機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

サマリー

我々は、密度勾配遠心分離によりCellTrackerと染料を用いて好中球標識のマウス骨髄からの好中球の単離および精製のためのプロトコールを述べる。これは、下流の機能研究または養子移入と追跡実験の好中球の多数を取得するための、簡易で、迅速かつ再現性のある経済的な方法を表しています。

要約

好中球は、自然免疫系の重要なエフェクター細胞である。彼らは急速に急性炎症のサイトで募集し、炎症環境に応じて、保護や病原性の効果を発揮している。それにもかかわらず、免疫における好中球の不可欠な役割にもかかわらず、別の感染症や炎症性の条件で好中球 'エフェクターとimmunopathogenic効果を媒介分子の要因の詳細な理解は、まだ、一部ため、その短い半減期のために、これらの取り扱いとの難しさを欠いている細胞および下流機能的研究と養子移入実験のために好中球の十分な数を取得するための信頼性のある実験プロトコルの欠如。したがって、簡単、迅速、経済的かつ信頼性のある方法は、食作用、殺、サイトカイン産生、脱顆粒及び売買などの機能を評価するためにマウスの好中球の十分な数を収穫するために非常に望ましい。そのために、我々は、高純度と生存したマウスの骨髄からの好中球の多数を分離する任意の研究室で適応させることができる再現性の密度勾配遠心分離ベー​​スのプロトコルを提示。さらに、我々は、養子レシピエントマウスに移し、フローサイトメトリーを使用して少なくとも4時間後に転写するためのいくつかの組織で追跡することができる単離された好中球を標識するためにCellTracker染料を使用する簡単なプロトコルを提示する。このアプローチを使用して、異なるCellTracker染料、野生型および遺伝子欠損マウスからの好中球の特異的標識が正常にin vivoで標的組織への血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割を評価するために競争力の再増殖試験を実行するために使用することができる。

概要

好中球は、ヒトにおける最も豊富な白血球です。彼らは、微生物の侵入に対する防御の最初の行としての自然免疫系との行為の主な細胞成分である。好中球の数値および/ ​​または機能に影響を与える買収好中球減少症とプライマリ免疫不全患者では、宿主防御¹でこれらの細胞の重要性を強調し、生命を脅かす侵略的な細菌や真菌感染症を開発。炎症組織²へ^の血流から募集の好中球の走化が可能な勾配を発生させる化学誘引物質の分泌につながるオーケスト自然免疫応答の誘導においてそれらの同族パターン認識受容体の結果感染部位における侵入病原体の免疫認識。好中球は、感染部位を入力した後、彼らは、サイトカインやケモカイン産生につながる、病原体の取り込み活性化、及び酸化および非酸化を介して、私を殺してchanisms ^3。先天性免疫におけるそれらのよく知られた役割に加えて、好中球はまた、最近効果的な適応免疫応答の開始剤⁴として重要な役割を果たすことが示されている。 ^5-7感染性および自己免疫疾患の様に示すように、一方、離間免疫において、保護の役割から、好中球はまた、過剰な蓄積および/ ​​または炎症部位 ​​において活性化に起因する組織損傷および免疫病理を媒介することができる。

