単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

Summary

マイクロ流体酸素制御は、生物学実験のための低酸素チャンバーよりも利便性とスピード以上のものを提供します。特に、膜を介した拡散を介して実装された場合、マイクロ流体酸素は、マイクロスケールレベルで液体と気体の相を同時に調整することができます。この技術により、膵島の病態生理学の研究に不可欠なダイナミックなマルチパラメトリック実験が可能になります。

Abstract

単一の技術におけるグルコース刺激-分泌カップリング因子の同時酸素化とモニタリングは、特に移植環境における膵島低酸素症の病態生理学的状態をモデル化するために重要です。標準的な低酸素チャンバー技術では、両方の刺激を同時に調節することも、グルコース刺激と分泌の結合因子をリアルタイムでモニタリングすることもできません。これらの困難に対処するために、多層マイクロ流体技術を適用して、拡散膜を介して水相変調と気相変調の両方を統合しました。これにより、透明ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイス内のマイクロスケールの膵島の周囲に刺激サンドイッチが作成され、蛍光顕微鏡による前述の結合因子のモニタリングが可能になります。さらに、ガス入力は一対のマイクロディスペンサーによって制御され、0〜21%の酸素の定量的なサブミニッツ変調を提供します。この断続的な低酸素症は、膵島のプレコンディショニングの新たな現象を調査するために応用されています。さらに、マルチモーダル顕微鏡を武器に、これらの低酸素イベント中のカルシウムとK_ATPチャネルのダイナミクスを詳細に調べることができました。私たちは、マイクロ流体低酸素症、特にこの同時二相法を、膵島や多くのex vivo組織を研究するための貴重なツールとして想定しています。

Introduction

動的低酸素症は生物学、特に膵島移植において重要です

動的低酸素症は、多くの生体組織において重要な生理学的および病態生理学的パラメータです。例えば、酸素の変化は、血管新生における強力な発生シグナルです。さらに、低酸素症の空間的および時間的パターンはHIF1-αを調節し、膵臓癌などの疾患で役割を果たします。低酸素症は、膵島移植の結果に影響を与える交絡因子でもあります。近年、低酸素症の時間的振動、または間欠性低酸素症(IH)が「プレコンディショニング」膵島¹で効果を発揮しています。しかし、膵島の生理学に対する静的および一過性の低酸素の影響は、主に膵島の微小環境を制御するための適切なツールが不足しているため、まだ十分に理解または研究されていません。

膵島は生体内で血管新生が良好

膵島は、グルコース恒常性に関与するベータ細胞やアルファ細胞を含む内分泌細胞の50〜400μmの回転楕円体凝集体です。膵島が血液中の刺激性グルコースにさらされると、取り込みと解糖がATP産生につながり、ATP感受性カリウム(K_ATP)チャネルが開き、インスリン顆粒のエキソサイトーシスを引き起こすカルシウム流入がもたらされます。酸素はこの代謝性の高いプロセスを促進するために重要であり、インスリン分泌は、グルコース勾配に加えて、血流と酸素供給のダイナミクスに大きく影響されます。膵島は、毛細血管から1細胞長以内の膵臓で高度に灌流されているため、このグルコース-インスリン応答をin vivoで容易に実行できます。しかし、膵島内毛細血管の密集したネットワークは、膵島単離中にコラゲナーゼによって除去されます^2,3。その結果、拡散の制限により、酸素と栄養素の両方の供給が100μmの周囲に制限されます。

現在の技術は、膵島の微小環境を再現する上での成果が限られています

生理学的および病態学的条件をモデル化するための鍵となる、膵島の本来の酸素とグルコースのダイナミクスを再現することは、精巧な流れを必要とし、膵島の機能の継続的な監視が不足している標準的な低酸素チャンバーでは達成困難です。さらに、I型糖尿病の移植療法は、孤立した膵島を低酸素症にさらします^pO ₂ (<2%, 5-15 mmHg) 生理学的膵臓 (5.6%, 40 mmHg) よりもはるかに低い移植後、膵島移植片は血行再建術に2週間以上かかります。低酸素曝露は、膵島のグルコース-インスリン結合メカニズムを損なうことが実証されています。刺激-分泌カップリング因子の中で、カルシウムシグナル伝達、ミトコンドリア電位、およびインスリン動態は、マイクロ流体工学を使用して簡単に監視できます。私たちの以前のマイクロ流体技術は、単一の島^5,6の周りの水性微小環境の正確な変調によるこのリアルタイムモニタリングを実証しました。しかし、膵島の低酸素障害の定量化は、同時刺激とモニタリング技術の欠如によって妨げられています。したがって、酸素のマイクロ流体制御と膵島のモニタリングを組み合わせることで、膵島の低酸素症の研究を改善することができます。

