治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
顕微鏡で手動細胞数は、細胞の生存能力を評価する敏感な手段ですが、時間がかかり、従って高価である。コンピュータ化された生存率アッセイは、設備の面で高価であるが、より速く、より客観的な手動の細胞数よりもすることができます。今回の報告は、3つのそのような生存率アッセイの使用が記載されている。これらのアッセイの二つは、赤外線であり、1つが発光性である。両方の赤外線アッセイは、16ビット·オデッセイイメージャに依存しています。つの赤外線アッセイは、細胞質ゾルのためのサファイア染色と組み合わせる核についてDRAQ5染色を使用し、700 nmのチャネルで可視化される。他の赤外線分析、インセルウェスタン、細胞骨格タンパク質（α-チューブリンまたは微小管結合タンパク質2）に対する抗体を使用し、800 nmのチャネルでそれらにラベルを付けます。第三の生存率アッセイは、ATPのために一般的に使用される発光アッセイであるが、我々はコストを節約するための推奨量の四分の一を使用しています。これらの測定は、すべての線状であり、CEの数と相関LLSメッキが、感度が異なる。 3つ全てのアッセイは、時間のかかる顕微鏡を回避し、それによりサンプリング誤差を低減し、ウェル全体をサンプリングする。最後に、アッセイの全ては、容易に短期間内で実行される実験の大きな数字を可能にする、実験の終了の1日以内に完了することができる。しかしながら、それらはすべて細胞数が治療後の信号強度に比例、時には特にセルラATPのために、満たされていないという仮定に留まるという仮定に依存する。細胞は、治療後に増加又はサイズが減少した場合さらに、これは細胞数に影響を与えることなく、信号強度に影響を与える可能性がある。我々は、手動カウントを含む、すべての生存率アッセイは、いくつか補足説明に苦しむと結論が、コンピュータ化された生存率アッセイは、初期投資の価値があること。一緒にすべての3つのアッセイを使用して、細胞の構造および機能の包括的なビューをもたらす。
概要
生物科学の中で最も一般的な生存率アッセイは、細胞数が含まれます。これは、2013年4月29日およ び2013年4月30日に、キーワードのいずれかを「 インビトロ 」や「文化」とPubMedの中で登場し、トップ（最新の）200の出版物の分析によって証明されている。これらの刊行物の中でも、手動細胞数の計数を含む23.5％用いる細胞計数アッセイは、自動化された細胞数は、イメージングソフトウェアを使用してカウントし、トリパンブルー排除。生/死アッセイは、これらの刊行物の1％で使用した。 MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、多くの刊行物の代謝生存についてのアッセイは11％であった。文学のこの調査では、細胞数アッセイと組み合わせてMTTなどのアッセイを使用して多くの刊行物はわずか3.5％であったことを示しています。それ自体ずつ生存率アッセイを使用する傾向にもかかわらず、細胞数との組み合わせで細胞機能を評価することは私の細胞を評価するための最良の選択と思われるntegrity。残りの細胞が機能または彼らはよく、1,2に存在しているにもかかわらず、健康的ではない可能性があるため、それ自体で細胞数が十分ではない。逆に、例えばATPなどの機能措置が増加または細胞の数の並列の変化の非存在下で低下することがある。細胞数から代謝読み出しの脱共役は、ATPおよびMTTアッセイは唯一の生存率アッセイとして使用してはならないこ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
プロトコルの概略を図1に示す。
1。細胞播種
異なるめっき密度（ 図2）で、96ウェルプレート中の細胞をプレート。 N2aの神経芽腫細胞株、プレート2.5K、5K、10K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり15K細胞上の直線性チェックのために。ラット初代皮質ニューロン、プレート25K、50K、100K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり20万細胞での直線性チェックのために。細胞株または目的の初代細胞は、その細胞型のための最適細胞密度でかつ周囲に、異なるめっき密度でプレートを健康な見れば。
注：本研究では、N2a細胞下部の蒸発のために設計されているプレート上で200μlの培地中の100μlの培地および一次皮質ニューロンにプレーティングした。細胞処理、メディア、血清、抗生物質、および毒素治療の詳細については、Unnithan らを参照してください。 N2aはCELのためLS 8とPosimo ら 。一次皮質培養22。
- 第96ウェルプレートにプレーを繰り返します。一方のプレートは、赤外線アッセイ（ 図2B）でのATP（
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
