コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

サマリー

多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。

要約

パッチクランプ技術は、個々のニューロンまたはそれらの細胞内区画からの電気的活動を記録するための最もよく確立された方法今日。それにもかかわらず、安定した記録を実現し、さらには個々の細胞から、かなりの複雑さの時間のかかる手順のままである。効率的な情報の表示に関連して多くのステップの自動化が大幅に高い信頼性で録音のより多くを実行する際にし、短い時間で実験研究を支援することができます。大規模な記録を達成するために、我々は、最も効率的なアプローチは、プロセスを完全に自動化することなく、効率的に実験者の経験と視覚的なフィードバックを取り入れながら実験工程を簡素化し、ヒューマンエラーの可能性を低減することはないと結論付けた。念頭に置いてこれらの目標によって私達は、commercを単一のインターフェースでの多電極パッチクランプ実験のために必要なすべてのコントロールを集中コンピュータ支援システムを開発コンピュータの画面上での実験に関連する情報や指導の手がかりを表示しながら、ially利用可能なワイヤレスゲームパッド。ここでは、私たちは、記録設定を達成するために必要な時間を短縮し、実質的に正常に同時に多数のニューロンを記録する機会を増加させ、システムの異なる構成要素を記載している。

概要

マイクロメートルの精度で複数のサイトを記録し、刺激する能力は、実験的にニューロン系のより良い理解を達成するために極めて有用である。多くの技術がこの目的のために開発されてきたが、いずれも閾値下の活性および個々のシナプス後電位を研究するための必須のパッチクランプ技術によって達成さsubmillivolt分解能を、許可しない。ここでは、同時に記録し、神経の接続性の研究のために十分な精度で個々の細胞の大多数を刺激することを目的とした十二極コンピュータ支援パッチクランプシステムの開発を覆う。多くの他の用途は、このようなシステムのために考えられるが、ニューロンのグループ内の可能な接続の数は、問題のニューロンの数の二乗に比例して成長することを考えるとシナプス接続の研究に特によく適している。したがって、三つの電極を備えたシステムは、テストを可能にしながら、最大6つの接続が発生すると、ほとんどの場合、12ニューロンを記録し、単一の1を記録するには、最大132の接続が発生することをテストして、頻繁にします（ 図1）1ダース以上を観測することができます。接続の数十の観察は、同時に小規模ネットワークの構成を分析し、そうでなければ¹をプローブすることができないネットワーク構造の統計的特性を推測することができる。また、数々の細胞の正確な刺激はまたシナプス後細胞²の募集の定量化を可能にする。

プロトコル

1。機器の準備

1. コンピュータからの制御マニピュレータ
   1. シリアルポート（RS-232）を介してコンピュータに各マイクロマニピュレータコントローラボックスを接続します。
   2. クエリを実行し、シリアルポートを経由して送信されるように設定を調整、位置決めのためのコマンドを実装。指定された速度とハードウェアの互換性の問題は、C / C + +は、プログラミング言語としてお勧めします。
   3. ゼロモーターと正の移動はモーターから離れて向けられているに関して最も近い位置になるようにマニピュレータの基準システムを標準化。
   4. 2ミリメートルの試料焦点面（座標[0、0、2000]）上記の中央位置に顕微鏡を配置します。
   5. 各マニピュレータのため、ピペットの先端を顕微鏡の視野の中心に観察できるようにローカル座標を格納する。これは、各電極の初期の基準点である。
2. 映像設備リゼ電極位置。これは、実験中に各電極の位置を追跡することができることが非常に便利です。グラフィカルな表現は、これを達成する最も直感的な方法である。そのために、参照、各電極のシステムや顕微鏡のそれを一致させる必要があります。これを実現するための簡単​​な方法は、次のとおりです。
   1. 視野の中心に電極の先端を持参してください。
   2. マニピュレータの各軸上の位置や顕微鏡の各軸に保管してください。
   3. マニピュレータ比較的大きな動き（1ミリメートル）のx軸で実行されます。
   4. もう一度だけ顕微鏡を移動先の位置を確認します。
   5. それが最後に測定されて以来、顕微鏡位置の違いを計算します。これらは、顕微鏡の軸上に電極軸の動きの投影である。
   6. Y電極マニピュレータのZ軸用2.5 - を繰り返して2.3を繰り返します。これは、顕微鏡上に凸のマトリックスが<（決定することが可能と軸強い>図2）また、余弦行列と呼ば：
      
