バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

Summary

バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時定量と比較のためのプロトコルが提示されます。この方法論には、共焦点レーザー走査型顕微鏡、バイオフィルム構造解析および視覚化ソフトウェア、および統計解析ソフトウェアの使用が含まれます。

Abstract

共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)は、バイオフィルムの調査のための強力なツールです。バイオフィルム内の2つ以上の成分の同時分布を定量化することに成功した研究はほとんどありません。その理由は、1)スペクトルの重複が最小限に抑えられる蛍光色素の選択が複雑であること、2)複数の蛍光色素の定量化が多因子の問題を引き起こすためです。目標：関連する基質上に成長したバイオフィルムの3つの細胞/細胞外成分の同時3次元分布を定量化および比較する方法論を報告します。メソッド：この方法は、バイオフィルムの成長、染色、CLSMイメージング、バイオフィルムの構造解析と可視化、構造パラメータの統計解析など、相互に関連し合った明確なステップで構成されています。Streptococcus mutans(UA159株)のバイオフィルムを、Point 4およびTPH³樹脂複合材料の無菌標本上で48時間増殖させた。その後、標本をBiotène PBF(BIO)またはListerine Total Care(LTO)のうがい薬、または水(対照群;n = 5 /グループ)のいずれかに60秒間浸しました。バイオフィルムは、CLSMでイメージングする前に、細胞外高分子物質、タンパク質、および核酸について蛍光色素で染色しました。ISA3D画像解析ソフトウェアを使用して計算されたバイオフィルム構造パラメータは、バイオボリュームと平均バイオフィルム厚さでした。混合モデルの統計解析により、マウスウォッシュ群と対照群の構造パラメータを比較した(SASソフトウェア;α=0.05)。Volocityソフトウェアにより、オーバーレイされたバイオフィルムコンポーネント(蛍光色素)の3D分布を視覚化することができました。 業績：マウスウォッシュBIOは、両方の樹脂複合材料で対照(p<0.05)と有意に異なるバイオフィルム構造を生成しましたが、LTOはどちらの製品でも差(p>0.05)を生じませんでした。結論：この方法論は、関連する基質上のS.ミュータンスバイオフィルム内の3つの主要成分の同時3D分布を効率的かつ成功裏に定量化および比較し、バイオフィルム成分の同時評価に対する2つの課題を克服しました。この方法は、うがい薬を使用して示されるように、複数のバイオフィルム成分に対する抗菌剤/防汚剤の有効性を判断するためにも使用できます。さらに、この方法は、さまざまな分野でバイオフィルムの3D構造/アーキテクチャの比較を容易にするため、幅広い用途があります。

Introduction

バイオフィルムは、自己生成した細胞外マトリックスにカプセル化され、生物学的または不活性な表面¹に付着した構造化された微生物群集です。バイオフィルムは、多くの細菌に共通する生活様式であり、自由浮遊(プランクトン性)細胞から複雑な多種群集へと段階的に移行することで形成されます。バイオフィルムの抗菌剤に対する固有の耐性は、経口バイオフィルム(歯垢)で示されているように、多くの持続性および慢性の細菌感染症の根源にあります^1,2。ミュータンス連鎖球菌などの齲蝕原性微生物は、ショ糖やその他の炭水化物を処理して細胞外マトリックスを生成し、歯の構造を脱灰して虫歯を引き起こす可能性のある酸を生成します。ほとんどのバイオフィルムマトリックスは、エキソ多糖類(EPS)、タンパク質、核酸などの細胞および細胞外成分からなる生体高分子です^3,4。

蛍光イメージングに最も広く使用されている技術である共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)は、固定せずに水和した生物学的構造の3D画像を収集する能力を備えているため、生物学における光学イメージングを根本的に変えました^5,6,7。この非破壊技術では、標本上の関心領域内の薄い切片の画像を、焦点が合っていない光の寄与が取り除かれるように収集します。CLSMで撮影された画像の品質と解像度は、広視野蛍光顕微鏡で達成可能なものを超えています。CLSMの大きな欠点の1つは、画像全体が同時に収集される広視野顕微鏡技術よりも画像のスキャンが遅いことです⁵。しかし、蛍光色素、レーザー、フィルターの選択肢が広がるにつれ、CLSMはマルチスペクトルイメージングの主流の手法の1つになりました^5,7。

