単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

Summary

マイクロ流体酸素制御は、生物学実験のための低酸素チャンバーよりも利便性とスピード以上のものを提供します。特に、膜を介した拡散を介して実装された場合、マイクロ流体酸素は、マイクロスケールレベルで液体と気体の相を同時に調整することができます。この技術により、膵島の病態生理学の研究に不可欠なダイナミックなマルチパラメトリック実験が可能になります。

Abstract

単一の技術におけるグルコース刺激-分泌カップリング因子の同時酸素化とモニタリングは、特に移植環境における膵島低酸素症の病態生理学的状態をモデル化するために重要です。標準的な低酸素チャンバー技術では、両方の刺激を同時に調節することも、グルコース刺激と分泌の結合因子をリアルタイムでモニタリングすることもできません。これらの困難に対処するために、多層マイクロ流体技術を適用して、拡散膜を介して水相変調と気相変調の両方を統合しました。これにより、透明ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイス内のマイクロスケールの膵島の周囲に刺激サンドイッチが作成され、蛍光顕微鏡による前述の結合因子のモニタリングが可能になります。さらに、ガス入力は一対のマイクロディスペンサーによって制御され、0〜21%の酸素の定量的なサブミニッツ変調を提供します。この断続的な低酸素症は、膵島のプレコンディショニングの新たな現象を調査するために応用されています。さらに、マルチモーダル顕微鏡を武器に、これらの低酸素イベント中のカルシウムとK_ATPチャネルのダイナミクスを詳細に調べることができました。私たちは、マイクロ流体低酸素症、特にこの同時二相法を、膵島や多くのex vivo組織を研究するための貴重なツールとして想定しています。

Introduction

動的低酸素症は生物学、特に膵島移植において重要です

動的低酸素症は、多くの生体組織において重要な生理学的および病態生理学的パラメータです。例えば、酸素の変化は、血管新生における強力な発生シグナルです。さらに、低酸素症の空間的および時間的パターンはHIF1-αを調節し、膵臓癌などの疾患で役割を果たします。低酸素症は、膵島移植の結果に影響を与える交絡因子でもあります。近年、低酸素症の時間的振動、または間欠性低酸素症(IH)が「プレコンディショニング」膵島¹で効果を発揮しています。しかし、膵島の生理学に対する静的および一過性の低酸素の影響は、主に膵島の微小環境を制御するための適切なツールが不足しているため、まだ十分に理解または研究されていません。

膵島は生体内で血管新生が良好

膵島は、グルコース恒常性に関与するベータ細胞やアルファ細胞を含む内分泌細胞の50〜400μmの回転楕円体凝集体です。膵島が血液中の刺激性グルコースにさらされると、取り込みと解糖がATP産生につながり、ATP感受性カリウム(K_ATP)チャネルが開き、インスリン顆粒のエキソサイトーシスを引き起こすカルシウム流入がもたらされます。酸素はこの代謝性の高いプロセスを促進するために重要であり、インスリン分泌は、グルコース勾配に加えて、血流と酸素供給のダイナミクス....

Protocol

1. マウス島の準備

1. C57BL/6マウスを解剖し、コラゲナーゼ消化とFicoll密度勾配分離により膵島を分離します。(^2,3で参照されているJOVEの記事を参照してください)。
2. 10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 20 mM HEPES をペトリ皿 (37 °C、5% CO₂) に含む RPMI-1640 培地で膵島をインキュベートします。分離後、実験で使用する前に24時間膵島を培養します。一貫した結果を確保するために、1〜2日以内に小島を使用してください。

2. マイクロ流体プラットフォームを作る

1. 各デバイス層の透明フォトマスク上に、1)入口と出口、2)ペリフュージョンチャンバー付きグルコースマイクロ流体層(直径8 mm x 3 mm、150 μl)、3)マイクロウェル付き200 μmメンブレン(直径500 μm、深さ100 μm)、4)ガスマイクロ流体層の微細構造形状を生成します。
2. 入口層と出口層を製造するには、脱気した予混合PDMSをブランクのペトリ皿に1.5mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。
3. グルコースマイクロ流体層を作製するには、SU8-2150の2つの350μm層を回転させて、4inシリコンウェーハ上に単一の700μm層を形成します。

