で適応させることができる再現性の密度勾配遠心分離ベースのプロトコルを提示。さらに、我々は、養子レシピエントマウスに移し、フローサイトメトリーを使用して少なくとも4時間後に転写するためのいくつかの組織で追跡することができる単離された好中球を標識するためにCellTracker染料を使用する簡単なプロトコルを提示する。このアプローチを使用して、異なるCellTracker染料、野生型および遺伝子欠損マウスからの好中球の特異的標識が正常にin vivoで標的組織への血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割を評価するために競争力の再増殖試験を実行するために使用することができる。
概要
好中球は、ヒトにおける最も豊富な白血球です。彼らは、微生物の侵入に対する防御の最初の行としての自然免疫系との行為の主な細胞成分である。好中球の数値および/ または機能に影響を与える買収好中球減少症とプライマリ免疫不全患者では、宿主防御1でこれらの細胞の重要性を強調し、生命を脅かす侵略的な細菌や真菌感染症を開発。炎症組織2への血流から募集の好中球の走化が可能な勾配を発生させる化学誘引物質の分泌につながるオーケスト自然免疫応答の誘導においてそれらの同族パターン認識受容体の結果感染部位における侵入病原体の免疫認識。好中球は、感染部位を入力した後、彼らは、サイトカインやケモカイン産生につながる、病原体の取り込み活性化、及び酸化および非酸化を介して、私を殺してchanisms 3。先天性免疫におけるそれらのよく知られた役割に加えて、好中球はまた、最近効果的な適応免疫応答の開始剤4として重要な役割を果たすことが示されている。 5-7感染性および自己免疫疾患の様に示すように、一方、離間免疫において、保護の役割から、好中球はまた、過剰な蓄積および/ または炎症部位 において活性化に起因する組織損傷および免疫病理を媒介することができる。
いくつかの感染症や炎症状態に効果的な自然免疫応答とその多面的なエフェクター機能を搭載で好中球の不可欠な役割にもかかわ....
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プロトコル
1。マウス骨髄細胞の単離
- 機関の動物ケア委員会が承認したプロトコルを使用して、マウスを安楽死させると70％エタノールで動物の表面にスプレーします。
- 半ば腹部の皮膚の切開を行い、下肢をカバーする皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を除去。
- はさみを使って下肢から筋肉を切断して大腿骨頭を壊す避けながら慎重に、股関節から寛骨臼を脱臼。
- メスやハサミを使用して大腿骨と脛骨から残りの筋肉を取り出し、骨端を壊さないために膝関節運動のケアで脛骨から大腿骨を分離する。氷冷RPMI 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した1640 1Xを含むペトリ皿に骨を置きます。
- 組織培養フードの下には、次の手順に進んでください。 neutrophiを避けるために、厳格な無菌技術を維持するために余分な予防措置を取るLの活性化。
- 骨の表面からエタノールを洗い流すための氷冷滅菌PBS（ペトリ皿内）で3回洗浄し、その後の70％エタノール（シャーレ内）で各ボーンをすすぐ。
- 清潔な滅菌ペトリ皿の中では、骨の骨端を切断し、それらを脇に保つ。
- 25ゲージ針とRPMI、10％FBSおよび2mM EDTAを補充し、100μmのを取り付けた50mlスクリュートップファルコンチューブに骨軸の両端から骨髄細胞をフラッシュで満たされた12 ccの注射器を使用してフィルタ。効率的に全ての細胞を除去するために、25ゲージ針を用いて骨....
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結果
このプロトコルは、マウスからの骨髄細胞と市販のHISTOPAQUE細胞分離媒体を用いた密度勾配遠心分離によりこれらの細胞から好中球のその後の分離を収穫するために最適化される。この方法を用いて単離された好中球は、下流の機能研究のex vivoでの様々なレシピエントマウスにおける養子移入実験のために使用することができる。
感染していない8-12週齢のC57BL / 6マウス当たり大腿骨と脛骨の両方から骨髄細胞の集合体の典型的な収率は〜94から98パーセントの生存で〜60から80000000細胞です。これらの細胞の下流の密度勾配遠心分離HISTOPAQUE密度分離媒体を使用して、典型的には感染していないマウス当たり約6から12000000好中球が得られる。フローサイトメトリー（ 図1）によって確認として好中球は80〜95％の純度であり、> 95％の生存。それは密度の前に、いくつかの動物からプール骨髄細胞には可能ですが勾配遠心分離工程、プーリング細胞はわずかに単離された好中球の純度を低下させる。 PBS収率> 90％純粋好中球.......