以前の研究では、CLSMは、バイオフィルム内、特に細胞外マトリックス内のEPSと細胞の分布をよりよく理解するために、1つまたは2つの蛍光タグまたは染色剤を使用してバイオフィルムの構造または構造を調べるための有用なツールであることが示されています^7,8。理論的には、バイオフィルム内の細胞および細胞外成分の詳細な構造と共局在を探索するためには、複数の成分の蛍光染色/標識が望ましいとされています。しかし、バイオフィルム内のさまざまな成分の同時分析は、1)スペクトルのオーバーラップが最小限に抑えられる蛍光色素の選択が複雑であること、2)複数の蛍光色素の定量化が多因子の問題を引き起こすことなどから、困難な場合があります。複数の蛍光色素を用いた共局在化では、2つの蛍光色素のスペクトルピークが大きく重なり、一方が他方の^蛍光色素9よりも強く励起されるブリードスルー効果を回避するために、スペクトル干渉を最小限に抑えた特異性の高い染色剤を使用する必要があります。理想的には、励起スペクトルが重なっていない蛍光色素が最良の結果を提供しますが、この基準を満たす染色を見つけることは非常に困難です。その代わり、蛍光スペクトルの重なりが最小の蛍光色素を選択することにより、染色物の選択が最適化され、限られた観察波長帯⁹内で染色物を1つずつ観察することができる。

蛍光画像の重ね合わせは、蛍光色素の同時分布を評価するためにおそらく最も広く使用されている方法です。さまざまなコンポーネントの共局在は、検査対象の蛍光色素¹⁰によって作成された複数のチャネルを通じて、異なる色の重なりとして現れます。マルチチャンネル蛍光画像をマージカラー画像として表示するためのツールは、ほとんどのCLSMソフトウェアと生物学的画像解析ソフトウェアで利用できます。画像の重ね合わせは、共局在の空間評価には有用ですが、画像は視覚的分析によってのみ定性的に調べることができます。これらの表現は一般に、異なる実験条件下での共局在を定量化するのに役立たず、また、共局在がランダムな偶然性¹¹を超えるかどうかを決定するため、これは限られた量の情報を提供する。バイオフィルムやバイオフィルム成分の3次元構造を定量的に解析した研究はこれまでほとんどなく、抗菌処理や防汚対策がバイオフィルム成分に及ぼす影響を定量化した研究はさらに少ないのが現状です。

この研究の目的は、バイオフィルムの3つの細胞および細胞外成分の同時3次元分布の定量化と比較の方法論を報告することでした。この方法は、バイオフィルムの成長、染色、バイオフィルムのCLSMイメージング、バイオフィルムの構造分析と視覚化、および構造パラメータの統計分析を含む、明確でありながら相互接続されたステップで構成されています。バイオフィルム成長アッセイは、関連する基質上でのバイオフィルム成長を可能にし、再現性のあるバイオフィルム構造を生成します。EPS、タンパク質、核酸成分の新規同時染色と3Dバイオフィルム構造パラメータの測定を組み合わせることで、バイオフィルム内の成分の分布を定量化することができます。バイオフィルムの構造パラメータの統計的分析は、次のセクションで説明するように、特定の実験条件(例えば、うがい薬による処理後)でのバイオフィルムの評価を容易にします。

Protocol

1. 培地と試薬の調製

1. 300 mLの一晩培養培地(THY;3% Todd Hewitt Brothをメーカーの指示に従って調製し、0.3%酵母抽出物を超純水に添加)とオートクレーブを調製します。室温で最大2か月間保管してください。
2. 1 L THY寒天(超純水中の3%トッドヒューイットブロス、0.3%酵母抽出物、1.5%寒天)をオートクレーブ処理し、60°Cに冷却してからペトリ皿に注ぎます。4°Cで最大3ヶ月間保存してください。
3. 150 mLのバイオフィルム増殖培地(0.5X TYに10 mMスクロースを添加、1.5%トリプトン、0.5%酵母抽出物、および10 mMスクロースを超純水に添加)を調製し、ろ過滅菌します。室温で最大1か月間保存してください。
4. 1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄、および0.24 g KH₂PO₄を超純水で)とオートクレーブを作成します。室温で数ヶ月間保存してください。
5. 超純水(TCバッファー;pH 7.2)およびオートクレーブ中に10 mM CaCl₂を添加した600 mLの10 mM Tris HClバッファーを調製します。室温で数ヶ月間保存してください。
6. オートクレーブ1Lの超純水。室温で数ヶ月間保存してください。