いくつかの感染症や炎症状態に効果的な自然免疫応答とその多面的なエフェクター機能を搭載で好中球の不可欠な役割にもかかわらず、これらの細胞は、信頼性の高い実験プロトコルの欠如を取り扱うとの技術的な問題は、過去数十年にわたって好中球との研究を妨げている。したがって、好中球の単離のための再現可能なアッセイの使用は、好中球媒介immunoloに関する更なる研究を促進しなければならないgical機能エクスビボおよびin vivoである 。現在までに、いくつかの方法は、ヒト血液、マウス血液または骨髄^8,9の密度勾配遠心分離、正または負の免疫マウスの血液または骨髄^10,11から好中球を濃縮し、収穫などの好中球の単離のために記載されているチオグリコール酸または他の炎症剤¹²の腹腔内注射後のマウスの腹膜腔から好中球。好中球は簡単に人間の血液から大量に単離することができるが、この方法では、機能的な研究や養子移入実験¹³に十分な好中球の分離を排除マウス血液の限られた量のためにマウスでは次善です。腹膜腔から細胞を誘発チオグリコレートの収率は、マウスの血液に比べて大きくなるが、さらに、炎症性腹腔洗浄液中の好中球の純度の間で変化60から90パーセント、及び単離された好中球が活性化された表現型を示す。マウス腹腔¹²が定常状態でいくつかの好中球を有するこのように、この方法を用いて回収した細胞のみが、非刺激好中球の活性化ではなく、機能的研究を行うために使用することができる。その代わりに、骨髄は、そのような貪食、殺害や脱顆粒などの下流の機能研究のために、またはレシピエントマウスに養子移入に使用することができますどちらか刺激されていないか、または活性化された好中球^11,14、大量の収穫のための便利な貯水池です。

ここで我々は、高収率を提供していますシンプルで高速な（〜2時間）プロトコルを記述（〜6-12×10 ⁶好中球/非感染マウス、または最大30〜40×10 ⁶好中球/感染したマウス）純粋な（80の-95％）骨髄から> 95％の生存率で好中球。この方法は、密度勾配セルSEPAある市販のHISTOPAQUEを使用配給メディアはマウスの骨髄からの好中球を分離するために、フィコールナトリウムジアトリゾエートから成る。この方法は血液または腹膜腔に比べてマウス当たりの好中球のかなり大きな数字をもたらす、それは定常状態でのまたは感染後の両方のマウスから好中球を収集するために使用することができ、それは不連続使用して密度勾配遠心法と比較して、層に容易である55％/ 65％/ PBS ⁹で75％パーコール成るパーコール勾配。また、純粋な好中球を収集するのに必要な時間とリソースを大幅に蛍光活性化細胞ソーティングを用いた好中球の分離に比べて減少する。また、この方法は免疫濃縮工程を必要としないので、それはより費用対効果であり、したがって、好中球活性化の可能性を減少させる、磁気カラムおよび抗体への細胞の曝露を回避する。

単離されたneutrophの機能的研究を行うことに加えてILS のex vivoとレシピエントマウスへの細胞の養子移入は、このプロトコルは異なるCellTracker染料を使用して隔離された好中球を標識するための方法についても説明します。種々の遺伝的背景のマウスからの好中球の特異的標識は、血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割に機械的な洞察を提供することができ、フローサイトメトリーを使用して、レシピエントマウスの組織において転送された好中球を追跡するために競争力の再増殖試験に適合させることができるターゲットに炎症臓器^6。

プロトコル

1。マウス骨髄細胞の単離

1. 機関の動物ケア委員会が承認したプロトコルを使用して、マウスを安楽死させると70％エタノールで動物の表面にスプレーします。
2. 半ば腹部の皮膚の切開を行い、下肢をカバーする皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を除去。
3. はさみを使って下肢から筋肉を切断して大腿骨頭を壊す避けながら慎重に、股関節から寛骨臼を脱臼。
4. メスやハサミを使用して大腿骨と脛骨から残りの筋肉を取り出し、骨端を壊さないために膝関節運動のケアで脛骨から大腿骨を分離する。氷冷RPMI 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した1640 1Xを含むペトリ皿に骨を置きます。
5. 組織培養フードの下には、次の手順に進んでください。 neutrophiを避けるために、厳格な無菌技術を維持するために余分な予防措置を取るLの活性化。
6. 骨の表面からエタノールを洗い流すための氷冷滅菌PBS（ペトリ皿内）で3回洗浄し、その後の70％エタノール（シャーレ内）で各ボーンをすすぐ。
7. 清潔な滅菌ペトリ皿の中では、骨の骨端を切断し、それらを脇に保つ。
8. 25ゲージ針とRPMI、10％FBSおよび2mM EDTAを補充し、100μmのを取り付けた50mlスクリュートップファルコンチューブに骨軸の両端から骨髄細胞をフラッシュで満たされた12 ccの注射器を使用してフィルタ。効率的に全ての細胞を除去するために、25ゲージ針を用いて骨の内側表面をこすり。