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ディスカッション
本明細書で我々は、密度勾配遠心分離法を用いて高純度及び生存したマウスの骨髄からの好中球、多数の単離のための信頼できる、簡単、迅速かつ経済的なプロトコルを提示する。このプロトコルが正しく実行された場合、〜6-12×10 6の好中球は、感染マウスから回収することができ、などの多く〜として30〜40×10 6好中球は、感染後6マウスから単離することができる。隔離された好中球は、80から95までパーセント純粋で> 95％で生存可能である。
骨髄は、下流の機能的研究と養子移入実験用マウスの好中球を得るのに適したリザーバである。まず、予め両区画からの細胞が同様の酸化的破壊及び脱顆粒16を呈するように骨髄好中球は、マウスの血中好中球と機能的に類似していることが示されている。第二に、マウス骨髄好中球protrに耐えることが示されているマウス血好中球16に比べてかなり長い、文化の中での時間の期間を務めた。したがって、血中好中球上の骨髄を採取する機能アッセイを ex <.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する利害関係を持たないことを宣言します。
謝辞
この作品は、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）、国立衛生研究所（NIH）、米国の学内研究部門によってサポートされていました。
すべてのマウスは、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）での実験動物ケア認定の動物施設の認定のためのアメリカ連合に維持され、実験動物のケアと使用のためのガイドで説明する手順に従い、収容されたNIAIDの動物のケアと使用委員会によって承認されたプロトコルの後援の下に。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV& | nbsp; |
| ウシ胎児血清(熱不活化) | GemCell | 100500 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000単位ペニシリン/ 10,000 mg / ml連鎖球菌) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M | EDTAクオリティバイオロジカル株式会社 | 351-027-101 | |
| 0.2%および1.6%塩化ナトリウム | ベイ | カー3624 | 水と滅菌ろ過された滅菌 |
| ろ過されたHistopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077を使用して調製された塩化ナトリウム溶液は、18-26°にする必要があります。使用前のC |
| 滅菌フィルター付きヒストパク1119 | シグマ | 11191 | ヒトパク1119は18-26 °にする必要があります。 |
| カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Cellgro | 210-40-CV& | nbsp; |
| エチルアルコール(200プルーフ) | ワーナーグラハム | カンパニー64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | DMSOで10 mMのストック溶液を作成し、分注して-80°Cで保存します。C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | DMSO中の10 mMのストック溶液を作成し、-80°Cで分注して保存します。C |
| 抗マウスCD45 (クローン 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| 抗マウスLy6G(クローン1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| 抗マウスLy6G(クローン1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| 抗マウスCD11b(クローンM1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| 抗マウスCD16/CD32(マウスBD Fcブロック) | BD Pharmingen | 553141 | 1:100希釈で使用 |
| LIVE/DEAD 固定可能な青色死細胞染色キット | 分子プローブ | L-23105 | 1:1000希釈で使用 |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| パラホルムアルデヒド溶液、PBS | USB Corporation | 19943 | |
| <強い>表1。養子移植された好中球の単離、標識、追跡用試薬. | |||
| 材料 | |||
| C57BL/6匹 | タコニック | ||
| 15 ml遠心分離管 | コーニング | 430053 | |
| 50 ml遠心分離管 | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml血清学的ピペットCelltreat | 229225B | ||
| 10 ml血清学的ピペットCelltreat | 229210B | ||
| 5 ml血清学的ピペット | Celltreat | 229205B | |
| パスツールピペット (3 ml) | BD ファルコン | 357575 | |
| 12 mlシリンジ | ケンドールモノジェクト | 512878 | |
| 25 G x 5/8 インチニードルズ(精密滑空針) | BD | 305122 | |
| 100 mmセルストレーナーBD | Falcon | 352360 | |
| 殺菌性ペトリ皿 | BDファルコン | 351029 | |
| コンビティッププラスバイオプール | エッペンドルフ | 2249608-5 | |
| マウス解剖器具(ハサミ、鉗子、メス) | 生物医学研究機器 | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | 使用前に滅菌した器具 |
| Equipment | |||
| ティッシュ培養フード | The Baker Company | SG403 | |
| 冷蔵遠心分離機 | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37度;Cシェーキングウォーターバス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 3166721 | |
| <強い>表2。この議定書で使用される材料と機器のリスト. |
参考文献
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
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