2. 試料作製

1. Point 4(PF)とTPH³(TP)歯科用樹脂複合材の円盤状の試料を、カスタムメイドのステンレス製金型で2段階に分けて作製します。各増分は、LED光硬化ユニットを使用して40秒間光硬化されます。2つの製品は、わずかに異なる組成とフィラーレベルを持っているため、バイオフィルムが成長するための異なる表面トポグラフィーが生成されます。
   1. 関連する基質の標本は、ステップ2.1の代わりに、他の分野から確立されたプロトコルを使用して作製できます。
2. 試料を満足のいく最終表面仕上げに仕上げ、研磨します(例:半自動グラインダーポリッシャーを使用)。研磨された試料を超純水ですすぎ、圧縮空気で乾燥させます。
3. エチレンオキシドガスまたは別の滅菌方法を使用して試料を滅菌します。

3. バイオフィルムの成長

1. S. mutansの単一コロニーを4 mLの一晩培地に接種します(ステップ1.1)。37°Cで一晩16〜18時間インキュベートします。培養物の光学濃度(OD₆₀₀)は≥0.9である必要があります。
   1. 元のストックから2回継代されたプレート培養のコロニーを使用するのが最善です。これにより、バイオフィルムの一貫した成長が得られます。
2. 10 mLのバイオフィルム増殖培地(ステップ1.3)で一晩培養(ステップ1.1)を使用して、1:100希釈液を作成します。
3. 滅菌樹脂複合試料(PF、TPなど)を滅菌12ウェルプレートに移します。
4. 2.5 mLの希釈培地(ステップ3.2)をウェルに加え、治療(うがい薬)および対照群に使用します。2.5 mLの滅菌未接種バイオフィルム増殖培地を無菌制御ウェルに加えます。
5. バイオフィルムを微好気性条件下で成長させます。プレートを100rpmのシェーカーに載せ、インキュベーター内の37°Cで24時間放置します。
6. 24 時間後、すべてのウェルから培地を無菌吸引し、滅菌 PBS で 2 回洗浄し (ステップ 1.4、2.5 ml/ウェル)、各洗浄後に PBS を吸引します。各ウェルに2.5 mLの新鮮なバイオフィルム増殖培地を補充し、前のステップと同じ条件下でさらに24時間インキュベートし、バイオフィルム増殖時間の合計は48時間です。
7. 上記の手順の代わりに、確立されたプロトコルを使用して、他の種のバイオフィルムを基質上に成長させることができます。

4. 抗菌・うがい薬

1. バイオフィルムの成長が完了した後、培地を吸引します。
2. 治療群のウェルに2.5 mlのBiotène PBF(BIO)またはListerine Total Care(LTO)マウスウォッシュ、またはその他の治療法を追加し、対照群のウェルに2.5 mlの滅菌超純水を追加します。メーカーの指示に従って、150rpmでオービタルシェーカーでプレートを攪拌しながら、試料を60秒間浸します。うがい薬と井戸からの超純水の両方をすぐに吸引します。
3. 試料を1回の洗浄につき15秒間、オービタルシェーカーで滅菌超純水で150rpmで5回洗浄し、各洗浄ステップの後に水を吸引します。
4. 上記の手順の代わりに、確立されたプロトコルを使用して他の抗菌剤を試験することができます。