注：骨のブランチングは、細胞が十分に削られていることを示しています。

注：大腿骨/脛骨ペアをフラッシュするために、メディアの約10ミリリットルを使用してください。媒体へのEDTAを添加すると、細胞の凝集を防ぐことが不可欠である。

9. 骨骨端をカットメスで小0.5〜1ミリメートル³個および2.5ミリリットルエッペンドルフCombitipプラスBiopurピペットチップのバックエンドを使用して100μmのフィルターを介してそれらを破る。
10. 4℃で7分間1,400 rpmで遠心
11. 約20秒間のNaCl 0.2％20mlに細胞ペレットを再懸濁することにより、赤血球を溶解、1.6％のNaClを20ml加えた。 （クリティカル：骨髄細胞死を回避するために低張溶解の20〜30秒を超えないように、後者は好中球を活性化する可能性を秘めているので、溶解のために低張塩化ナトリウムの使用はACK溶解バッファーに推奨されます。）
12. 4で1,400 rpmで7分間遠心℃で細胞を収集する。
13. 10％FBSおよび2mM EDTAを添加したRPMI 1640 1Xで細胞を洗浄し、ステップ1.12のように遠心分離。
14. この方法を用いて骨髄細胞の収率は約60から80000000まで非感染8-12週齢のC57BL / 6マウス当たりである。

2。好中球の分離密度勾配遠心分離によって

1. 骨髄細胞をカウントし、氷冷滅菌1mlのPBSに再懸濁する。
2. 15 mlコニカルチューブにHISTOPAQUE 1119 3mlの（密度、1.119グラム/ ml）を追加します。
3. HISTOPAQUE 1119 3mlの上HISTOPAQUE 1077のオーバーレイ3ミリリットル（密度、1.077グラム/ ml）を。

注：1119年と1077 HISTOPAQUE HISTOPAQUE℃を使用する前に18-26に温めなければならない。

重要なステップ：事前に勾配の準備として使用直前に勾配を準備するには、2つの層と、次善の好中球の純度と回収の間の拡散になります。

重要なステップ：遠心分離中の細胞分離を排除する2つの密度を混合することを避けるために徐々に行われるように1119年のニーズ以上のオーバーレイHISTOPAQUE 1077、。

4. HISTOPAQUE 1077の上に骨髄細胞懸濁液を重ねる。

重要なステップ：Overl細胞および1077 HISTOPAQUEの間の界面を乱すことを避けるためにゆっくりと行わなければならHISTOPAQUE 1077ニーズ上で骨髄細胞懸濁液をアイイング。

注：1mlのPBSで非感染マウスからの骨髄細胞を再懸濁することが> 90％の純度好中球が得られる。しかし、多くの骨髄サンプルをプールすると好中球純度が損なわれ、例えば、3で300×10 ^6個の細胞を再懸濁mlのPBSは、> 90％〜80％好中球純度を低減します。したがって、研究者は彼らの特定の実験のために理想的な細胞数/ボリュームの条件を識別するためのパイロット実験を行う必要があります

5. 25℃で2,000 rpmで30分間、°ブレーキなしC遠心。

注：室温で勾配の遠心分離は、クリティカルおよび好中球の効果的な分離のために不可欠です。

6. 1119 HISTOPAQUEとHISTOPAQUE 1077層の界面に好中球を収集します。
7. 4で7分間1,400 rpmで10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび遠心℃までで補充1640 1X RPMIで二回収集した好中球を洗う
8. 好中球をカウントし、その実行可能性を決定する。

注：好中球は、典型的には> FACS分析により測定した95％の生存及び> 90％純粋。感染していない8-12週齢のC57BL / 6マウスの骨髄からの好中球の典型的な収量（ すなわち 2大腿骨と2脛骨の骨）〜6から12000000細胞です。好中球は、感染した動物の骨髄から採取されている場合、この番号は、実質的に大きい。 カンジダ感染マウスの細胞採取⁶のために使用されたときしたがって、〜30から40000000好中球/マウスを回収した。

