シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

Summary

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。

Abstract

単一細胞レベルでの遺伝子発現の定量化は、集団レベルで実行される測定に不明瞭新規調節機構をが明らかになりました。二つの方法に基づいて、顕微鏡およびフローサイトメトリーは、このようなデータを取得することができる方法を示すために提示される。酵母における高浸透圧グリセロールMAPK経路の活性化の際に誘導される蛍光レポーターの発現は、例として使用される。各方法の具体的な利点が強調表示されます。フローサイトメトリーは、細胞（10,000）を多数測定し、蛍光タンパク質の成熟遅い速度の独立したタンパク質発現の動力学を直接測定を提供する。顕微鏡による生細胞のイメージングは​​、少数の細胞におけるレポーターの成熟した形での測定に限定された対照的である。しかし、この技術によって生成されたデータ·セットは、複数のレポーターの組合せ及び空間的及び時間的情報のおかげで非常に豊富であることができる個々の細胞から得られた。これら二つの測定法の組み合わせはシグナル伝達経路によってタンパク質発現の調節に関する新たな洞察を提供することができます。

Introduction

伝達カスケードを介したシグナル伝達は、多くの場合、タンパク質の発現で絶頂に達する。この発現プロファイルの特徴付けは、生物学的経路の機能を理解する上で重要な要素です。アップレギュレートされたタンパク質およびその活性化の動態のスペクトルの同定は、例えば、マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはウェスタンブロット^1-3のような様々な技術によって達成することができる。しかしながら、これらの技術は、細胞の集団全体の応答を平均化する。タンパク質の発現の微調節を理解するためには、単一細胞レベルでの測定値を収集することが望ましい。理想的には、これらの測定は、根本的な経路の数学モデルを開発するために適し定量的データを提供すべきである。

顕微鏡およびフローサイトメトリー、理想的な定量的な単一細胞の測定値を提供するのに適している二つの技術、である。蛍光タンパク質とタンパク質の内因性のタグ付けはできるBeは、それらの発現レベル^4を定量するために使用。タンパク質の末端における大きな蛍光部分の付加は、それを非機能的にすることができるので、それは、蛍光構築物の発現を駆動するプロモーターに基づいて、特定の発現レポーターを生成するために、多くの場合望ましい。このレポータータンパク質は、セルラーシステムに対して外因性であるため、セルに行われているシグナル伝達事象に影響を与えることはない。

顕微鏡法およびフローサイト....

Protocol

1。顕微鏡測定

1. 酵母で合成培地5mlに植菌。
2. 30℃で一晩細胞を成長させる。
3. 翌朝一晩培養物のOD _600を測定します。
4. ₆₀₀ 0.05にOD 5ミリリットル合成培地中で一晩培養を希釈します。
5. 少なくとも4時間、30℃で希釈した培養を育てる。
6. 合成培地に集中して3倍（0.6 M）のNaCl溶液を調製する。
7. PBSにコンカナバリンA（ConAを）の1 mg / mLの溶液を調製する。
8. ろ液〜ウェルスライドにConAを溶液200μl。
9. 30分間放置してみましょう。
10. のConA溶液を除去。
11. ウェルに150μlのH ₂ Oを追加します。
12. H ₂ Oを削除
13. 細胞培養のOD _600を測定します。
14. 1.5ミリリットルマイクロチューブに= 0.02 OD ₆₀₀で細胞培養液300μlを準備します。
15. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
16. 渦簡単にマイルcrotube。
17. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
18. 簡単に渦マイクロチューブ。
19. ウェルに、細胞培養液20....

Results

顕微鏡検査

発現レポーターSTL1のp-QV（ySP9 ^7）を有する酵母細胞は、ウェルスライドの底部に取り付けられ、顕微鏡下に置いた。細胞は、撮像セッションの過程の間に直接ウェルに応力媒体を添加することにより刺激した。これは、私たちは、経路誘導前の細胞のいくつかの画像を取得し、刺激後、彼らの運命をたどることができます。この場合、細胞を10分間の時間間隔で〜2時間追跡した。 図1Aは、誘導前に、非蛍光細胞の画像であり、発現レポーターを有する場合、図1Bは、ストレス後の同じ細胞を2時間を表示する誘導されて、蛍光となっています。

これらの画像中に存在する定量的な情報を抽出するために、複雑な画像解析処理が実行されなければならない。それは私のオブジェクトを定義するために、細胞のセグメンテーションが含まれていMAGE、あるフレームから次のフレームへのこれらのオブジェクトの追跡と、これらのオブジェクト（形状や強度特性）の特徴の採寸です。我々は.......

Discussion

顕微鏡検査

ConAを持つウェルの治療は、細胞の適切な画像化を確保するための重要なステップです。のConAをPBS（5 mg / ml）を、低溶解性を有するため、濾過工程は、フィルタリングされていない溶液中に存在し、撮像を妨害する大きな凝集物を除去することができる。細胞が処理された表面に比較的強く付着し、誘導溶液の添加は、刺激の前と後の継続的な追跡を可能にし、細胞の局在を乱すべきではありません。細胞は一定流量^7,15に供されたこの処置はまた、チャネルまたは微小流体デバイスを流すために適用することができる。ウェルを適切に処理した後に水でリンスされていない場合、細胞は、溶液中のConAを細胞に直接結合し、ガラス表面に強い結合を形成することを妨げるためと考え、ガラスに適切に付着しない。洗浄工程の後、ウェルを3ドライ残ることができる -著しくガラスへの細胞の結合に影響を与えることなく、細胞の添加の前に4時間。

蛍光チャネルのための露光時間の選択は、実験の成功のための重要な設定である。細胞の蛍光が経時にわたって増加するの.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
酵母 窒素ベース	ForMedium	CYN6202
CSM アミノ酸ミックス	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
シクロヘキシミド	フルカ アルドリッチ Σ	C7698	有毒
ySP9			W303Mataleu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
顕微鏡制御ソフトウェア	Micro-manager	Ver 1.4.11
インキュベーションチャンバー	LIS	The Box
蛍光ライト出典	:Lumencor	SpectraX
カメラ	浜松	、フラッシュ、4.0
フローサイトメーター	BD	FACS、calibur
Sonicator、バス	テレソニック	、TUC-150
8ウェルスライド	、Thermo Lab-tek	155409
96ウェルプレート、	マトリックスバイオサイエンス	、MGB096-1-2-LG
FACSチューブ	BDファルコン	352054