実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

サマリー

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。

要約

脳卒中のミクログリア/マクロファージの後に（M / M）は、新規表面抗原の発現および構築し、炎症反応を維持するメディエーターの産生を含む劇的な形態学的および表現型変化と急速な活性化を受ける。新たな証拠は、M / Mは、急性脳損傷後の古典（M1）の炎症誘発性または代替抗炎症（M2）の活性化を引き受けることができる、高度なプラスチック細胞であることを示しています。しかし負傷した脳内のM / Mの表現型マーカー発現、彼らの共局在的、時間的進化の完全な特徴付けは、依然として行方不明です。

具体的にはM / M活性化の関連するマーカーを免疫蛍光染色プロトコルは、虚血性脳内で行うことができる。ここでは、局在化およびのようなM / M表現型マーカーの共発現パターンを調査するための強力なアプローチとして、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを提示のCD11b、CD68、Ym1は、中大脳動脈（pMCAOの）の永久閉塞によって誘発される局所的虚血のマウスモデルにおいて。染色された領域の二次元解析では、各マーカーが定義され、M / Mの形態に関連しており、虚血性病​​変内の指定されたローカライズを持っていることが明らかになった。 M / M表現型マーカーの共発現のパターンは、虚血領域における三次元共焦点イメージングによって評価することができる。画像は、ブリードスルーの影響を最小限にし、波長の重なりを回避する順次走査モードで（180 X 135×10ミクロンの体積に相当する、10〜z軸と0.23μmのステップサイズ）規定された体積にわたって取得することができる。画像は、IMARISソフトウェアを用いて三次元レンダリングを得るために処理される。 3次元レンダリングの固体ビューは細胞のクラスターにおけるマーカー発現の定義を可能にする。我々は、M / M、病変部位およびtiの場所に応じて、多数の表現型に分化する能力を有することを示す私損傷後。

概要

急性脳損傷の後、ミクログリアは急速に活性化し、劇的な形態学的および表現型を受けている^1〜3に変更されます。この組み込み関数応答が負傷脳実質^4,5内に移動血液由来のマクロファージの動員に関連している。脳損傷における抗原的に区別できない小膠細胞およびマクロファージの役割（以下、M / Mという）まだ議論されている。研究が増えても同様に、末梢マクロファージについて記載されたものに、ミクログリアおよび脳はマクロファージが、その極端な（M1）の古典的な前炎症性毒性または抗炎症保護（M2）の表現型に対応して異なる表現型をとることができる募集、ことを示している。炎症または抗炎症因子の分泌を含む異なる活性化状態、神経栄養性分子およびリソソーム活性の放出は、その発現が時間的に依存する表現型マーカーの特定のパターンによって特徴付けられる周囲の環境の進化。負傷した脳内のこれらのM / Mの表現型の特徴付けはまだ乏しいです。私たちは、脳卒中後のM / Mの発現と進化を分析するpMCAOのの老舗マウスモデルを使用していました。ここで紹介する免疫蛍光ベースのプロトコルは、特定のM / M表現型マーカー、それらの局在と虚血領域における細胞の共発現の外観への洞察を得ることを目指しています。我々は、異なる活性化状態または表現型に関連するいくつかの分子を調べ、すなわちのCD11b、白血球及びM / Mの活性化/人材紹介^6-8の広く使われているマーカーによって発現される表面マーカー、CD68リソソーム^6,7とYm1は分泌のマーカータンパク質は、代替的にアクティブ化（M2）、マクロファージで発現し、回復と機能回復^9月10日に関連付けられている。

2マーカーが同じセルによってではなく、様々な細胞内コンパートメントで表現されている場合、単独の共局在はあまりINFできない場合がありますormative。この場合、共発現の分析は、単一の平面図を用いて三次元レンダリングを行うことができる。ここでは、マーカーの同時発現の完全な三次元解析を得るためのプロトコルを記載している。

プロトコル

1。免疫蛍光

以下のプロトコルを経心的に灌流したマウス（PBS中の冷却したホルムアルデヒドを50mlの4％、続いてPBS、0.1モル/リットル、pH7.4の20mlの）から得られた冠状脳の凍結切片上で行われる。灌流後、脳を慎重に除去し、凍結保護のために4℃で一晩PBS中30％スクロースに移した。バイアルに密封し、-70℃で使用するまで保存される前に、3分間45°C - 脳を急速にイソペンタンに浸漬することによって凍結させる。冠状脳凍結切片（20μm）を連続的にカットし、免疫蛍光プロトコル^11、6を受ける。

使用前に室温にすべての試薬およびサンプルを持参してください。抗体および血清の提示作業希釈は最高のパフォーマンスを得るために作ら試験から生じたことに注意してください。異なる抗体および血清が使用される場合、プロトコルは、検証される必要がある。