   7. 顕微鏡の座標系における所定の位置に到達するための電極マニピュレータによって必要な3つの次元で、動きを計算することを可能にするために、この行列を反転する。
      
   8. 最初の基準点を使用し、余弦マトリックスは、顕微鏡座標で各電極の位置を決定する。
   9. 顕微鏡座標に基づいてグラフィック表示、定期的に各電極の位置。我々は、電極位置ごとに40ミリを描画するために、C / C + +の描画ライブラリ（GDI +）を使用することにしました。
   10. 1.2.7数ミリメートルの位置変更が必要な場合には、マニピュレータ角度が変更されたりするたびに、例えば、電極の種類が変更された場合 - 繰り返し1.2.1を繰り返す。
3. positioを格納可能にするそのような細胞または解剖学的基準点として、組織内の関連する特徴のナノは、顕微鏡座標。
4. ビデオを取得し、関連情報をオーバーレイする。
   1. 機械的に顕微鏡カメラの水平軸と顕微鏡の運動のx軸の位置を合わせます。
   2. コンピュータ上でライブビデオオーバーレイ機能とソフトウェア開発キット（SDK）にフレームグラバをインストールします。
   3. SDKでのライブ映像表示動作を実装します。
   4. 顕微鏡は適切な翻訳とスケーリングすることで、カメラ基準系に座標系を変換します。
   5. 約40ミリ秒（ 図3）の一定の間隔で、ライブビデオ、得られる画像上でカメラ座標とオーバーレイに関連する特徴を描く。
5. コントロールアンプ。
   1. インターフェイスからアンプの設定を制御するために、アンプのソフトウェアを使用してください。
6. COオシロスコープntrol。
   1. シリアルポートを使用してPCにオシロスコープを接続します。
   2. 電圧クランプにおけるパッチクランプ法の異なるステップのためのオシロスコープのスケール、カップリングと時間分解能を決定する（ 例えば電極風呂、シール形成、細胞全体の構成）と電流クランプ。
   3. アンプコマンドは、インターフェイスから発行されるたびに、適切なオシロスコープの設定コマンドを送信します。
7. 制御ピペット圧力。
   1. 図4に記載の圧力制御システムを組み立てる。
      1. 適切に各電子部品を供給するために12 V / 5 Vの電源を使用してください。
      2. 正圧バッファー（100ミリリットル容器）に1膜ポンプの出力を接続します。
      3. 負圧バッファー（100ミリリットル容器）に1膜ポンプの入力を接続します。
      4. pressuの圧力センサにピペットホルダチューブを接続する制御システムは、主圧力室に接続する空気圧弁を再。
      5. 主圧力室に接続されたバルブに圧力バッファのそれぞれを接続します。
      6. 主圧力室と大気との間の弁を接続してください。
      7. 主圧力室に圧力センサを接続します。
      8. 各バッファに圧力センサを接続します。
      9. データ収集ボードに圧力制御システムを接続します。
      10. 1アナログ入力にそれぞれ圧力センサを接続します。
      11. デジタル出力に各バルブを接続します。
   2. 膜ポンプに接続しているものを除くすべてのバルブを開き、測定された圧力を引くことによって、全てのセンサからのオフセット、大気圧を削除します。
   3. 圧力制御を実施
      1. インターフェイスの各ピペット用正圧コントロールを有効にするか非アクティブにするためのコントロールを定義します。
      2. ピペットのための最小限の正圧を定義する約70ミリバールのS。
      3. アクティブな圧力制御の下でピペット内の圧力が設定されたしきい値を下回ったときはいつでも、定期的（0.5秒おき）が検出。
      4. しきい値超過時にピペット内の圧力が閾値を超えるまで短時間（20秒）の間、問題になっているピペットに向けた主圧力室と、このコンパートメントに正の圧力バッファを開く。他のすべてのバルブを閉じてください。
      5. 目的の細胞に向けた最終的なアプローチが開始されるように、さらに圧力制御を非アクティブに。
   4. シール形成のための負圧を適用する
      1. すべてのバルブを閉じて、実験者が押したボタンを保つことによって必要とする間、問題になっているピペットに向けた主圧力室と、この区画に向かって負圧バッファバルブを開きます。
8. ヒューマンインターフェイスデバイスにコマンドを一元化。
   1. 市販のwireleを接続PCへのSSのゲームパッド。
   2. ジョイスティックの状態の読み出しを実現する。例えば、読み出しごとに5ミリ秒を実行するために、C / C + +用のDirectXのライブラリを使用しています。
   3. ボタンは、最後のタイムステップ以降、押された放出されたか、押し続けるされているを検出するために、以前の状態と現在の状態を比較してください。
   4. ゲームパッドの各ボタンに機能を割り当てる。このマッピングの一例が図5に示されている。