マイクロ流体工学は、水性および酸素の微小環境を再現および調節できます

組織および培養低酸素症研究の標準的な技術は、低酸素チャンバーに基づいています。一般に、低酸素チャンバーは、10~30分で平衡化時間で単一の酸素濃度を提供し、分単位の動的低酸素とは互換性がありません。最近の2つの研究では、マウス全体に対する断続的な低酸素曝露に小さなカスタムチャンバーが使用され、グルコース誘発性インスリン応答については矛盾する結果が得られました^7,8。動物全体のレベルでは、呼吸器系の制御により、呼吸された酸素は膵島毛細血管pO₂に直接変換されないことに注意してください。さらに、これらの研究には標準化された酸素レベルがなく、膵島の組織レベルでのリアルタイムの測定も提供されていません。

一方、酸素マイクロ流体工学は、ガスチャネルネットワークを介して酸素を制御することにより、これらの制限を超えることができます。さらに、マイクロ流体工学は、酸素変調中のライブイメージングに適合しており、これは現在、標準的な低酸素チャンバーでは不可能な偉業です。これらの新しいマイクロ流体アプローチの多くは、ポリジメチルシロキサンのガス透過性を利用して、酸素濃度をマイクロチャネルに溶解し、標的細胞^9-14上に媒体を流します。また、これらのデバイスには、複数の個別の酸素濃度、蛍光ベースの酸素センサー、さらには化学的酸素生成がオンチップで統合されています。

液体溶媒和ベースのマイクロ流体工学は、流れ条件に敏感な対流混合に依存するため、安定した連続的な勾配を維持するのに苦労しています。それに比べて、ここで使用する手法は、酸素供給の拡散経路を減らすことに焦点を当てています。ガス溶媒和とせん断流は、細胞または膵島組織を播種した膜全体に酸素を直接拡散させることによって排除されます。これにより、溶媒和を制御するために必要な余分なマイクロ流体工学が除去され、それ自体がインスリン放出を引き起こす可能性のある膵島への不必要なせん断応力が防止されます。このプラットフォームは、細胞培養^1,15において、高酸素と低酸素の両方の極端(2-97%O₂)で活性酸素種(ROS)のアップレギュレーションを実証するために使用されています。酸素の直接供給とせん断流の除去により、当社の拡散ベースのプラットフォームは、膵島低酸素症の研究に最適なマイクロ流体ソリューションを提供します。

マルチモーダルな刺激とモニタリング

拡散ベースのマイクロ流体工学は、膵島の微小生理学の研究に適応すると、追加の利点ももたらします。膜を拡散バリアとして使用することにより、液体を酸素調節から分離することができ、低酸素刺激とは独立して水系グルコース刺激を制御することができます。これにより、サンドイッチのような同時刺激が生まれ、空間的にピンポイントで島への配送が可能となります。さらに、ガスはコンピュータ化されたマイクロインジェクターを介して一時的に調整されるため、酸素濃度を21〜0%からデジタルで変調し、過渡時間は60秒未満です。顕微鏡での酸素およびグルコース微小環境の動的制御により、標準的な低酸素チャンバーでは不可能または非常に面倒なリアルタイムのマルチモーダルプロトコルが可能になります。このデバイスを使用して、カルシウムシグナル伝達 (Fura-AM)、ミトコンドリア電位 (Rhodamine 123)、およびインスリン動態 (ELISA) をモニターし、低酸素下での動的グルコース - インスリン応答の全体像を提供しました。

Protocol

1. マウス島の準備

1. C57BL/6マウスを解剖し、コラゲナーゼ消化とFicoll密度勾配分離により膵島を分離します。(^2,3で参照されているJOVEの記事を参照してください)。
2. 10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 20 mM HEPES をペトリ皿 (37 °C、5% CO₂) に含む RPMI-1640 培地で膵島をインキュベートします。分離後、実験で使用する前に24時間膵島を培養します。一貫した結果を確保するために、1〜2日以内に小島を使用してください。