抗CD11bおよび抗CD68一次抗体の両方が抗ラットアレクサ546でゼロクロス信号を避けるために、ラットで行われているため、我々が蛍光シグナル増幅に続く抗CD11bの高希釈を使用したことに注意してくださいTSAキット（Cy5のチラミド）。我々はステップ1.17を除いて記述されたプロトコルを実行し、表1に報告されているように抗CD11bの少なくとも7種類の希釈液を使用することによって抗CD11bに最適な希釈率を設定している。 ;励起波長でアレクサ546と2）無信号532 nmの1）可視シグナルCy5で励起波長646 nmで：結果として、1:30,000の希釈化の達成という選択されています。このように、アレクサ546蛍光シグナルを選択的にCD68発現に関連されている。

抗CD11bおよび抗CD68抗体のための最適な希釈は、組織のタイプに応じて変えることができると共標識化プロトコルを開始する前に定義する必要があります。

1. PBSで2回脳凍結切片を洗浄します。
2. で1％H ₂ O _2を含有するPBS中で5分間cubate凍結切片（蛍光増幅が西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン-HRPとのインキュベーションを必要とするため工程が必要、ステップ1.12参照）。
3. 洗浄凍結切片をPBSで2回。
4. 10％のNGSおよび0.3％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
5. PBSは、一次抗体、ラット抗CD11b [1:30,000]、10％NGSおよび0.3％トリトンを含有する4℃で一晩凍結切片をインキュベートする。
6. 洗浄は、PBSで2回（5分）凍結切片。
7. ビオチン化二次抗ラットAB [1:200]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
8. 洗浄凍結切片をPBSで2回。
9. TNTで洗浄する凍結切片（トリス-HCl、NaClを、ツイーン：0.1 M TRIS-塩酸、pH 7.4、0.15 MのNaCl、0.05％のTween 20）。
10. TNB中で1.5時間、凍結切片をインキュベートします（バッファをトリス塩酸-NaClのブロッキング：0.1 Mトリス塩酸、pH 7.4、0.15MのNaCl、適切なキットは0.5％ブロッキング試薬（試薬の表を参照））。
11. ウォッシュクライオのセクションでは、TNTで時間を3倍。
12. ストレプトアビジン-H​​RP [1:100]を含むTNB中の凍結切片をインキュベートする。
13. 洗浄は、TNTで3回凍結切片。
14. シアニン5チラミド[1:300]を含む増幅希釈液中で8分間の凍結切片をインキュベートする。
15. 洗浄凍結切片をPBSで3回。
16. 10％のNGSおよび0.1％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
17. 一次抗体ラット抗CD68 [1:200]、3％NGSおよび0.3％トリトンを含むPBSで一晩4℃で凍結切片をインキュベートする。
18. 洗浄凍結切片をPBSで3回。
19. fluorconjugated二次抗体アレクサ546抗ラット[1:500]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
20. 洗浄凍結切片をPBSで3回。
21. ヘキスト1μg/ mlのを含むPBS中で10分間凍結切片をインキュベートする。
22. 洗浄凍結切片をPBSで3回。
23. 長引かゴールド凍結切片をマウントします。

2。共焦点顕微鏡による三次元画像の取得

ここで使用顕微鏡は3レーザーラインを持つ共焦点走査ユニットFV500を装備したIX81顕微鏡た中、Ar-KR（488）、ヘリウムネオン赤（646nm）、およびヘリウムネオングリーン（532）と紫外線ダイオード。

1. 励起する蛍光色素の波長によって励起レーザを選択します（Cy5の、CD11bのためのHe-Ne赤、Alexa546、CD68およびヘキスト、核についてのUVダイオードのヘリウムネオングリーン）。
2. 光信号収集のための最高のダイクロイックミラーの組み合わせを選択します。
3. 800×600ピクセルの最小の画像の解像度を設定します。
4. 落射蛍光を利用して、関心領域を特定し、徐々に対物レンズ40倍に倍率を上げる。
5. レーザー走査顕微鏡（LSM）モダリティに切り替えます。
6. 光電子増倍管（PMT）と、各チ​​ャンネルのゲインを調整するために繰り返しスキャンを実行します。レーザは、セットを容易にするために個々にオンにすることができる。不要な非特異的シグナルを避けるために、可能な限り低く、利得を保持します。
7. REPEとtitiveスキャン実行して、z軸（合計z軸の長さ=10μm）を、下限および上限の極端な値を定義するためにフォーカス制御を移動する。
8. 反復的なスキャンを停止します。
9. ステップサイズを定義します。これは、z軸上で1：01標準サイズ比を得るために、画素サイズ（0.225ミクロン）のできるだけ近くにあるべきである。
10. カルマンフィルタを少なくとも2回をアクティブにします。
11. ブリードスルー効果を避けるために、シーケンシャルスキャンモードを有効にします。
12. ハーフウェイz軸に沿って移動し、XY順次スキャンを実行します。 PMTの設定およびゲイン（良好な信号/ノイズ比）を確認してください。満足できない場合は、手順2.6を繰り返します。
13. XYZ買収を実行します。
14. multitiffファイルとしてデータをエクスポートします。各multitiffファイルは、通常、3色チャネル（青、緑、赤）と44の焦点面が含まれています。

