シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

サマリー

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。

要約

単一細胞レベルでの遺伝子発現の定量化は、集団レベルで実行される測定に不明瞭新規調節機構をが明らかになりました。二つの方法に基づいて、顕微鏡およびフローサイトメトリーは、このようなデータを取得することができる方法を示すために提示される。酵母における高浸透圧グリセロールMAPK経路の活性化の際に誘導される蛍光レポーターの発現は、例として使用される。各方法の具体的な利点が強調表示されます。フローサイトメトリーは、細胞（10,000）を多数測定し、蛍光タンパク質の成熟遅い速度の独立したタンパク質発現の動力学を直接測定を提供する。顕微鏡による生細胞のイメージングは​​、少数の細胞におけるレポーターの成熟した形での測定に限定された対照的である。しかし、この技術によって生成されたデータ·セットは、複数のレポーターの組合せ及び空間的及び時間的情報のおかげで非常に豊富であることができる個々の細胞から得られた。これら二つの測定法の組み合わせはシグナル伝達経路によってタンパク質発現の調節に関する新たな洞察を提供することができます。

概要

伝達カスケードを介したシグナル伝達は、多くの場合、タンパク質の発現で絶頂に達する。この発現プロファイルの特徴付けは、生物学的経路の機能を理解する上で重要な要素です。アップレギュレートされたタンパク質およびその活性化の動態のスペクトルの同定は、例えば、マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはウェスタンブロット^1-3のような様々な技術によって達成することができる。しかしながら、これらの技術は、細胞の集団全体の応答を平均化する。タンパク質の発現の微調節を理解するためには、単一細胞レベルでの測定値を収集することが望ましい。理想的には、これらの測定は、根本的な経路の数学モデルを開発するために適し定量的データを提供すべきである。

顕微鏡およびフローサイトメトリー、理想的な定量的な単一細胞の測定値を提供するのに適している二つの技術、である。蛍光タンパク質とタンパク質の内因性のタグ付けはできるBeは、それらの発現レベル^4を定量するために使用。タンパク質の末端における大きな蛍光部分の付加は、それを非機能的にすることができるので、それは、蛍光構築物の発現を駆動するプロモーターに基づいて、特定の発現レポーターを生成するために、多くの場合望ましい。このレポータータンパク質は、セルラーシステムに対して外因性であるため、セルに行われているシグナル伝達事象に影響を与えることはない。

顕微鏡法およびフローサイトメトリーの両方が広く酵母シグナリング分野で使用されてきた。例として、コールマン·ラーナーらは相関単一細胞では、酵母接合シグナル伝達カスケード⁵のノイズを定量化するために顕微鏡によって具体的かつ構成的に発現記者を交配の発現、Acarのと制御ネットワークを研究するフローサイトメトリーを使用し、同僚GAL遺伝子⁶の発現を制御する。以前の研究⁷において、我々はcombinatiを使用している出芽酵母では高浸透圧グリセロール（HOG）経路からの発現の出力を研究するため、これら2つの技術の上。このマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路は、超浸透圧ストレスによって誘発される。それは、およそ300の遺伝子の発現を生じる転写プログラムを誘導するために、細胞の核に移行しHOG1 MAPKの活性化をもたらす。このプロセスを研究するために、我々は、四重ビーナス蛍光タンパク質（STL1のp-QV）の発現を駆動STL1プロモーター（HOG1活性⁸に応答して特異的に誘導される遺伝子）に基づく発現レポーターを設計した。測定はフローサイトメトリー、蛍光レポーターを表現する人口のほんの一部に中間ストレスレベル（0.1MのNaCl）で細胞の2集団が存在することを発見した。今後も、この動作を調査するために顕微鏡を使用し、タンパク質発現におけるこのノイズは本質的な要因⁹に支配されたことを発見した。我カップLDさらにHOG1活動の同様のレベルを有する細胞が著しく異なる発現の結果を表示できることを確認します。これら2つの技術の組み合わせは、私たちはストレス応答遺伝子の遅いリモデリングは、単一細胞レベル⁷での発現の結果に影響を与えたかを証明することができました。

本論文では、顕微鏡によるタンパク質発現の定量化の一例として、超浸透圧ショックにより誘導されたP STL1-QVレポーターの式を使用し、フローサイトメトリー。 0.2 MのNaClストレスを受ける同じ株を、両方の技術を用いて研究した。これは、私たちは、これらの2つの高度に補完的な技術のいくつかの重要な違いを強調することができます。

プロトコル

1。顕微鏡測定

1. 酵母で合成培地5mlに植菌。
2. 30℃で一晩細胞を成長させる。
3. 翌朝一晩培養物のOD _600を測定します。
4. ₆₀₀ 0.05にOD 5ミリリットル合成培地中で一晩培養を希釈します。
5. 少なくとも4時間、30℃で希釈した培養を育てる。
6. 合成培地に集中して3倍（0.6 M）のNaCl溶液を調製する。
7. PBSにコンカナバリンA（ConAを）の1 mg / mLの溶液を調製する。
8. ろ液〜ウェルスライドにConAを溶液200μl。
9. 30分間放置してみましょう。
10. のConA溶液を除去。
11. ウェルに150μlのH ₂ Oを追加します。
12. H ₂ Oを削除
13. 細胞培養のOD _600を測定します。
14. 1.5ミリリットルマイクロチューブに= 0.02 OD ₆₀₀で細胞培養液300μlを準備します。
15. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
16. 渦簡単にマイルcrotube。
17. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
18. 簡単に渦マイクロチューブ。
19. ウェルに、細胞培養液200μlを加える。
20. 細胞がウェルの底に沈殿させるために30分待ちます。
21. 顕微鏡上でうまくスライドを配置します。
22. 記録される蛍光チャンネル用照明設定を選択します。
23. （：細胞の適切なセグメンテーションを可能にするために、焦点面下の3程度やや焦点のうち、1）2明視野画像の照明設定を選択します。
24. タイムラプス測定のための時間間隔を選択します。
25. 画像への視野を選択します。
26. 数フレームの取得を開始します。
27. 0.6MのNaClを培地100μlを追加し、取得を一時停止します。
28. 画像を再開する。