5. 染色

1. バイオフィルム分析用の染色希釈液を調製します。
   1. Concanavalin A、Alexa Fluor 647コンジュゲート(AF)の5 mg/mLストック溶液を0.1 M重炭酸ナトリウムpH 8.3で調製します。-20°Cで使い捨てのアリコートで数ヶ月間保存してください。これは、凍結融解が推奨されないためです。このAFストック溶液を使用して、TCバッファーで250μg/ml希釈液を調製します。
   2. メーカーが提供する5 mM Syto 9ストック溶液(SY)を使用して、TCバッファーに10 μM希釈液を調製します。残りのSYストック溶液は、-20°Cで数ヶ月間保存してください。
   3. メーカーが提供する5,000倍Sypro Redストック溶液(SR)を使用して、滅菌超純水で10倍希釈液を調製します。残りのSRストック溶液は、-20°Cで数ヶ月間保存してください。
2. すべてのバイオフィルムをTCバッファー(2.5 mL/well)で手で渦巻くように2回洗浄し、2回目の洗浄を室温で30分間プレートに留まらせます。有気音。
3. 各バイオフィルム検体に50 μlのAF染色剤を滴下します。光から保護して、室温で30分間染色します。TCバッファー(2.5 ml /ウェル)で2回洗浄し、各洗浄後に吸引します。
4. 続いて、各バイオフィルム検体に50 μlのSY染色液を滴下します。光から保護して、室温で30分間染色します。滅菌超純水(2.5 ml /ウェル)で2回洗浄し、各洗浄後に吸引します
5. 最後に、各バイオフィルム試料に50 μlのSR染色剤を滴下します。光から保護して、室温で30分間染色します。滅菌超純水(2.5 ml /ウェル)で3回洗浄し、各洗浄後に吸引します。
6. 試料を6ウェルプレートに移し、1ウェルにつき1つの試料を6 mLの滅菌超純水に入れて、共焦点顕微鏡検査を容易にします。

6. 共焦点レーザー走査型顕微鏡によるイメージング

1. 表1に示す共焦点レーザー走査型顕微鏡の設定を使用して、処理群と対照群のバイオフィルム内の各成分(染色)の画像を取得します。この研究では、作動距離が2.2mmの開口数0.9の63倍ディッピングレンズを使用しました.
   
   テーブル 1.共焦点レーザー走査型顕微鏡の設定。

2. スキャンサイズを250 μm x 250 μmに設定し、最小ピクセル解像度を512 x 512に設定して、定量分析に適した解像度でCLSM画像を取得します。
3. SY染色を使用してバイオフィルム画像スタックの上下のポイントを設定し、次にzステップを定量分析に適した値に設定します(この研究では0.6μm)。スキャンを収集する前に、QLUTオプションを使用して、画像と染色のパラメーター(PMT電圧とオフセットなど)を最適化します。カラールックアップテーブルを使用して、各染色に疑似色(SYは緑、SRは赤、AFは青)を割り当て、3D再構成で各バイオフィルムコンポーネントをより区別しやすくしました。
4. 「スタック間」モードでシーケンシャルスキャンを使用して400HzでCLSM画像を収集し、同じバイオフィルム内の複数の染色の画像のキャプチャを最適化します。

7. バイオフィルム構造解析

1. バイオフィルムの画像解析ソフトウェアを使用して収集したCLSM画像を解析します。次の手順では、ISA3Dソフトウェア¹²を使用して、収集されたバイオフィルム画像の構造パラメータを計算する方法について説明します。
   1. 各バイオフィルムのCLSM画像ファイルを、ソフトウェアのマニュアルに指定されているように、Imagesフォルダにコピーします。ソフトウェアで必要な CLSM ファイルの命名規則に従っていることを確認します。このソフトウェアでは、サブフォルダ内のファイルをバッチモードで解析できるため、処理群とコントロール群のバイオフィルムを同じランで解析することが容易になります。
   2. CLSM 画像の x、y、z 軸の寸法を、メイン ダイアログ ボックスの dxy フィールドと dz フィールドに入力します。ソフトウェアのマニュアルに記載されているように、閾値と距離のマッピング設定を選択します(この研究では、それぞれOtsuとQuasi-Euclideanを使用しました)。結果ファイルに適切な名前を入力し、プログラムを実行します。結果ファイルが ISA フォルダに作成されます。
   3. 結果ファイルを表示して、バイオフィルム内の各成分(染色)の3D分布を定量化する、バイオボリュームや平均バイオフィルムの厚さ(この研究では測定)などの20の3D構造パラメータ¹²の値を取得する。

8. バイオフィルム構造の可視化

1. 画像解析ソフトウェアを使用して、各バイオフィルム内に重なった成分(汚れ)の再構築を作成します。次の手順では、Volocityソフトウェアを使用して3D再構築を作成する方法について説明します。
   1. マニュアルに記載されているように、CLSM画像ファイルをソフトウェアにコピーして、各バイオフィルムのライブラリを作成します。
   2. 3D Renderer メニュー オプションを使用して、各バイオフィルムの CLSM 画像から再構築された 3D 画像を生成します (この研究では HR Opacity 形式を使用しました)。
   3. 3D画像を回転させて、x、y、z座標軸に対して同様の方法ですべてのバイオフィルムの向きを合わせます。正しい向きのバイオフィルム再構築のスナップショットをキャプチャし、スナップショットをTIFF、JPEG、またはその他の適切な形式でエクスポートします。
2. 再構成された画像上で、バイオフィルム内のEPS、タンパク質、核酸成分の同時分布を視覚的に解析します。
3. ピアソンの相関係数とマンダースのオーバーラップ係数を使用して、複数のバイオフィルム成分の共局在分析を実行します(この研究では共局在は測定されませんでした)。