3。共焦点取得の立体図と3次元レンダリング

IMARISソフトウェアにmultitiffファイルをアップロードし、次のようにそれらを処理する。

1. オープンソフトウェア。
2. 上回るビューを選択します。
3. multitiffファイルをアップロードします。
4. 各チャネルの希望の色を選択します。
5. 表示調整パネルの最小値を大きくすることにより、バックグラウンドのノイズを除去する。個別に各チャネルを調整します。
6. セクション·ビューに移動します。共局在（黄ピクセル​​）を探して、Z軸に沿って移動する。
7. （ すなわち、固体のオブジェクトに属している）の共局在は、z軸に沿って存在しているかどうかを見るために、黄色のエリアをクリックしてください。 Z軸投影は、図の右と下の部分に表示されます。
8. スナップショットを作成します。
9. ビューを上回る戻ります。
10. 細胞または細胞のクラスターを単離するために、3Dをトリミング。
11. 表示調整パネル上の1チャンネルを選択します。
12. 上回る/サーフェスアルゴリズムビルダーを選択します。アルゴリズムステップ：
    1. チャンネルを選択します。
    2. しきい値を定義します（Tで同じ最小値を使用彼は） 調整パネルを表示します 。
    3. サイズ変更を定義します。
    4. （0.200 =最良）スムージング定義します。
    5. 色の外観を定義する。
    6. アルゴリズムを終了する。
13. 各チャンネルについて、手順3.12。
14. 表示調整パネルの蛍光チャネルの選択を解除し、すべての3 の面を選択します。
15. 最高の景色を見つけて、ボリュームを移動します。
16. スナップショットを作成します。

結果

標識プロトコルおよび共焦点買収が虚血領域に行われる場合の結果の一例が図1Aおよび図1Bに示されている。取得された画像の二次元図で二十四時間虚血（A）の後で、リソソームマーカーCD68（緑）が虚血性コア中に存在する肥厚性アメーバ様CD11b細胞（赤色）において発現されることを示している。ボーダーゾーン（B）にはCD11b陽性細胞は、丸い細胞体とCD68に対する肯定枝状のプロセスを表示します。 Z軸突起（右と下の部分A及びB）は、単一の平面図に記載されたマーカーの分布はまた、z軸に沿って存在するか否かの可視化を可能にする。共局在が発生した場合には、黄色のピクセルが生成されます。 CD11bのは、C3フラグメントのための受容体であり、膜の分布を示す。 CD68は、リソソームにラベル付けし、主に細胞質ゾル中にこのように存在している。 CD11b/CD68二重陽性細胞は、通常、共局在ボクセルの小さな割合を有し、ほとんどの場合には、CD11bのCD...

ディスカッション

ここでは虚血領域への局在化およびM / M表現型マーカーの共発現を調査するための強力なアプローチ（より詳細な分析のために、参考文献^6を参照）のような三次元共焦点解析に続いて免疫蛍光ベースのプロトコルを提示する。この方法は、3次元共焦点イメージングとM / Mの活性化の関連マーカーの特異的染色を兼ね備えています。抗体、血清および作業希釈液をfluorconjugatedの微調整を検討したマーカーのSN比に最適な信号を可能にする。三次元レンダリングを得るための画像処理は、M / M.の機能状態を示す取得された画像を作り、セルのクラスタ内のマーカー発現の定義を可能にする研究が増えて、今のM / Mは、多様な表現型を獲得し、周囲の信号に応じて、異なる機能のプログラムを係合することができる、高度なプラスチック細胞であることに同意するものとします。炎症環境は、時間の経過とともに進化し、組織化することがM / Mの偏光、in vivo試験の方がはるかに有益in vitroモデルよりも、リクルート/活性化した細胞の完全なネットワークを再現することができないこと。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
アンチマウス CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
抗マウス Alexa 488	Invitrogen	A-21121
抗ウサギ Alexa 594	Invitrogen	A-11037
正常ヤギ血清	ベクター研究所	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 共焦点顕微鏡	Olympus
AnalySIS ソフトウェア	Olympus
Imaris ソフトウェア 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
ソフトウェアパッケージ GraphPad Prism バージョン 4.0	GraphPad Software株式会社