2。フローサイトメトリー測定

1. 酵母で合成培地5mlに植菌。
2. 一晩30℃で成長する。
3. 対策OD一晩培養の₆₀₀翌朝。
4. OD ₆₀₀ 0.1に5ミリリットル合成培地中で一晩培養を希釈します。
5. 0.2〜0.4のOD ₆₀₀に_到達するために、少なくとも4時間、30℃で成長する。
6. H ₂ Oにシクロヘキシミド溶液1 mg / mlのを準備します
7. 合成培地に集中して3倍（0.6 M）のNaCl溶液を調製する。
8. 測定対象の各時点での0.6 MのNaCl培地100μlで1 1.5ミリリットルマイクロチューブを準備します。
9. 時間0で、各マイクロチューブに細胞培養液200μlを加える。
10. 30℃で振とうしながらインキュベート
11. 時刻tでの、マイクロチューブに30μlのシクロヘキシミドを追加します。
12. すべての希望する時点について、手順2.11。
13. 少なくとも45分間、すべてのマイクロチューブをインキュベートし、振とうしながら30℃まで3時間。
14. 400μlのPBSでFACSチューブを準備します。
15. 1分間水浴中で細胞を超音波処理する。
16. 簡単に渦マイクロチューブ。
17. 息子1分間水浴中で細胞をicate。
18. 簡単に渦マイクロチューブ。
19. 各マイクロチューブからそれに対応する、FACSチューブに100μlの細胞培養を追加します。
20. 検出のために488nmの励起レーザーと30分の530 nmのバンドパスフィルタを選択します。
21. テスト非発現し、完全に彼らは検出器の感度の範囲に入るかどうかを確認するためにサンプルを表現する。
22. 取得した各サンプルについて、10,000個の細胞を測定します。

結果

顕微鏡検査

発現レポーターSTL1のp-QV（ySP9 ^7）を有する酵母細胞は、ウェルスライドの底部に取り付けられ、顕微鏡下に置いた。細胞は、撮像セッションの過程の間に直接ウェルに応力媒体を添加することにより刺激した。これは、私たちは、経路誘導前の細胞のいくつかの画像を取得し、刺激後、彼らの運命をたどることができます。この場合、細胞を10分間の時間間隔で〜2時間追跡した。 図1Aは、誘導前に、非蛍光細胞の画像であり、発現レポーターを有する場合、図1Bは、ストレス後の同じ細胞を2時間を表示する誘導されて、蛍光となっています。

これらの画像中に存在する定量的な情報を抽出するために、複雑な画像解析処理が実行されなければならない。それは私のオブジェクトを定義するために、細胞のセグメンテーションが含まれていMAGE、あるフレームから次のフレームへのこれらのオブジェクトの追跡と、これらのオブジェクト（形状や強度特性）の特徴の採寸です。我々は...

ディスカッション

顕微鏡検査

ConAを持つウェルの治療は、細胞の適切な画像化を確保するための重要なステップです。のConAをPBS（5 mg / ml）を、低溶解性を有するため、濾過工程は、フィルタリングされていない溶液中に存在し、撮像を妨害する大きな凝集物を除去することができる。細胞が処理された表面に比較的強く付着し、誘導溶液の添加は、刺激の前と後の継続的な追跡を可能にし、細胞の局在を乱すべきではありません。細胞は一定流量^7,15に供されたこの処置はまた、チャネルまたは微小流体デバイスを流すために適用することができる。ウェルを適切に処理した後に水でリンスされていない場合、細胞は、溶液中のConAを細胞に直接結合し、ガラス表面に強い結合を形成することを妨げるためと考え、ガラスに適切に付着しない。洗浄工程の後、ウェルを3ドライ残ることができる -著しくガラスへの細胞の結合に影響を与えることなく、細胞の添加の前に4時間。

蛍光チャネルのための露光時間の選択は、実験の成功のための重要な設定である。細胞の蛍光が経時にわたって増加するの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagent
酵母 窒素ベース	ForMedium	CYN6202
CSM アミノ酸ミックス	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
シクロヘキシミド	フルカ アルドリッチ Σ	C7698	有毒
ySP9			W303Mataleu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
顕微鏡制御ソフトウェア	Micro-manager	Ver 1.4.11
インキュベーションチャンバー	LIS	The Box
蛍光ライト出典	:Lumencor	SpectraX
カメラ	浜松	、フラッシュ、4.0
フローサイトメーター	BD	FACS、calibur
Sonicator、バス	テレソニック	、TUC-150
8ウェルスライド	、Thermo Lab-tek	155409
96ウェルプレート、	マトリックスバイオサイエンス	、MGB096-1-2-LG
FACSチューブ	BDファルコン	352054

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