2. マイクロ流体プラットフォームを作る

1. 各デバイス層の透明フォトマスク上に、1)入口と出口、2)ペリフュージョンチャンバー付きグルコースマイクロ流体層(直径8 mm x 3 mm、150 μl)、3)マイクロウェル付き200 μmメンブレン(直径500 μm、深さ100 μm)、4)ガスマイクロ流体層の微細構造形状を生成します。
2. 入口層と出口層を製造するには、脱気した予混合PDMSをブランクのペトリ皿に1.5mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。
3. グルコースマイクロ流体層を作製するには、SU8-2150の2つの350μm層を回転させて、4inシリコンウェーハ上に単一の700μm層を形成します。
   1. 適切なフォトマスクを介してUV光を露光し、開発後にSU8にマイクロチャネルパターンを転写し、高さ700μmのマスターを生成します。
   2. 脱気し、予混合したPDMSをこのマスターに3mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。このPDMSをカミソリの刃で形を整えます。
   3. 直径2mmの入出力ポートと直径8mmのチャンバーをパンチします。
4. マイクロウェルで200μmのメンブレンを作製するには、SU8-2100を100μmに回転させ、同じUVリソグラフィーを適用して、この高さ100μmのマスターにマイクロウェルパターンを転写します。
   1. このマスターにPDMSを900rpmで30秒間スピン脱気し、予混合し、80°Cで10分間硬化させます。同じ条件で最初の層の上に2番目の層を回転させ、マイクロウェルパターンを含む200μmのPDMSメンブレンを生成します。
   2. このメンブレンに直径2mmの入出力ポートをパンチします
5. ガスマイクロ流体層を作製するには、SU8-2100を100μmに回転させ、同じUVリソグラフィーを適用して、この高さ100μmのマスターにガスマイクロ流体パターンを転写します。
   1. 脱気し、予め混合したPDMSをこのマスターに1.5mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。
   2. このレイヤーに直径2mmの入出力ポートを打ち抜きます
6. 多層を接着するには、スコッチテープで洗浄し、コロナアークにさらした後、次の順序で手で位置合わせして準備します。
   1. マイクロウェルを上に向けて、メンブレンを下部のガス層に接着します。
   2. グルコースマイクロ流体をマイクロウェルメンブレンの上に接着します。
   3. 入口層と出口層を最上部に接着し、アセンブリ全体をカプセル化します。
   4. 1kgの重りを上に増やし、100°Cで3時間焼いて接着を補強します。
7. 完成したデバイスを水層に水を入れ、デバイス全体を水中に沈めてリークテストします。次に、空のシリンジでガス層に空気を流します。
8. 漏れのないデバイスを70%エタノールで水層を通して滅菌し、PBSバッファーでフラッシュし、デバイスを4°Cで保存して使用します。

3. マイクロディスペンサーのセットアップ

1. 2つのマイクロディスペンサー、5Vおよび20VのDC電源、および酸素混合と供給のセットアップを構築するためのデジタルI/Oボードを入手します。
   1. マイクロディスペンサーのコントロールリード線を付属のドライバーユニットに接続します。
   2. Labview制御器に対応するポートでドライバをデジタルI/Oボードに接続します。
   3. 5 Vおよび20 Vの電源をドライブユニットの対応する接点に接続します。
   4. デジタルI/Oをラップトップに接続して、ガス制御用のLabviewコードを実行します(付録)。
2. 1つのマイクロディスペンサーを窒素に接続し、もう1つのマイクロディスペンサーを圧縮空気に接続し、どちらも5%の_CO2で接続します。両方のガスを2psiに設定します。マイクロ流体デバイスに入る前に、ディスペンサーの出力をT字路につない
でください。
3. リークテスト済みのデバイスを使用して、マイクロディスペンサーを5〜21%の酸素間で循環させることにより、酸素変調の過渡応答を特徴付け、光ファイバー酸素センサーで水中の溶存酸素を測定します(機器リストと代表的な結果を参照)。

4. 顕微鏡でのセットアップ

1. デバイスを倒立顕微鏡の加熱ステージに取り付けます。
2. 0%および21%_O2ガスをデバイスに接続し、酸素センサーで校正します。
3. グルコースマイクロフルイディクスの出力ポートをフラクションコレクターに接続します。
4. Krebs Ringer 重炭酸塩緩衝液(KRB)を調製します:129 mM NaCl、5 mM NaHCO₃、4.7 mM KCl、1.2 mM KH₂PO₄、1 mM CaCl₂·2H₂O、1.2 mM MgSO₄·7H₂O、10 mM HEPES pH 7.35-7.40、2 mM 基礎グルコース、および5% FBS。
5. 37°Cの水浴に浸した50 mLのコニカルチューブに、それぞれ2 mMおよび14 mMのグルコースを含む2つの緩衝液を調製します。
6. ペリスタルティックポンプを接続して、250 μl/minのバッファーをチューブに吸引します。マイクロ流体デバイスに入る前に、37°Cのホットプレートにチューブを流します。
7. 膵島を染色するには、2 mLのKRBに100%エタノール中のFura-2 AMおよび100%エタノール中のRh123を添加して、それぞれ5 μMおよび2.5 μMの最終色素濃度に到達します。
8. 10 μLのピペットで膵島をピックアップし、37°Cで30分間色素にインキュベー
トします。
9. 約20個の膵島をグルコースマイクロチャネルインレットを介してデバイスにロードします。出口から入口にバッファーを呼び戻すことにより、膵島をチャンバーに向けます。
10. 膵島をバッファーで10分間灌流し、余分な色素を洗い流します。

