ナチュラル無細胞腸基質の産生のための脱細胞化の方法論

サマリー

記事では、ラットの腸から無細胞マトリックスを製造するための方法論を説明します。腸の足場の導出は、細胞生物学および薬物検査幹、組織工学における将来の用途のために重要である。

要約

成功した組織工学は、in vitroまたはin vivoで適切な細胞を有する足場の組合せを含む。足場は、合成または天然由来の組織/器官に由来することができる。後者は、脱細胞化と呼ばれる技術を用いて得られる。脱細胞化は、物理的、化学的、および酵素的方法の組合せを含み得る。この技術の目的は元の組織のマクロおよびマイクロアーキテクチャを維持しながら、すべての細胞の痕跡を除去することである。

腸組織工学はこれまでネイティブ臓器の複雑なアーキテクチャを複製しない比較的単純な足場を使用しています。この論文の焦点は、ラット小腸のための効率的な脱細胞化技術を説明することである。小腸の単離血管の接続の維持を確実にするように記載されている。ウコン細胞を除去する化学的および酵素的ソリューションの組み合わせ足場の管面に絨毛-クリプト軸を維持し、STも着手している。最後に、適切な特性のために製造足場の評価が議論されている。

概要

組織工学（TE）は免疫抑制および臓器不足の問題をバイパスして、臓器移植への治療選択肢を提供します。 TEは最近、両方の大人^3,4と子供⁵に、例えば膀胱^1、尿道^2、気管などの臓器に代えて、クリニックに成功したアプリケーションを持っていた。

組織工学臓器を構築することは、適切な細胞と足場の組み合わせを必要とする。足場は、天然由来（ 例えば、コラーゲン）を用いて調製及び合成（ 例えば、ポリ-L-グリコール酸、PLGA）することができる材料、または天然の器官および組織の脱細胞化することにより得られる。腸TEのためにこれまで使用されている足場は、主に^6-13（ポリ-L-グリコール酸およびポリ乳酸）脱細胞化（小腸粘膜下組織）または合成のいずれかであった。これらの生体材料は、マクロおよびマイクロアーキテクチャの両方で非常に単純である組織工学、腸が臨床的に翻訳される場合には理想的ではないかもしれません。腸に最適な生体材料は、を支援するために、腸壁の層と腔側に絨毛-クリプト軸を反映するために、ホストの血液供給に接続することができ先天的血管樹、異なる特性を持つ階層型管状の壁を持っている必要があります上皮幹細胞による再増殖。

脱細胞化は、元のアーキテクチャ^14を維持しながら、全体の器官から細胞を除去することによって足場を生成する新規な方法論である。これは、臓器の構造を複製するだけでなく、細胞外マトリックス（ECM）を助ける細胞増殖および分化の中に埋め込まれた化学的手がかりを含まないだけでなく、足場は既に、既存のが好ましい。 2008年に死体気管に、患者自身の細胞を播種し^、14を脱細胞化し、若者にメイン左気管支を置き換えるために移植した ^{3。それ以来、グループの数は、大小の動物の心臓15、肝臓16,17、および肺18〜20のための脱細胞足場の生産を報告している。}

我々はまた、小腸脱細胞足場^21を生成するために、同じ方法論を適応している。本明細書に記載された方法の目的は、このような血液供給、元の組織、ならびに腸管腔における陰窩 - 絨毛軸の微視的構造の巨視的特性を維持脱細胞化された腸の行列を生成することである。我々は、この方法論は、最終的に脱細胞化の効率を改善する他の器官のために採用することができると考えている。

プロトコル

1。ラット腸のアイソレーション

1. 1％の抗生物質/抗真菌剤（シグマ、英国）（PBS / AA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（Sigma社、英国）の1 Lの溶液を調製する。 2チューブを蠕動ポンプ（マスターフレックスL / S可変速度）を取り付け。さらに15分間、PBS / AAに続く最高速度で15分間の蠕動ポンプの管を通って70％エタノール（エタノール）を実行します。
2. （英国では、動物の下に内務省ガイドライン（科学的処置）法1986）地元の動物、ガイドラインおよび承認に従って、CO ₂吸入と頸椎脱臼により約250〜350グラムの成体SDラットを安楽死させる。
3. 使用前に手術器具をオートクレーブ。 70％エタノールを用いた動物の腹部にスプレーして拭く。
4. 明確な手術野を確保するために、腹部にxifo恥骨開腹切開を行う。
5. 70％エタノールを噴霧し、ペーパータオルの上に動物の右側に小腸に骨抜き。ターク細胞外マトリックス（ECM）の組織変性の脱水を避けるように連続的にPBS / AAで腸を濡らす電子医療。
6. 腸に向けた大動脈から90°の角度で発生する上腸間膜動脈（SMA）の位置を確認します。大動脈からのSMAに入り、すぐに血管の壁を引き裂く回避するために、針を撤回する27のGカニューレを使用してください。 SMAにカニューレのプラスチックチューブを進め、縫合糸（ビクリル5/0）を使用して固定します。
7. PBS / AAの1ミリリットルを注入することによって、カニューレ挿入を確認してください。カニューレを解除するように、SMAに大動脈近位および遠位を切開する春のはさみを使用してください。
8. 大腸を切開するときに糞便の漏れを回避するために、S状結腸の遠位端に回盲接合部と1つの近位端の上の一（シルク5/0）縫合糸の結び目を配置する。その後、2ノット間の端子回腸および結腸をカットし、大腸を取り外します。
9. 空腸、十二指腸接合部Aで腸をカットNDそれは腹部と持っている可能性のある結合組織の接続から腸を解放。
10. PBS / AAをペトリ皿に小腸を転送します。プラスチック製パスツールピペット（LSL研究所消耗品）で、腸の近位部分にカニューレを挿入し、縫合糸で固定します。それは60ミリリットルの注射器のルアーロック（BD Plastipak）が収まるようにピペットを切った。腸管腔は糞やゴミを除去するために、PBS / AAの60ミリリットルで2回洗浄します。