9. 統計分析

1. 別々の混合モデルの統計分析を使用して、うがい薬群と対照群(α=0.05)の構造パラメータの平均値を比較します。この調査では、SASソフトウェアを使用して統計分析を実行しました。

Results

治療(うがい薬)と未治療の対照群の代表的な結果を表2、図1、図2に示します。表2は、ISA3Dソフトウェアを使用して計算されたバイオフィルム構造パラメータのバイオボリューム(μm³)と平均バイオフィルムの厚さ(μm)の平均値と標準偏差の値を示しています。マウスウォッシュで処理したバイオフィルムの構造パラメータが対照群のバイオフィルムの構造パラメータ(p<0.05)と有意に異なる場合、平均値と標準偏差の値は赤で強調表示されています。混合モデルの統計解析の結果、マウスウォッシュBIOは、両レジンコンポジットの対照群(p<0.05)と有意に異なるバイオフィルム構造を産生したのに対し、マウスウォッシュLTOは、いずれのレジンコンポジットでも有意差(p>0.05)を生じさせなかったことが示された。その結果、2回のうがい薬治療後に残った細胞内バイオフィルム成分と細胞外バイオフィルム成分が異なることが明確に示されました。また、2つの基板(PFおよびTP)上に成長したS.ミュータンスバイオフィルムは、同様の条件下で成長させ、両方の基板を同様の研磨剤で研磨したにもかかわらず、3D構造が異なっていたことにも留意すべきである。

バイオフィルム内のEPS、タンパク質、核酸の同時分布は、Volocityソフトウェアを使用して生成された3D再構成によって視覚化できます。図1および図2は、それぞれPFおよびTP樹脂複合材料上に成長した対照群バイオフィルムの代表的な再構成を示しています。青色の染色はS.ミュータンスのバイオフィルム内のEPSを表し、緑色の染色は核酸を示し、赤色の染色はタンパク質を示しています。介在する空間は、水または他の非蛍光標識バイオフィルム成分によって占められてもよい。

図 1. 対照群のPF樹脂複合材料上に成長したS.ミュータンスバイオフィルムの代表的な3D再構成(うがい薬で処理していない)。1つのバイオフィルム内で3つの染色を同時に重ね合わせることで、S. mutansバイオフィルム内のEPS(青色染色)、核酸(緑色染色)、およびタンパク質(赤色染色)成分を同時に可視化することができます。(1ユニット=24μm)。 大きな図を見るにはここをクリックしてください。

図 2. 対照群のTP樹脂複合材料上に成長したS.ミュータンスバイオフィルムの代表的な3D再構成(うがい薬で処理されていない)。1つのバイオフィルム内で3つの染色を同時に重ね合わせることで、S. mutansバイオフィルム内のEPS(青色染色)、核酸(緑色染色)、およびタンパク質(赤色染色)成分を同時に可視化することができます。(1ユニット=24μm)。 ここをクリックすると大きな図が表示されます。

千株 千株 株 千株 の の の 千株 分 千株 日 千株 千株 千株

レジンコンポジット		ポイント4		TPH3
含嗽薬	コンポーネント	BV (μm3)	MT (μm)	BV (μm3)	MT (μm)
ビオテーヌPBF	核酸	279,517±53,291	9.32±2.80	195,033±42,014	7.45±3.70
	EPSの	344,902±56,386千	35.22±17.19	197,840±62,351	983±7月26日
	タンパク質	298,796±62,868	54.21±21.65	216,033±66,654	24.33±39.64
リステリントータルケア	核酸	355,707±110,444	26.45±14.21	273,296±47,323	13.43±2.89
	EPSの	494,099±180,592	64.90±26.68	329,150±47,145	34.35±30.32
	タンパク質	348,416±161,316	58円68±47銭28	303,150±54,705	34.18±41.46
コントロール(未処理)	核酸	388,375±42,152の	51.15±40.66	327,809±39,400	17±1月65
	EPSの	660,448±173,197	91円37±74銭84分	363,850±67,612	7±28.33
	タンパク質	517,274±119,475	127.96±73.84	353,161±56,518	21.17±4.41