5. 酸素とグルコースの同時刺激の実行

1. KRB2 によって確立された 5 分間のベースラインでグルコース刺激パルスを送達し、続いて 15 分間の 14 mM 刺激を行い、KRB2 で 15 分間洗浄します。
2. Fura-2の励起波長を340/380 nm、Rh123の発光波長を534 nmに記録
。
3. 各実験の前に、正常なパルス(14 mM normoxic)を測定します。
4. 酸素変調(低酸素/間欠性低酸素)の場合、対流障害を最小限に抑えるために、刺激および洗浄ステップ中にのみバッファーフローを適用し、他のステップではフローを適用しません。
5. グルコース出口から排出物を1分間隔で収集し、ELISAインスリンアッセイを行います。

Results

この膵島低酸素技術の中心となるのは、同じマイクロ流体チャンバー内で水相と気体相の刺激を微小スケールの過渡現象で変調する能力です。図1は、a)二重刺激とb)膵島腔内で測定された高速変調の代表的な結果です。フルオレセインをチャンバー内に導入することで示される水性変調は、3〜4分間の混合で平衡化を達成します。さらに、酸素は高速過渡現象で5〜21%までステップアップできるため、最短2分で酸素を循環させることができます。図2に示すように、さまざまなサイクリングの深さと周波数も達成できます。

このサイクルを適用して小島で断続的な低酸素状態を作り出すと、低酸素症に対する膵島をプレコンディショニングする利点を観察できます。これは、規則的な正常酸素パルスと比較して、図3aです。インスリン分泌のシグナル伝達メカニズムである細胞内カルシウムフラックスはリアルタイムでモニタリングされるため、カルシウム過渡現象のオーバーシュートと振動減衰に低酸素症とIHの影響を観察できます(図3b

Discussion

この膵島低酸素症技術に統合された複数のモダリティは、トラブルシューティングのためにここで言及されているいくつかのポイントを示しています。まず、単離された膵島は、腺房細胞からの消化酵素により、培養中で分解および崩壊し続けます。したがって、膵島分離後1〜2日で実験を標準化することは、一貫した結果を得るために重要です。第二に、層流と拡散の境界での対流クリアランスを防ぐために、低酸素症および断続的な低酸素症中に水流を停止しました。これにより、膵島のプレコンディショニングの期間が制限されるようです。将来的に水性チャネルにガス交換を統合することで、膜での迅速なガス変調を可能にしながら、この小さなクリアランスを排除できます。第三に、膵島にロードしている間、気泡が閉じ込められないように、水性チューブを逆の順序で慎重に再接続する必要があります (出口、入口)。最後に、将来のデバイスは、ファンアウトされたマイクロ流体ディストリビューターで拡張され、膵島のクラスターをチャンバー全体に分散させることができ、その底部にはトラッパーポケットの配列でパターン化できます。ポケットアレイに加えて、このマイクロ流体分布は、ハイスループット実験のための膵島の位置配列を作成す...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料
スピナー	ローレル	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
デジタルホットプレート	PMCデータプレート	722A
UV硬化ランプ	OmniCure	S1000
PMDS	ダウケミカル	シルガード184
コロナワンド	ETP	BD-20AC
チャンバーBel-Art	420220000
マイクロディスペンサー	The Lee Company	IKTX0322000A
5 Vおよび20 V DC電源	ラジオシャック
NI USB	ナショナルインスツルメンツ	NI USB-6501
温度計	Omega Engineering, Inc.
蠕動ポンプ	ギルソン	ミニパルス 2
酸素センサー	オーシャンオプティクス	NeoFox
フラクションコレクター	ギルソン	203
ピペット	フィッシャー サイエンティフィック	フィンピペット II 100μl
倒立落射蛍光顕微鏡	ライカ	DMI 4000B
50 ml コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック
Fura-2 蛍光色素	分子プローブ、ライフテクノロジー
ズ ローダミン 123 蛍光色素	分子プローブ、ライフテクノロジー
カルチャーメディア	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
グルコース	Sigma-Aldrich
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich
30 in シリコンチューブ	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		1/16インチおよび4mm
シリンジコネクタ	コールパーマー		メスルアープラグ 1/16インチ
ストレートコネクタ	コールパーマー1		/16インチ
ボーコネクタ	コールパーマー1		/16インチ