Results

この膵島低酸素技術の中心となるのは、同じマイクロ流体チャンバー内で水相と気体相の刺激を微小スケールの過渡現象で変調する能力です。図1は、a)二重刺激とb)膵島腔内で測定された高速変調の代表的な結果です。フルオレセインをチャンバー内に導入することで示される水性変調は、3〜4分間の混合で平衡化を達成します。さらに、酸素は高速過渡現象で5〜21%までステップアップできるため、最短2分で酸素を循環させることができます。図2に示すように、さまざまなサイクリングの深さと周波数も達成できます。

このサイクルを適用して小島で断続的な低酸素状態を作り出すと、低酸素症に対する膵島をプレコンディショニングする利点を観察できます。これは、規則的な正常酸素パルスと比較して、図3aです。インスリン分泌のシグナル伝達メカニズムである細胞内カルシウムフラックスはリアルタイムでモニタリングされるため、カルシウム過渡現象のオーバーシュートと振動減衰に低酸素症とIHの影響を観察できます(図3b

Discussion

この膵島低酸素症技術に統合された複数のモダリティは、トラブルシューティングのためにここで言及されているいくつかのポイントを示しています。まず、単離された膵島は、腺房細胞からの消化酵素により、培養中で分解および崩壊し続けます。したがって、膵島分離後1〜2日で実験を標準化することは、一貫した結果を得るために重要です。第二に、層流と拡散の境界での対流クリアランスを防ぐために、低酸素症および断続的な低酸素症中に水流を停止しました。これにより、膵島のプレコンディショニングの期間が制限されるようです。将来的に水性チャネルにガス交換を統合することで、膜での迅速なガス変調を可能にしながら、この小さなクリアランスを排除できます。第三に、膵島にロードしている間、気泡が閉じ込められないように、水性チューブを逆の順序で慎重に再接続する必要があります (出口、入口)。最後に、将来のデバイスは、ファンアウトされたマイクロ流体ディストリビューターで拡張され、膵島のクラスターをチャンバー全体に分散させることができ、その底部にはトラッパーポケットの配列でパターン化できます。ポケットアレイに加えて、このマイクロ流体分布は、ハイスループット実験のための膵島の位置配列を作成す.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料
スピナー	ローレル	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
デジタルホットプレート	PMCデータプレート	722A
UV硬化ランプ	OmniCure	S1000
PMDS	ダウケミカル	シルガード184
コロナワンド	ETP	BD-20AC
チャンバーBel-Art	420220000
マイクロディスペンサー	The Lee Company	IKTX0322000A
5 Vおよび20 V DC電源	ラジオシャック
NI USB	ナショナルインスツルメンツ	NI USB-6501
温度計	Omega Engineering, Inc.
蠕動ポンプ	ギルソン	ミニパルス 2
酸素センサー	オーシャンオプティクス	NeoFox
フラクションコレクター	ギルソン	203
ピペット	フィッシャー サイエンティフィック	フィンピペット II 100μl
倒立落射蛍光顕微鏡	ライカ	DMI 4000B
50 ml コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック
Fura-2 蛍光色素	分子プローブ、ライフテクノロジー
ズ ローダミン 123 蛍光色素	分子プローブ、ライフテクノロジー
カルチャーメディア	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
グルコース	Sigma-Aldrich
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich
30 in シリコンチューブ	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		1/16インチおよび4mm
シリンジコネクタ	コールパーマー		メスルアープラグ 1/16インチ
ストレートコネクタ	コールパーマー1		/16インチ
ボーコネクタ	コールパーマー1		/16インチ