単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

Summary

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。

Abstract

私たちは、並行して複数の単一細胞における細胞内の生体分子の測定を可能とマイクロ流体デバイスを提供する。この目的のために、細胞を、受動的にマイクロチャンバーの中央に閉じ込められている。制御層の活性化の際に、細胞は、小さなチャンバ内の周囲の容積から隔離される。周囲の容積は、次いで、単離された細胞に影響を与えることなく交換することができる。しかしながら、チャンバの短い開閉時に、チャンバー内の溶液が数百ミリ秒以内に交換することができる。によるチャンバの可逆性のために、細胞は、インキュベーション、洗浄、そして最後に、細胞溶解のために、例えば、高度に制御可能な様式で異なる溶液を順次に露光することができる。密閉マイクロチャンバは、細胞溶解後の希釈を最小限にし、制御し、溶解物の保持を可能にする。溶解および分析は、同じ場所で発生しているため、高感度が、それ以上のDので保持されている分析物のilutionまたは損失は、輸送中に発生します。マイクロチャンバーの設計は、したがって、個々の細胞から放出され、細胞内の分子の非常に小さなコピー数（アトモル、ゼプトモル）の信頼性と再現性の分析を可能にします。さらに、多くのマイクロチャンバは、適切な光学機器を監視するために使用されることを考えると、一度に多くの細胞の分析を可能にするアレイ形式に配置することができる。我々はすでに、細胞内タンパク質、酵素、補因子および相対または絶対定量化可能な方法で、セカンドメッセンジャーを分析するための概念実証研究のためのプラットフォームを使用しています。

Introduction

過去の多くの研究は、特定のシグナル伝達プロセス^4、またはこのようなタンパク質は^、5,6、代謝産物、および補因子^7,8のような細胞内の生体分子の量で、大きな細胞集団^1-3内の細胞間の差異を明らかにした。これらの不均一性は、細胞適応と進化⁹根本的に重要であるが、また、例えば^10-13癌などの疾患の出現および治療 ​​に重要な役割を果たすと考えられている。したがって、単一細胞レベルでの研究は、これらの研究は、生物活性化学物質を用いた治療後の異なる細胞応答を明らかにする場合は特に、生物学的および薬理学的研究において高い関心が持たれている。

近年では、多くの分析プラットフォームは、単一の生細胞の分析または細胞内容物の化学組成を容易に開発されている。蛍光活性化細胞選別（FACS）がゴールドSTですがandard単一の生細胞の非常にハイスループット分析のために、この方法は、細胞内または分泌された化合物の定量に用いることができない。マイクロ流体プラットフォームの出現は、単セルの配置、治療および観察のための新規な分析的な戦略を約束した。マイクロ流体中のマイルストーンはクエイクや同僚^14,15によって実現フレキシブルなPDMSバルブの統合に達した。これらのバルブは、彼らは例えば、二つの文化^16を分離、チッ....

Protocol

1。 SU-8マスター作製

以下のプロトコルが異なるマスクパターンで（回路図や寸法は、図2を参照してください、流体および制御）チャネルの両方のマスター金型を準備します。プロセスは、 図3aに示されている。

1. 180℃で10分間、4インチのシリコンウェハを加熱することによって開始するスピンコーター上で脱水ウェハをロードし、スピンコート法、SU-8 2015年に次のプロトコルを使用します。
   1. （分注の後、このステップ、開閉蓋の間にSU-8を分配、スピンコーターのオープン蓋）20秒間100rpmでウエハを回転。
   2. 10秒500でスピンウエハ（これはウエハ全体上にレジストを広がっていく）。
   3. 30秒間、1,750 rpmでスピンウエハ（20ミクロンにレジストの高さを定義します）。
2. これがそうでない場合、次の手順でホットプレートに固執するようにアセトン（綿棒を使用）と、ウエハのエッジからレジストを除去。ああにウエハを搬送4分間95℃、熱でotplate。ソフトベーク後に、（365nmで測定された150ミリジュール/ cm ²で）UV光でマスクアライナにおいてソーダ石灰ガラスをテーピングするフォトマスクを介してレジストを露光する。
3. 露光後、ホットプレート上で95℃で5分間再度ウェ....

