マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

サマリー

筋線維芽細胞は、正常および疾患状態の両方において重要な生理学的プロセスを調節、胃腸管の有力な間質細胞である。我々は、マウスおよびインビトロ実験のために利用することができるヒト結腸組織の両方からの一次筋線維芽細胞の単離を可能にする技術が記載されている。

要約

筋線維芽細胞は、多くのGI機能におけるその重要な役割のためにかなりの注目を集めている胃腸（GI）管の間質細胞である。いくつかの筋線維芽細胞株は、インビトロでこれらの細胞を研究するために市販されているが、実験的な細胞培養条件に曝露された細胞株からの研究結果は、作業の過度に還元主義的性質に起因する固有の限界を有する。一次筋線維芽細胞の使用は、細胞株で特定された実験結果を確認するという点で大きな利点を提供しています。動物モデルからの一次筋線維芽細胞の単離は、より厳密に検討されて疾患状態を模倣する条件下での筋線維芽細胞の研究を可能にする。細胞は基礎疾患を持つ患者から直接来ているので、ヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の単離は、間違いなく、最も関連性の高い実験データを提供しています。我々はUであり得る、十分に確立された技術を説明マウスおよびヒト結腸組織の両方からの一次筋線維芽細胞を分離するためにtilized。これらの単離された細胞は、上皮下腸の筋線維芽細胞と一致してα-平滑筋アクチンとビメンチン陽性、およびデスミン陰性であることが特徴づけられている。一次筋線維芽細胞は、細胞培養で増殖させ、継代の数が限られにわたって実験目的のために使用することができる。

概要

胃腸（GI）管の機能の調節は、粘膜層とその下にある間葉との間の複雑で動的な相互作用を伴う。これらの相互作用は、通常は恒常性を維持するのに役立つだけでなく、病的条件¹での疾患状態の発症につながる可能性がある。筋線維芽細胞は、粘膜の再生、修復、および線維症^2を含む重大な胃腸管プロセスの数を調節する細胞亜集団を包囲してパラクリン様式で通信する上皮層への直下に位置する間質細胞の亜集団である。

18 CO細胞株は、それがインサイチュ筋線維芽細胞の一次の特徴の多くを共有しているため、広く筋線維芽細胞の機能を研究するために使用されているヒト結腸筋線維芽細胞株の一例である。これらは、タンパク質-平滑筋アクチン（α-SMA）の発現およびビメンチン、並びに多数の発現を含む例えば、上皮成長因子受容体、又はリゾホスファチジン酸^、3,4に対する受容体などの細胞表面受容体。なぜならこれらの共有超微細構造特性、ならびに生物学的機能⁵の類似性、18 CO細胞株は、炎症性腸疾患または結腸直腸癌^3,6のような多くの疾患状態のコンテキストで筋線維芽細胞の機能を研究するために広く使用されている。しかし、細胞株を用いて固有の限界や懸念がある。これらは他の細胞集団との成長率との相互作用など、細胞の表現型および生物学的機能を変化させる、一次細胞から細胞株を区別し、経時的遺伝子型不安定性が含まれる。細胞株もまた、その使用に対する主な制限である消化管の微小環境（上皮、間質、および血管成分）を、通常の構成要素を欠いている。したがって、実験的な細胞株の研究から引き出された結論は、里を減少させるためにさらなる検証が必要で誤解のSK。

一次筋線維芽細胞は、細胞株⁷において同定実験結果を確認するために、ヒトおよびマウスの結腸組織から得ることができる。この方法は、もともとMahida ら ⁸によって記述され、我々のプロトコルは、マウスおよびヒト結腸⁹から一次筋線維芽細胞を単離するために用いることができる多くのよく説明される技術の一つであるした。結腸疾患の任意のマウスモデルについては、この技術は、GI ^10,11を処理し、それらが隣接細胞とどのように対話するかを研究するために、一次筋線維芽細胞を単離するか、正常または病的両方に寄与するために使用することができる。この技術は、筋線維芽細胞は、治癒、線維症、および結腸直腸腺腫および癌腫の発生を粘膜に寄与する方法を研究するために使用することができる。一次筋線維芽細胞はまた、良性（炎症性腸疾患、狭窄、憩室炎）または悪性のc運転時に切除されたヒト結腸組織から得ることができるonditions。ヒトおよびマウスの結腸組織から単離した初代細胞は、細胞培養で増殖させ、継代の数が限られにわたって利用することができる。

