Method Article

培養胚のための方法 C.虫細胞

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。

Abstract

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C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。

Introduction

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線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物'に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（> 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 コミュニティは、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究

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Protocol

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クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1

1。素材のセットアップ

  1. 細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播種。これらのプレートに用いられるペプトンの量は、通常、NGMプレートのために使用される8倍の量である。高いペプトン濃度が厚い層に成長するためにどの反しOP50-、より効率的NA22細菌の成長を支える。

8Pプレートレシピ：

3グラムのNaCl物、20gバクト - ペプトン、30分間の滅菌蒸留水を、オートクレーブ1L中25gの寒天を溶解する。 MgCl 2を 55℃で培地が冷えて、次にコレステロールの滅菌濾過した1ミリリットル（EtOH中5ミリグラム/ ml）を追加し、1の1ミリリットル、MgSO 4を1mlの緩衝液およびKP（500ミリリットルのストック：5gのK 2 HPO 4、30gのKH 2 PO

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Results

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C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫

トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での> 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する失敗し、それは彼らが生き残るかどうかは明らかではない細胞。細胞の分化は、めっき後2〜3時間を開始し、〜24時間続く。 24時間以内に、細胞は、特定の形態を取る。したがって、ニューロンはプロセス1,18-20を送り出す、筋細胞が内腔17を形成インビボ 1と管細胞において見られるものと同様の指のような細長い構造を形成する。 in vitroでの形態学的特徴は、 生体内でのものと非常に類似している。例えば、 in.......

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Discussion

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線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝子発現プロファイルのような特定の細胞型の単離のような細胞への直接アクセスを必要とする方法の適用を制限する加圧されたキューティクル内に閉じ込められている。 C.虫細胞培養法は、このモデル生物の制限の多くを解決するあった。

本稿では、我々は、胚Cを分離して培養するための更新された方法を記載しているクリステンセンら1によって初期の作品に基づいて大規模に虫細胞 。私たちALSO免疫細胞化学、電気生理学およびC.における細胞機能の基礎となる生理学的プロセスおよび遺伝的要件の理解を進めてきたカルシウムイメージングを含.......

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco寒天粒VWRインターナショナル株式会社90000-784
Bacto TryptoneVWRインターナショナル株式会社90000-284
バクト酵母エキスVWR インターナショナル インク90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma P4333-100ML
キチナーゼ Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis 遺伝学センター
ピーナッツレクチンシグマL0881-10MG
ショ糖シグマ57903-1KG
D-(+)グルコースシグマ67528-1KG
エチレングリコールビス (2-アミン–thylether)、N,N,N',N'- 四酸酸 (EGTA)ΣE0396-25G
Hepes ΣH3375-500G
コレステロール
NaClΣ57653-1KG
KClΣP9333-500G
CaCl2ΣC1016-500G
MgCl<サブ>2シグマM8266-100G
MgSO<サブ>4シグマM2643-500g
K<サブ>2HPO<サブ>4シグマP2222-500G
KH<サブ>2PO<サブ>4シグマP9791-500G
NaOHシグマS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
エタノール
オートクレーブ蒸留 H2O
漂白剤
EQUIPMENT
101-1000 μl 青い目盛り付きピペットのヒントUSA Scentific1111-2821
10 ml 滅菌ピペット 個包装USA Scentific1071-0810
人間工学に基づいた可変容量 (100-1000 μl)チップエジェクター付きピペッターVWRインターナショナル株式会社89079-974
ポータブルピペットエイド、ドラモンドVWRインターナショナル株式会社53498-103
トランスファープラスチックピペット滅菌VWRインターナショナル株式会社14670-114
15 mlコニカルチューブUSA香り1475-1611
50mlコニカルチューブUSA香り1500-1811
18ゲージニードルクトン、ディキンソンアンドカンパニー
滅菌10mlシリンジベクトン、ディキンソンアンドカンパニー
プラスチックシリンジフィルターコーニング0,20 μm細孔サイズ コーニング431224
アクロディック 25 mm シリンジフィルター w/5 μm versapor メンブレンVWR International Inc.28144-095
60x15 mmペトリ皿滅菌VWRインターナショナル株式会社82050-548
100x15 mmペトリ皿滅菌VWRインターナショナル株式会社82050-912
12 mm径ガラスカバースリップVWRインターナショナル株式会社48300-560
クリアセル培養プレート 24 ウェル平底 蓋付き トーマス科学6902A09
デュモン #5- ファイン フォーセプス ファイン サイエンス ツール11254-20
遠心分離機 5702エッペンドルフ022629883
層流フード
倒立顕微鏡 x10 対物レンズ
周囲空気加湿インキュベーター
滅菌ベ305196305482付き

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.

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