3。 CellTracker染料を使用した好中球のラベル

1. 37℃で温め℃のPBSで5×10 ⁶細胞/ mlで好中球を再懸濁し
2. 最後のコンセントでCellTracker染料を追加5μMの配給。

注：CellTrackerグリーン（CMFDA（5 - Chloromethylfluoresceinジアセテート）およびCellTrackerオレンジ（CMTMR（5 - （および-6） - 4 - クロロベンゾイルアミノテトラメチルローダミン）は、示差野生型および遺伝子欠損から好中球を標識するために、このプロトコルで使用されたマウス。

注：実験の日まで、-80℃で10 CellTrackerグリーンのMMとCellTrackerオレンジ、アリコート、店舗の原液°Cを準備します。

3. 暗闇の中で振盪水浴中で37℃で10分間対応CellTracker色素の5μMと好中球をインキュベートする。
4. 氷冷RPMI 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した1640 1Xで細胞を2回洗浄します。

注：細胞の効率的な洗浄CellTracker色素で標識のステップはダウンのために差動で標識した好中球集団を混合する前に染料交差汚染を回避することが不可欠である後TREAM競争再増殖研究。

4。フローサイトメトリーを使用して転送好中球のマウスおよび分析における好中球の養子移入

1. 25×10 ⁶細胞/ mlと5×10 ⁶好中球がマウスごとに転送されるように、横方向の尾静脈に懸濁液を200μlを注入の濃度で氷冷PBSで再懸濁し好中球。競争力の再増殖の好中球の研究のために、1:1の比率で、野生型および遺伝子欠損好中球を混ぜて、上記のようにマウス当たり5×10 ⁶の好中球の合計を注入。

注：少なくとも、最大10×10 ⁶好中球が養子動物に明らかな即時の毒性なしマウスごとに転送することもできる。

2. 養子移入（ 例えば、1、2、3又は4時間後の転写）後異なる時間で、マウスおよび収穫血を安楽死させる、および/ ​​またはその他の骨髄および/ ​​または他の標的器官（単数または複数）。
3. SIを準備公開プロトコル^6,15を使用して養子移入ラベル好中球の定量的および定性的な分析のために、これらの組織からngle細胞懸濁液。
4. LIVE / DEAD生存染色およびFcの封鎖、CD45（クローン30-F11）とラベル細胞Ly6G（クローン1A8）とのCD11b（M1/70クローン）とゲートライブCD45 ⁺ Ly6G ⁺のCD11b ⁺好中球上の次のこのゲートで好中球はFITC ^{+（CellTracker}グリーンで標識されている場合）またはPE ^+（セルトラッカーオレンジで標識されている場合）であるレシピエントマウスのネイティブ好中球と同様、養子移入ラベル好中球を含む。

注：好中球は、少なくとも4時間後に転送するためにカンジダ感染マウスの血液、骨髄、腎臓で追跡することができる。

注：PBS中2％パラホルムアルデヒドで固定が悪影響CellTracker Grので標識された好中球の平均蛍光強度には影響を与えません少なくとも48時間EENまたはCellTrackerオレンジ。

結果

このプロトコルは、マウスからの骨髄細胞と市販のHISTOPAQUE細胞分離媒体を用いた密度勾配遠心分離によりこれらの細胞から好中球のその後の分離を収穫するために最適化される。この方法を用いて単離された好中球は、下流の機能研究のex vivoでの様々なレシピエントマウスにおける養子移入実験のために使用することができる。

感染していない8-12週齢のC57BL / 6マウス当たり大腿骨と脛骨の両方から骨髄細胞の集合体の典型的な収率は〜94から98パーセントの生存で〜60から80000000細胞です。これらの細胞の下流の密度勾配遠心分離HISTOPAQUE密度分離媒体を使用して、典型的には感染していないマウス当たり約6から12000000好中球が得られる。フローサイトメトリー（ 図1）によって確認として好中球は80〜95％の純度であり、> 95％の生存。それは密度の前に、いくつかの動物からプール骨髄細胞には可能ですが勾配遠心分離工程、プーリング細胞はわずかに単離された好中球の純度を低下させる。 PBS収率> 90％純粋好中球...