プロトコル

1。結腸組織を得る

マウス

研究の根拠と目的を詳細に動物実験を行うためのプロトコルでは、提出され動物実験的監督の私たちの事業オフィスによって承認された。

1. 頸椎脱臼に続いて吸入イソフルランでマウスを安楽死させる。
2. 腹側正中切開を行い、離れて小腸を撤回し、コロンを識別します。横方向に膀胱と子宮（存在する場合）を撤回し、恥骨を特定し、直腸を露出させ細かいハサミでカット。
3. 大腸から直腸の背側腸間膜を解剖し、肛門から盲腸までコロンを動員し、小腸からの結腸を切断し、それを横断する。
4. 氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に試料を置く。
5. 氷冷PBSで10ミリリットルの注射器を記入し、コロンをフラッシュし、大腸OPEを切断し、その内容をクリアするために数回ルーメンN長さ方向はさみを使って。
6. 氷冷PBSの20ミリリットルを含む50ミリリットルコニカルチューブにコロンを置きます。結腸は、任意の特定の方向に配置される必要はない。流体が無い粒子状物質と透明になるまで、PBSを交換して、コロンを洗ってください。

人間

この組織だけでなく、潜在的なリスクとベネフィットの評価を得ることの重要性を詳述手術患者からのヒト組織を得るためのプロトコルは、ヒューマン研究保護プログラムの我々の事業オフィスから提出され、承認されました。

1. 大腸外科医との共同研究は、研究のためのヒト組織を得ることができることが必要である。ヒトの大腸の組織を得るためのプロトコルが提出し、治験審査委員会によって承認されなければならない。
2. 書面によるインフォームドコンセントを、外科手術の前に患者から得られる。
3. 外科医は、スタンドに結腸切除を行いますARDファッション。結腸は、患者から除去された後、試料を直ちに病理に取り込まれる。病理学的評価のために必要ではない結腸壁の全厚部0.5が設けられており、すぐに氷冷したPBS上に配置される。この標本は、大腸間膜を含めるべきではなく、脂肪の存在は消化過程に影響を与えますので、大網付属は、同様に削除する必要があります。

2。上皮細胞はぎ取る

1. 50ミリリットルコニカルチューブ内のHBSS中の5ミリモルのEDTA（室温）25mlに、全マウス結腸をインキュベートする。 15分間空気浴（250回転）しながら37℃にコニカルチューブを配置します。 15分後、慎重に液体を捨て、5のEDTA 25mlでチューブを補充、5回の洗浄の合計のため繰り返します。ヒトの大腸では、病理医から結腸壁の2分​​の1インチのストリップを得た後、4つの等しいサイズのピースにハサミでコロンをカット。 1 50ミリリットルコニカルチューブにピースの2を置き、独立した50ミリリットルコニカルチューブに結腸組織の残りの2個を配置。そして、前述したように、HBSS中5mMのEDTA 25mlでインキュベートおよび洗浄を行う。
2. 氷冷PBS 20mlに二度、コロンを洗浄します。
3. RPMI-5の20ミリリットル、ディスパーゼの10、U、およびコラゲナーゼDの2000 U（室温）を含む新しい50ミリリットルコニカルチューブにマウス結腸組織を置きます。ヒト大腸組織のために、ディスパーゼおよびコラゲナーゼ（20 U字ディスパーゼ、4000のUコラゲナーゼD）の二倍の量を使用しています。
4. （水平に置いた場合は、あまりにも多くの通気や細胞の損傷がある）、垂直に配向37℃の揺れの空気浴中のチューブを配置します。最大60分間、250rpmで振とうする。ディスパーゼおよびコラゲナーゼDに暴露した後、結腸組織を消化するために開始され、結腸組織は、糸を見て開始されます。これは通常約30分かかります。コロンは、この外観を有する場合には、酵素からコロンを削除します。
5. 組織を分割するには、上下2〜4回、各チューブを横に振る。 P5分間、卓上遠心機（4℃）で200×gで組織をエレト。慎重に上清を捨て、捨てます。