2。脱細胞化方法論

1. 三方活栓に血管カニューレを接続します。これは、取り扱いを容易にする血管樹上の張力を最小にし、チュービングからの気泡の除去を可能にする。
2. 0.6ミリリットル/時間でマスターフレックスL / S可変速度ローラーポンプを通して脱イオン水（抵抗率18.2MΩ/ cm）の実行を開始します。気泡が前に腸管腔コックを接続するチューブ内に存在しないことを確認してください。いくつかの気泡がステップからのルーメン内に存在してもよい1.9、脱細胞化プロセスを損なう可能性がある。ポンプの速度を変化させ、先端から気泡出口を確保するために慎重にピンセットで組織を処理します。高速が血管ツリーを破損する恐れがありので、このプロセスが終了するまで、血管にカニューレを接続しないでください。
3. 脱細胞化の次の工程は4℃で行われるため、低温室に装置を転送する低温は、組織の分解を最小限に抑えながら細胞の除去を可能にする。あふれソリューションを収集する容器にペトリ皿を置きます。 0.6ミリリットル/時で24時間、腸管腔、脱イオン水で血管樹（抵抗率18.2MΩ/ cm）で両方を灌流。最初の1時間は、すべての接続が安全であることを確認するため、定期的に装置をチェックし、漏れが最小であり、気泡は、腸内に存在しない。
4. 脱イオン水を用いた治療の24時間後、残りのステップであるように、冷蔵室の外に脱細胞化装置を移動室温（RT）で行う。
5. 脱イオン水中の4％溶液300mlを調製するためにデオキシコール酸ナトリウム（Sigma社製、UK）を秤量する。それは経口及び眼刺激性であるように、吸引フード下デオキシコール酸ナトリウムを秤量する。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。溶液は1ヶ月まで4℃で維持することができる。
6. デオキシコール酸ナトリウムを純水解決策を変更し、接続を確認し、任意の気泡を除去し、0.6ミリリットル/ 4時間時間で灌流。
7. デオキシコール酸ナトリウムおよびDNase-Iとの相互作用を避けるために、30分間、PBS / AAとのデオキシコール酸ナトリウムの段階の洗浄に続いて。
8. デオキシ-I（DNアーゼI、Sigma）を秤量し、1M塩化ナトリウム、pH7.4中2000 KU液250ミリリットルを用意。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。このソリューションは、使用直前に調製する必要があり、保存することができません。
9. 0.6ミリリットル/時の速度で、室温で3時間、DNアーゼIで灌流。
10. DNアーゼ-I工程に続いて、転送組織培養フードに足場や皿や楽器を変更してください。これは、無菌操作を使用することが提案されている。
11. 脱細胞化ソリューションのすべての残党が削除されるように30分間、PBS / AAで洗浄する。新しいシャーレに足場を置き、UV架橋剤（Spectroline、米国）に転送。 2滅菌サイクルを実行します。 3日ごとに5％のPBS / AAに格納し、ソリューションを変更します。

結果

成功した脱細胞（ 図1）されると、足場は、天然の腸のいずれかのような巨視的な外観を持っているはずですが、半透明の壁（ 図2A）で。マクロアーキテクチャの保存は、血管ツリーの開通によって明らかである。染料はSMAカニューレを介して注入される場合には、足場全体に均等に分散し、毛細管ツリー（ 図2B）に達するべきである。足場は、核と細胞質材料、DNA定量キットと簡単な組織学的分析を用いて評価することができるものがあってはならない。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E）は、小腸層（ 図3A）を維持しながら、核と細胞質の物質が存在しないことを証明する必要があります。具体的には、内腔側に絨毛および陰窩の維持は、走査型電子顕微鏡（ 図4）は、次のは明らかである。 A例えば、コラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分の保全も予想されるべきである。例えば、マッソントリクローム染色は、足場（ 図3B）にそのまま結合組織が ​​表示されます。