表 2.バイオボリューム(BV)の平均値と標準偏差の値、およびBIOまたはLTOで処理されたバイオフィルム、または未処理のまま放置されたバイオフィルムの平均バイオフィルムの厚さ(MT)(対照群)。マウスウォッシュで処理したバイオフィルムの構造パラメータが対照群のバイオフィルムの構造パラメータと有意に異なる場合(p<0.05)、平均値と標準偏差の値は赤で強調表示されています。

Discussion

CLSM画像の取得は、バイオフィルムの定量化および共局在解析に必要な方法と形式で実行されなければならず、各画像のシグナル強度の分布がバイオフィルムスタック内の各蛍光色素の分布を確実に表現します。シグナル強度は、ノイズおよびバックグラウンド^10,11と区別可能であり、基板からの自家蛍光の影響を受けず、使用された蛍光色素¹¹間のスペクトル干渉によるブリードスルーが最小限でなければなりません。ノイズは蛍光顕微鏡¹¹の避けられない制限であり、技術的またはロジスティックな理由により画質が制限される場合があります。スペクトルの重複が最小限に抑えられた蛍光色素の同定は、この方法の成功に不可欠ですが、複雑になる可能性があります。さらに、複数の蛍光色素の定量化は多因子の問題を引き起こします。したがって、バイオフィルムの構造内の2つ以上の成分の同時分布を定量化することに成功した研究がほとんどないことは驚くべきことではありません。

この研究の目的は、バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時3次元分布を定量化および比較するための、異なるが相互に関連するステップで構成される方法論を報告することでした。記載されているバイオフィルム成長アッセイは、 表1に報告された結果で示されているように、関連する基質上でのバイオフィルム成長を可能にし、再現性のあるバイオフィルム構造を生成します。EPS、タンパク質、核酸成分の新規同時染色と3Dバイオフィルム構造パラメータの測定の組み合わせにより、バイオフィルム内の成分の定量化可能な分布が得られます。バイオフィルム内のEPS、タンパク質、核酸の同時分布の定性的視覚分析は、各バイオフィルム内の重ねられた染色を再構築することによって可能です。ISA3Dソフトウェア¹² には、バイオフィルムの3D構造の定量化を強化するために、気孔率やバイオフィルムの厚さなどの従来測定されたパラメータに加えて、フラクタル次元、均質性、バイオフィルム粗さ係数などのいくつかのユニークな構造パラメータが含まれています。バイオフィルム構造パラメータの統計分析により、抗菌/防汚効果(うがい薬による治療後など)または経時的(時間的効果)などの特定の実験条件下でのバイオフィルムの適切な比較が容易になります。

この方法論は、関連する基質上で増殖した S. mutans バイオフィルム内の 3 つの主要成分の同時 3D 分布を効率的かつ成功裏に定量化し、比較することで、バイオフィルム成分の同時評価に対する 2 つの課題を克服しました。この方法は、この研究でうがい薬を使用して示されているように、複数のバイオフィルム成分に対する抗菌処理または防汚対策の有効性を判断するためにも使用できます。さらに、上記のプロトコルの大部分は、関連する基質の作製および関連微生物のバイオフィルム成長アッセイのためのプロトコルに置き換えることができます。したがって、この方法は、医学、歯科、地質学、海洋科学を含むさまざまな分野における in vitro および in vivo バイオフィルムの 3D 構造/構造の比較を容易にするため、幅広い用途があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
バクト寒天	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	214010
バクトトッドヒューイットブロス	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	249240
酵母エキス、粒状	EMDミリポア	1.03753.0500
バクトトリプトン	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	211705
OmniPurショ糖	EMDミリポア	8510
塩化カリウム、ACS試薬、99.0-100.5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
リン酸カリウム、一塩基性、≥99.0%、ACS試薬	Sigma-Aldrich	P0662-500G
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9888-500G
リン酸ナトリウム、一塩基性、一水和	物 EMD Millipore	SX0710-1
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、99.8+%, ACS試薬	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A、Alexa Fluor 647 Conjugate	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 または S6653
Biotène PBFオーラルリンス	グラクソ・スミスクライン	N / A
リステリントータルケア	マクニール-PPC株式会社		該当なし