3。筋線維芽細胞の単離および培養

1. を10mlのACK溶解緩衝液（47°C）を添加することにより、各ペレットを再懸濁。遠心分離器は、再び5分（4℃）のための200×gで、捨て、上澄みを捨てる。
2. ピペットを用いて10ミリリットルのRPMI-5を追加して、各ペレットを再懸濁します。
3. 100ミリメートルのTC処理皿に10ミリリットルピペットを用いて70ミクロンメッシュストレーナーを通して細胞懸濁液（5ミリリットル）の半分を渡す。その後RPMI-5の追加の15ミリリットルを追加します。別の100ミリメートルのTC処理皿に細胞懸濁液の残りの5ミリリットルを繰り返します。一つのマウス大腸は、したがって、2 100ミリメートルのTC処理の料理が得られます。ヒトの大腸組織の一つ½インチのストリップは4 100 mmのTC処理の料理の合計が得られます。
4. 37℃、10％CO ₂インキュベーター内で組織培養皿を置き培養条件は同じfはあるいは、マウスおよびヒト初代細胞。
5. 3時間後、そっとのHBSS 2回交換して非接着細胞を洗い流してください。破片の浮動を静かに洗浄する必要があります。接着細胞は、上皮細胞、マクロファージおよび筋線維芽細胞で構成されている。一週間播種後、唯一の除算を筋線維芽細胞、マクロファージおよび上皮細胞は最初の継代後に老化。新鮮なRPMI-5を添加し、細胞培養物中の細胞を成長させる。
6. 細胞を5分間トリプシン処理により継代すると2:1に分割されています。

略語

HBSS：ハンクス液、RPMI-5：ロズウェルパーク記念研究所媒体、ACK：塩化アンモニウムカリウム、FCS：ウシ胎児血清、TC処理：組織培養処理

ソリューション

ACK溶解緩衝液- （4.15グラムNH ₄ Clで0.5グラムKHCO _3、18.6ミリグラムのNa ₂ EDTAを400 mlのH ₂ O、1 N HClでpH7.2〜7.4にpHを調整する）。フィルタsterilizEでの0.2μmのフィルターや店舗を通じて4℃のRPMI-5 - （500ミリリットルにする方法：454.5ミリリットルのRPMI、25ミリリットルのFCS、5ミリリットル200 mM L-グルタミン、5ミリリットルの1M HEPES、pH7.4で、5ミリリットルを100 mMピルビン酸ナトリウムを5ml 100×ペニシリン - ストレプトマイシン、PBS 500 mlの50 mMのB-ME）。

結果

一旦単離される、初代ヒト筋線維芽細胞は、細胞培養で増殖させ（継代4まで）の通路の限られた数の上で使用することができる。これらの細胞は腸管上皮下筋線維芽細胞^5,7と一致して、平滑筋アクチンとビメンチン陽性であると特徴づけ、およびデスミン陰性（ 図1A）されています。それらはまた、特徴的な星状形態（ 図1B）を有する。一次筋線維芽細胞は、次いで細胞株において同定実験的知見を確認するために使用することができる。このアプローチは、これらの細胞は⁷でEGF受容体の発現およびシグナル伝達のアップレギュレーションを誘導した炎症誘発性サイトカインTNF-α（10 ng / mlの）ことを実証するために利用された。アップレギュレートされたEGF受容体の発現およびシグナル伝達は、最初に前述のヒト結腸筋線維芽細胞株18 CO（ 図2）を利用して見出された。 図2Aにおいて、我々は、TNF-18 COへの細胞の曝露を実証45、EGF受容体の発現の時間依存的な増加につながった。これは、...

ディスカッション

マウスまたはヒトの結腸のいずれかを使用するときの一般的な手法は同様である。この技術はまた、小腸からの筋線維芽細胞を単離するために使用することができる。 1からの筋線維芽細胞を単離するための具体的な詳細。マウスと2。ヒトの大腸を以下に説明します。

1。マウス結腸

マウス結腸の灌注は、結腸の一端に16 Gポッパー平滑末端針4を取り付けることによって促進される。結腸の長さ方向に切断するときにも役立つ。その後、鋭い端を上にしてはさみの1チップを配置し、針の上に結腸組織をアコーディオン縦に開くようにカットしながらシザー縁の上結腸組織をスライドすることができる。

ステップ2.1では、死んだ細胞からの核物質が細胞凝集につながる可能性があることを理解することが重要です。 DNアーゼ（50 mg / ml）での添加は、この問題に対処するために使用することができる。

最も重要なステップは、ステップ2.4​​である。 CAを保つ結腸組織のref...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬名	会社	カタログ番号	コメント(オプション)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper 鈍い針	Fisher	#14-825-16K