図1。実験計画脱細胞化手続きのタイムライン、PBS / AA：抗生物質-抗真菌を含むリン酸緩衝生理食塩水、NaDeoxy：デオキシコール酸ナトリウム、RT：室温、DNアーゼI：デオキシ-I 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。足場macroscopiC特性で落札脱細胞（A）後のラット小腸の肉眼的外観。ロッソポンソーSMAを通して染料の注入は、完全な血管網（B）を示しています。SMA：上腸間膜動脈は拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。 。組織学H＆E（A）とMT（B）の染色は、結合組織構造の維持と細胞物質が存在しないことを示し、H＆E：ヘマトキシリンおよびエオシン、モンタナ：マッソンの三重。スケールバー：100μmで拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。 。電子顕微鏡走査電子顕微鏡は、足場内腔に保存絨毛-クリプトアーキテクチャを示し、スケールバー：100μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

この実験のセットアップで最も困難なステップは、SMAのカニューレ挿入し、無菌性の確立と維持を必要とする。壁を破壊することなく、げっ歯類ではSMAにカニューレを挿入することにより、容器のサイズと位置に非常に困難な場合があります。代替的に、縫合糸は、SMAにプラスチックカニューレを導く、遠位大動脈自体のカニューレ挿入に続いて、前のSMA原点を近位大動脈の周りに配置されてもよい。脱細胞化中に乏しいカニューレの配置と高流量の組合せは、血管アクセスを失うことを生じ得る。無菌性は、小腸に存在する細菌叢の量に起因する大きな課題となっている。収穫後、PBS / AAで洗浄することは非常に重要であり、糞便や破片の兆候は、内腔から除去されなければならない。無菌性が達成された場合には、UV殺菌、次のインキュベーターにDMEMでファルコンチューブ内の足場の一部を配置する指標である必要があります。際に細菌のコロニー形成のため、メディアはその色が赤から黄色に回しでpHが変化します。これに対処するため、他のUVサイクルが助言だけでなく、PBSで洗浄は抗生物質/抗真菌剤を高濃度に含有している。

血管および静脈アクセスの両方に足場を得ることが可能変更は下大静脈（IVC）と同様に、SMAにカニューレを挿入することであろう。静脈および血管の側から脱細胞化は、すべての3つの解決策を断続的に試みるべきである。連続的な脱細胞化は、両側の正の圧力を有することによって毛細管を破裂することがある。

長年にわたり、in vitroおよびin vivo ^6,9,12 に異なる細胞足場の組み合わせを使用して、腸のTEの取り組みの数があった。仕事の大部分はI型コラーゲンでコーティングした管状^6,7,13,22不織布95％PGA-5％PLGA足場材を用いて行われた。腸では、次の種まき上皮オルガノイド単位（OU）およびマウスの大網への移植の期間、彼らはその後tubularizedすることができ、内側に外側上皮に対する筋肉に嚢胞を形成している。しかし、これらの足場の設計において、多孔性とシンプルさは、このようなバイオリアクターのいるようなインビトロ環境における人工腸の大部分を生成するために許可していません。さらに、さらに、受信者に接続することができ先天的血管網の欠如は、臨床、翻訳のために、この足場の使用を制限する。 PGA-PLGA足場を用いた実験に加えて、他のグループは、腸管の複雑さを複製しない、どちらもコラーゲンやSIS足場を、使用している。 SISは、特に腸組織工学の唯一の以前公開された方法論であり、機械的安定性を提供し、リードしながら、細胞増殖を促進するための脱細胞化スカフォールドの能力を実証し、150以上の医療現場で使用されている無免疫原性応答にING。しかし、適切なマクロとマイクロアーキテクチャの欠如は、腸のTE目的^9-11,23のための「使用中悪い結果につながっている。

我々が説明した脱細胞化手法の利点は、腸の幹細胞ニッチで再増殖のための適切な環境を表すような管腔陰窩 - 絨毛アーキテクチャとして微視的特性の保存が含まれる。巨視的局面では、階層的な血管網の存在は^TE-21腸の全ての層に栄養と酸素の供給を可能にし、受信者に添付ファイルを有効にします。しかも、コラーゲン、エラスチンおよびglyocosaminoglycansなどのECM成分のメンテナンスは、機械的特性だけでなく、細胞増殖および分化を導くだけでなく、重要な役割を有している。最も重要なことは、脱細胞化方法論の能力は、大規模にスケールアップする同じ特性を維持しながらr個の組織はTEの臨床的翻訳のために重要な特徴である。

血管網との自然な腸のマトリックスの開発は、ホストに接続することができ、人工腸の大きなセグメントを作成することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール溶液、H20	Sigma	02877
リン酸緩衝生理食塩水錠剤	Sigma	79382
抗生物質 抗真菌薬溶液 (100x)	Sigma	A5955
デオキシコール酸ナトリウム	ΣD6750		経口および眼刺激性; 保護
塩化ナトリウム
デオキシリボヌクレアーゼI(ウシ膵臓	Sigma	D5025