2。パッチクランプ手順

1. 関心領域の脳スライスを準備します。
2. 顕微鏡の変位範囲の中央の関心領域で、関心のある脳のスライスを配置します。
3. 細胞選択
   1. 顕微鏡で閲覧することで目的の細胞を識別します。目的の細胞の上にライブビデオディスプレイ上でマウスの右クリックで座標系を顕微鏡に基づいてセルの位置を格納します。
   グラフィカルインターフェイスは、選択したセルを表示しますだけでなく、世界的な概要と、ソフトウェアのためのマイクロピペットは、画像上にオーバーレイされるセルの位置にマーカーを追加します。さらに細胞の画像をファイルに将来の参照のために捕獲されている「セル＃。JPG」。

ピペットに対する細胞の帰属

1. 目的の細胞を選択した後、各セルを記録しているピペット割り当てる。グラフィカルインターフェイスを設定する必要があり、割り当てのコントロールが用意されています。チェックボックス「最終位置を表示」を選択することで、最終的な設定のプレビューを視覚化する。
2. 最終的な位置のプレビューが望まれる各ピペットを選択するか、「すべて選択」チェックボックスをオンにします。必要に応じて、より良い視覚化のために現在位置表示を無効にします。

ピペットを準備します

1. （ - 多くのピペットが使用されている場合、8MΩのが最善である6）はウィスコンシンピペットを埋める細胞内液番目とその所有者にロードします。彼らの凝視にヘッドステージを置きますが、ピペットチップと一緒にお風呂に触れないようにするために前方にスライドさせないでください。
2. ヒントはきれいに残っていることを保証するために、正の圧力制御を有効にし、すべてのピペットを選択します。静かに所定の位置にそれぞれのヘッドステージにスライドさせます。

ピペットチップを配置する

1. 3ミリメートル「A」ボタンを押しながらボタンR2を押してスライス上を中心とした中央の位置に顕微鏡を配置します。ボタンAを押しながらボタンL2を押して、前の実験から保存されている各マニピュレータのための対応する位置を使用
   注意：ほとんどの場合、それを観察するのに十分でなければならないこの時点でビュー内のピペットの特徴的な影やピペットの軸に沿った小さな動きのどちらかがあるはずです。ピペット形状のわずかな違いのための補償を手動で実行する必要があります。
2. 焦点にピペットチップを持って来る。 （それはまだ[2000、0、0]の位置にする必要があります）顕微鏡を移動することなく、ビデオ表示の赤い中央点で先端を置きます。
3. 以下は、いずれかのボタンAを保持しつつボタンL1を押して配置することができるように、後方にそのピペットを送信し、ピペットは、各ピペットチップが配置された後、ボタンCを保持しつつボタンZを押して表示の中心にあるソ​​フトウェアに通知する

細胞へのアプローチ

1. すべてのピペットチップを正確に配置され、それぞれのピペットがセルに帰属されると、自動的にそれぞれの細胞に近いピペットを配置。単に細胞群の中心に右クリックし、ポップアップメニューのオプション「クラスター」を選択します。表示され、このときの位置するすべてのピペットを選択し、「すべてのチェックをピペットで行く」をクリックするクラスタオプションウィンドウで。目的の細胞を各クラスタに対してこの操作を繰り返します。
2. ペー手動で、最終的なアプローチをrform。細胞に比べてピペットの位置が異なって指定されたが、通常200ミクロン離れてピペットの軸における細胞·組織外のピペットの先端部を維持するのに十分であり、垂直方向のその上の200ミクロンから単純にすることができます。ピペットの位置決めが終了するまで待ってから、ボタンCを押しながら、ボタン、R1を押すことにより、ピペットの方に顕微鏡を移動
3. ビデオ·ディスプレイの任意の場所で、その先端に顕微鏡の焦点を合わせると、ボタンCを正方格子を押しながらBボタンを押すと、各ピペットの位置を再調整することは簡単にピペットの識別された位置を示す表示されます。位置が正しくない場合は、ボタンCを押しながら、中央のビデオ·ディスプレイのドットと押しボタンZ上のチップを配置