ディスカッション

本明細書で我々は、密度勾配遠心分離法を用いて高純度及び生存したマウスの骨髄からの好中球、多数の単離のための信頼できる、簡単、迅速かつ経済的なプロトコルを提示する。このプロトコルが正しく実行された場合、〜6-12×10 ^6の好中球は、感染マウスから回収することができ、などの多く〜として30〜40×10 ⁶好中球は、感染後⁶マウスから単離することができる。隔離された好中球は、80から95までパーセント純粋で> 95％で生存可能である。

骨髄は、下流の機能的研究と養子移入実験用マウスの好中球を得るのに適したリザーバである。まず、予め両区画からの細胞が同様の酸化的破壊及び脱顆粒^16を呈するように骨髄好中球は、マウスの血中好中球と機能的に類似していることが示されている。第二に、マウス骨髄好中球protrに耐えることが示されているマウス血好中球¹⁶に比べてかなり長い、文化の中での時間の期間を務めた。したがって、血中好中球上の骨髄を採取する機能アッセイを ex <...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV&	nbsp;
ウシ胎児血清(熱不活化)	GemCell	100500
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000単位ペニシリン/ 10,000 mg / ml連鎖球菌)	GIBCO	15140
0.5 M	EDTAクオリティバイオロジカル株式会社	351-027-101
0.2%および1.6%塩化ナトリウム	ベイ	カー3624	水と滅菌ろ過された滅菌
ろ過されたHistopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077を使用して調製された塩化ナトリウム溶液は、18-26°にする必要があります。使用前のC
滅菌フィルター付きヒストパク1119	シグマ	11191	ヒトパク1119は18-26 °にする必要があります。
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Cellgro	210-40-CV&	nbsp;
エチルアルコール(200プルーフ)	ワーナーグラハム	カンパニー64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	DMSOで10 mMのストック溶液を作成し、分注して-80°Cで保存します。C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	DMSO中の10 mMのストック溶液を作成し、-80°Cで分注して保存します。C
抗マウスCD45 (クローン 30-F11)	eBioscience	170451-82
抗マウスLy6G(クローン1A8)	BD Pharmingen	551461
抗マウスLy6G(クローン1A8)	BD Pharmingen	560599
抗マウスCD11b(クローンM1/70)	eBioscience	47-0112-82
抗マウスCD16/CD32(マウスBD Fcブロック)	BD Pharmingen	553141	1:100希釈で使用
LIVE/DEAD 固定可能な青色死細胞染色キット	分子プローブ	L-23105	1:1000希釈で使用
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma	67-68-5
パラホルムアルデヒド溶液、PBS	USB Corporation	19943
			<強い>表1。養子移植された好中球の単離、標識、追跡用試薬.
			材料
C57BL/6匹	タコニック
15 ml遠心分離管	コーニング	430053
50 ml遠心分離管	BD Falcon	352070
25 ml血清学的ピペットCelltreat		229225B
10 ml血清学的ピペットCelltreat		229210B
5 ml血清学的ピペット	Celltreat	229205B
パスツールピペット (3 ml)	BD ファルコン	357575
12 mlシリンジ	ケンドールモノジェクト	512878
25 G x 5/8 インチニードルズ(精密滑空針)	BD	305122
100 mmセルストレーナーBD	Falcon	352360
殺菌性ペトリ皿	BDファルコン	351029
コンビティッププラスバイオプール	エッペンドルフ	2249608-5
マウス解剖器具(ハサミ、鉗子、メス)	生物医学研究機器	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	使用前に滅菌した器具
			Equipment
ティッシュ培養フード	The Baker Company	SG403
冷蔵遠心分離機	Thermo Fischer Scientific	75004521
37度;Cシェーキングウォーターバス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	3166721
			<強い>表2。この議定書で使用される材料と機器のリスト.