Results

当社のプラットフォームは、細胞内の様々なだけでなく、中に存在するか、単一の細胞によって産生され分泌される分子を分析することができます。ここで、我々は可能な様々なアッセイを強調するために、異なる例の研究を紹介したいと思います。我々は、分泌酵素（ 図5a）だけでなく、細胞内の酵素（ 図5b）とタンパク質（ 図5CおよびD）のための例を与える。このような補因子または小分子などのより多くの例については、Eyer ら （2012）およびEyer ら （2013）を参照してください。

まず、分泌された酵素（ 図5a）のためのアッセイを提供する。ホルボールミリステートアセテート（PMA）による活性化の際に、ヒト単球、リゾチーム分泌、細菌の細胞溶解を誘導する酵素を誘導する。このアッセイのために、セルバッファは、4 - メチルβ-D-N、N'-diacetylchitobioside、lysoz.......

Discussion

マイクロフルイディクス技術は、単一細胞分析のための新しい魅力的な可能性を開いた。具体的には、トラップする可能性と、マイクロ流体ツールで個別に細胞を固定は、単一セルのプロパティと対応に関する体系的な短期的および長期的な研究を可能にした。また、マイクロチップ上に発生した高周波微小液滴、中の細胞のカプセル化は、従来のフローサイトメトリー装置を用いて実施することができない単一の細胞分泌の研究を可能にした。インキュベーションおよび洗浄工程が分析プロトコルに必要とされるときに微小液滴のアプローチは、しかしながら、いくつかの制限がある。我々のアプローチは、細胞捕捉および分離の両方の概念を結合し、したがって、それは、表面固定化抗体に基づく免疫アッセイを含む、より複雑なアッセイを実施することが容易になる。さらに、この方法は、アプリケーションとターゲット分析物に対して非常に柔軟である。

マイクロチップのデザインは、（i）効率を可能にする効率の良い細胞捕捉、種々の緩衝液および試薬の（II）の供給、そして非常に少量（III）信頼性の高いアイソレーションが必要です。このようにして、標的分子の希釈が回避される.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬:
試薬	会社名	カタログ番号	コメント (オプション)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)
	ABCR (カールスルーエ, ドイツ)	AB103608
4-メチルウンベリフェリル β-D-N,N′-ジアセチルキトビオシド水和物	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (ダルムシュタット、ドイツ)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (ヴィースバーデン、ドイツ)	n.a.AZ
726 developer	AZ Electronic Materials (ヴィースバーデン、ドイツ)	n.a.
ウシ血清アルブミン	Sigma Aldrich	A-4503
ウシ血清アルブミン、ビオチン	Sigma Aldrich	A-8549
細胞解離バッファー	Invitrogen	13151-014
ヘキサメチルジシラザン (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
塩酸	フルーカ	84422
イソプロパノール	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Düベンドルフ、スイス)	n.a.PLL-g-PEG
グラフトビオチン	SuSoS、(Düベンドルフ、スイス)	n.a.
塩化カリウム	Fluka	60132
プロテインG、ビオチン	Sigma Fine Chemicals	41624
シリコンウェーハ	Si-Mat (Kaufering、ドイツ)	n.a.Sylgard
184 シリコーンエラストマーキット (PDMS)	ダウコーニング	39100000
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメサン	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	会社	カタログ番号	コメント (オプション)
0.22 µm PESシリンジ	フィルターTRP	99722
1 / 1.5 mm生検パンチャー	ミルテックス、ヨークPA	33-31AA / 33-31A
セルトリクスフィルター20&マイクロ;m	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.MA-6
mask aligner	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
プラズマクリーナー PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.Step
profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
シリンジポンプ neMESYS	Cetoni	n.a.