セル接続構成を確立

1. 現在のピペットのための目的の細胞が正常になっていることを確認マークされた。そうでない場合は、中央の赤い点を目的の細胞に一致するように顕微鏡を移動します。マーク·ピペット離れて、割り当てられたセルから200程度を配置するボタンCを押しながらボタンでボタンを押し、L2を押しながらボタンYを押して、細胞を顕微鏡で自動的に対応する位置まで移動します。
2. それは赤い点に一致するようにピペットの位置を調整します。ボタンXを押しながらボタン、R1を押して、オフセットピペットを調整
3. ゆっくりと帰属のセルに、ピペットにアプローチボタンXを押しながらボタンL1を押して、テストパルスをアクティブにします。
4. 細胞膜の表面にディンプルの形成を観察する際に加わる圧力は、細胞に到達できるようにするには、ボタンを押しながらZ Yボタンを押すことによって、負圧の短いパルスを印加する。会社概要 - 65mVの保持電位は、ボタンXを押しながらボタンL2を押すと、この時点で確立されなければならない

全細胞構成

1. ギガシールは、セル毎に形成されると、負圧を適用することによって、膜を破裂開始。

録音を行う

1. 録音を行うために刺激/収集システムを使用してください。一度に1個々のセル上のパルスのパルスや電車を適用し、記録されたセル間の接続性をマップするために、残りの細胞に応答を観察します。

ピペットを後退

1. 記録が終了したら、表のラジオボタンを右クリックして、組織からゆっくりとピペットを後退。ピペットは、その軸に沿って短い距離を後退持つように '後退 - >ピペット500程度」を選択します。 （いくつかの肯定的な圧力を加えることによってヒントをクリア助けるかもしれない）細胞の電位のドリフトを観察します。
2. すべての帰りピペットを後退する、「速い」に位置決め速度を設定し、同じ操作を繰り返しますが、「すべて」オプションを選択します。使用を削除静かにヘッドステージをスライドさせてホルダーからピペットを回して外すとピペット。これは大幅にピペットチップ位置に干渉する可能性があるため、ソケットにホルダーをねじれを避けるために役立ちます。

結果

上記の方法に従って、我々はほぼ同時に神経細胞の数が最も多いパッチクランプ、これまでに倍増、同時に最大12のニューロンの細胞全体の記録を行うことに成功しました。ラットの体性感覚皮質のV層に記録された錐体細胞間の直接的なシナプス結合のネットワークの例を図6に示す。

所与の細胞型のための体間の距離の関数として接続確率プロファイルの決定は、多電極パッチクランプシステム¹を効率よく行うことができる関心対象の代表的な測定値である。最近、光刺激は、データ^3,4を取得する、より効率的な手段として表示されるようになった。しかしながら、重要なことには、多電極パッチクランプシステムで取得されたデータは、実験者がイントラでより完全に検討中のネットワークのマッピングと同様に、高解像度の染色を得ることを可能にする携帯拡散染料。多電極パッチクランプ実験においてすべてのセルは、多くの場合、光刺激又はカルシウムイメージングなどの他の技術には当てはまらないもの、記録し、刺激することができる。この機能は、実験者がそのような他の方法で測定するこ...

ディスカッション

即時の質問は、通常我々が説明した手順の成功率に関する生じる。高い成功率のための準備が不可欠です。ピペットは、記録された細胞の人間のために適切である先端開口部を持っている必要があります。詰まっピペットを避けるために、細胞内液をろ過することも重要です。非常にきれいで、新鮮に引っ張っピペットは別の要件である。二項分布は、これらの問題は、最終的な収量にどのように影響するかを理解するために使用することができる最も簡単なモデルである。これは、視覚的なフィードバックを個々のニューロンを記録する80％以上の成功率を達成するために経験と適切な機器で実験を期待することは合理的である。初心者の重要な準備手順が見落とされている場合は特に、非常に低い成功率を達成することが期待できる。これらのレートは、実験ごとに記録された細胞の数に変換する方法を図10に見ることができる。同時にパッチアサリの数はさらに増加PEDニューロンはおそらくマニピュレータの小型化、ひいては細部にかなりの注意を必要とする手続きの信頼性の向上が必要ですが、完全に実現可能であるでしょう。

ここで提示システムの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
顕微鏡	オリンパス	BX51WI	40X 液浸 対物レンズ
マニピュレーター	ルイグス・ノイマン	SM-5	シリアルプロトコル 使用
アンプ Axon	Instruments	MultiClamp 700B	SDK 使用
カメラ	Till Photonics	VS 55	BNC アナログ出力
フレームグラバー	データ変換	DT3120	SDK 使用
オシロスコープ	Tektronix	TDS 2014	シリアル通信
データ収集	InstruTECH	ITC 1600
データ収集	National Instruments	PCI-6221	ライブラリ 使用 (.dll)
圧力バルブ	SMC	SMC070C-6BG-32
圧力センサ	Honeywell	24PCDFA6G
メンブレンポンプ	Schego	Optimal