コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

Summary

多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。

Abstract

パッチクランプ技術は、個々のニューロンまたはそれらの細胞内区画からの電気的活動を記録するための最もよく確立された方法今日。それにもかかわらず、安定した記録を実現し、さらには個々の細胞から、かなりの複雑さの時間のかかる手順のままである。効率的な情報の表示に関連して多くのステップの自動化が大幅に高い信頼性で録音のより多くを実行する際にし、短い時間で実験研究を支援することができます。大規模な記録を達成するために、我々は、最も効率的なアプローチは、プロセスを完全に自動化することなく、効率的に実験者の経験と視覚的なフィードバックを取り入れながら実験工程を簡素化し、ヒューマンエラーの可能性を低減することはないと結論付けた。念頭に置いてこれらの目標によって私達は、commercを単一のインターフェースでの多電極パッチクランプ実験のために必要なすべてのコントロールを集中コンピュータ支援システムを開発コンピュータの画面上での実験に関連する情報や指導の手がかりを表示しながら、ially利用可能なワイヤレスゲームパッド。ここでは、私たちは、記録設定を達成するために必要な時間を短縮し、実質的に正常に同時に多数のニューロンを記録する機会を増加させ、システムの異なる構成要素を記載している。

Introduction

マイクロメートルの精度で複数のサイトを記録し、刺激する能力は、実験的にニューロン系のより良い理解を達成するために極めて有用である。多くの技術がこの目的のために開発されてきたが、いずれも閾値下の活性および個々のシナプス後電位を研究するための必須のパッチクランプ技術によって達成さsubmillivolt分解能を、許可しない。ここでは、同時に記録し、神経の接続性の研究のために十分な精度で個々の細胞の大多数を刺激することを目的とした十二極コンピュータ支援パッチクランプシステムの開発を覆う。多くの他の用途は、このようなシステムのために考えられるが、ニューロンのグループ内の可能な接続の数は、問題のニューロンの数の二乗に比例して成長することを考えるとシナプス接続の研究に特によく適している。したがって、三つの電極を備えたシステムは、テストを可能にしながら、最大6つの接続が発生すると、ほとんどの場合、12ニューロンを記録し、単一の1を記録するには、最大132の接続が発生することをテストして、頻繁にします（ 図1）1ダース以上を観測することができます。接続の数十の観察は、同時に小規模ネットワークの構成を分析し、そうでなければ¹をプローブすることができないネットワーク構造の統計的特性を推測することができる。また、数々の細胞の正確な刺激はまたシナプス後細胞²の募集の定量化を可能にする。

....

Protocol

1。機器の準備

1. コンピュータからの制御マニピュレータ
   1. シリアルポート（RS-232）を介してコンピュータに各マイクロマニピュレータコントローラボックスを接続します。
   2. クエリを実行し、シリアルポートを経由して送信されるように設定を調整、位置決めのためのコマンドを実装。指定された速度とハードウェアの互換性の問題は、C / C + +は、プログラミング言語としてお勧めします。
   3. ゼロモーターと正の移動はモーターから離れて向けられているに関して最も近い位置になるようにマニピュレータの基準システムを標準化。
   4. 2ミリメートルの試料焦点面（座標[0、0、2000]）上記の中央位置に顕微鏡を配置します。
   5. 各マニピュレータのため、ピペットの先端を顕微鏡の視野の中心に観察できるようにローカル座標を格納する。これは、各電極の初期の基準点である。
2. 映像設備リゼ電極位置。これは、実験中に各電極の位置を追跡することができることが非常に便利です。グラフィカルな表現は、これを達成する最も直感的な方法である。そのために、参照、各電極のシステムや顕微鏡のそれを一致させる必要があります。これを実現するための簡単​​な方法は、次のとおりです。
   1. 視野の中心に電極の先端を持参してください。
   2. マニピュレータの各軸上の位置や顕微鏡....

Results

上記の方法に従って、我々はほぼ同時に神経細胞の数が最も多いパッチクランプ、これまでに倍増、同時に最大12のニューロンの細胞全体の記録を行うことに成功しました。ラットの体性感覚皮質のV層に記録された錐体細胞間の直接的なシナプス結合のネットワークの例を図6に示す。

所与の細胞型のための体間の距離の関数として接続確率プロファイルの決定は、多電極パッチクランプシステム¹を効率よく行うことができる関心対象の代表的な測定値である。最近、光刺激は、データ^3,4を取得する、より効率的な手段として表示されるようになった。しかしながら、重要なことには、多電極パッチクランプシステムで取得されたデータは、実験者がイントラでより完全に検討中のネットワークのマッピングと同様に、高解像度の染色を得ることを可能にする携帯拡散染料。多電極パッチクランプ実験においてすべてのセルは、多くの場合、光刺激又はカルシウムイメージングなどの他の技術には当てはまらないもの、記録し、刺激することができる。この機能は、実験者がそのような他の方法で測定するこ.......

Discussion

即時の質問は、通常我々が説明した手順の成功率に関する生じる。高い成功率のための準備が不可欠です。ピペットは、記録された細胞の人間のために適切である先端開口部を持っている必要があります。詰まっピペットを避けるために、細胞内液をろ過することも重要です。非常にきれいで、新鮮に引っ張っピペットは別の要件である。二項分布は、これらの問題は、最終的な収量にどのように影響するかを理解するために使用することができる最も簡単なモデルである。これは、視覚的なフィードバックを個々のニューロンを記録する80％以上の成功率を達成するために経験と適切な機器で実験を期待することは合理的である。初心者の重要な準備手順が見落とされている場合は特に、非常に低い成功率を達成することが期待できる。これらのレートは、実験ごとに記録された細胞の数に変換する方法を図10に見ることができる。同時にパッチアサリの数はさらに増加PEDニューロンはおそらくマニピュレータの小型化、ひいては細部にかなりの注意を必要とする手続きの信頼性の向上が必要ですが、完全に実現可能であるでしょう。

ここで提示システムの.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
顕微鏡	オリンパス	BX51WI	40X 液浸 対物レンズ
マニピュレーター	ルイグス・ノイマン	SM-5	シリアルプロトコル 使用
アンプ Axon	Instruments	MultiClamp 700B	SDK 使用
カメラ	Till Photonics	VS 55	BNC アナログ出力
フレームグラバー	データ変換	DT3120	SDK 使用
オシロスコープ	Tektronix	TDS 2014	シリアル通信
データ収集	InstruTECH	ITC 1600
データ収集	National Instruments	PCI-6221	ライブラリ 使用 (.dll)
圧力バルブ	SMC	SMC070C-6BG-32
圧力センサ	Honeywell	24PCDFA6G
メンブレンポンプ	Schego	Optimal