これらの実験における律速因子は、ATPアッセイは、持続時間が比較的短いほど、赤外線染色である。赤外線アッセイのために、我々は、8つの96ウェルプレート4枚のプレートの各々の驚異的な二つのバッチ（ 図1参照）により1日以内に染色し、走査することができると予想している。この推定は、固定の20分を想定し、洗浄30分、洗浄の30分、続いて2時間一次抗体インキュベーションを遮断する30分の洗浄を30分間、続いて1時間、二次抗体インキュベーションは、30分間のDRAQ5は+サファイア30に続く洗浄の分、4プレート用スキャン時間の34分。さらに15分には4個々のプレートの千鳥ペッティングを考慮するために洗浄のための図1に織り込まれている。データ分析のための時間は、この推計には含まれていません。 ATPアッセイの測定値は、すべての赤外線プレートについて並行して発生する場合は、12プレートは1日にアッセイすることができる - 赤外線染色のための6sおよびATPレベルのため6。
回帰分析で満足のデータ（ 図3）
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々は、すべての3つの生存能力アッセイにおける信号強度が線形でプレーティング密度と相関することを見出した。ただし、すべてのアッセイは、メッキ密度が2倍または1.5倍の変化にも同様に区別されます。 N2a細胞の場合は、赤外線のアッセイは、特に低メッキ密度で、ATPアッセイよりも感度が低い。赤外線アッセイは、ATPよりも感度が低いですが、彼らは、N-アセチルシステインの高度な保護の影響を明らかにすることで、DRAQ5 +サファイアアッセイおよびα-チューブリンアッセイはよく一致している。そこに両方の分析と赤外線信号の用量反応ロスがあったし、すべての3の生存曲線は、N-アセチルシステインを右にシフトした。 α-チューブリンおよびATPアッセイをDRAQ5 +サファイアアッセイ（Unnithan らの図4を参照してより塩化アンモニウムのような化合物に対してより感受性であると思われるので、このオーバーラップは常に、N2a細胞の処置のすべてのタイプの観察されない。8 ）。このようにして、生存率表現型解析ESは常に平等にすべての3つのアッセイでは表されません。 ATPアッセイは、α-チュー.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者はいずれも開示する競合はありません。
謝辞
我々は、ATPアッセイにおける試薬の量を節約するという考えのためJuliann Jaumotteを認める。私たちは、これらの研究のための財政支援を提供するためのメアリー·カルーソ、デブウィルソン、ジャッキーファラーの見事な行政支援のため、製薬マイラン学校に深く感謝しています。おかげでまたHunkele恐怖の病財団とパーキンソン病と運動障害初代神経研究の彼らの財政支援のための基金によるものである。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | 高価な10mlの量を購入する代わりに、100mlの量で購入してアリコートします。再構成された未使用の試薬は、-20°Cで再凍結できます。C 少なくとも 21 週間 |
| 18% ホルマリン | サーモ シャンドン | 9990244 | この固定剤を購入すると、ホルムアルデヒド粉末の計量と溶液の沸騰を回避できます。蒸気への曝露は、それにより最小限に抑えられます |
| ショ糖 | シグマ-アルドリッチ | S0389 | ホルムアルデヒド溶液にこれを追加することは必須ではありませんが、固定細胞の外観を改善します |
| オデッセイ ブロック | LI-COR | 927-40003 | この魚の美容液はまとめて購入でき、-20°Cで冷凍できます。C 長期使用用 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | 10% Triton-X 100 のストック溶液を滅菌水に 4 °C で保管します。C |
| リン酸ナトリウム一塩基性 | フィ | ッシャーS468 | 1つもPBS錠剤または10x PBS溶液を購入することができますが、それらはより高価です |
| リン酸ナトリウム二塩基性 | フィ | ッシャーS373 | 上記を参照してください |
| アジ化ナトリウム(250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | アジ化ナトリウムは非常に有毒であるため、粉末を購入しないでください。使用済みのすべての抗体を1xアジ化ナトリウムに4°Cで保存します。C 破片で汚染されるまで |
| マウス抗アルファ-チューブリン | Sigma-Aldrich | T5168 | この抗体は高価ですが、大幅に希釈でき、特異性が高い |
| マウス抗MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | この抗体は高価ですが、特異性が高い(In-Cell Westernsの前提条件) |
| 800 nm ヤギ抗マウスIgG | LI-COR | 926-32210 | 他社では、赤外線二次抗体も販売しています。高交差吸着抗体を購入し、IgGの濃度はソースによって異なる可能性があることに注意してください |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | この化合物は、LI-CORによって1 mMで販売 |
| サファイア LI-COR | 928-40022 | ||
| ルミノメーター | PerkinElmer | VICTOR3 1420 マルチラベルカウンター | |
| デッセイイメージャー | LI-COR | 9201-01 | |
| シェーカー/ミキサー | 研究製品国際 | 248555 |
参考文献
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
