FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

サマリー

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。

要約

アレナウイルス逆遺伝学の開発と実装は、アレナウイルスフィールド⁴の重要な進歩を表しています。彼らのゲノム内の所定の変異を有する組換え伝染アレナウイルスを生成する機能と一緒にセルベースアレナウイルスミニゲノムシステムの使用は、アレナウイルスのライフサイクルの異なる段階にウイルス決定因子の寄与の調査だけでなく、ウイルスのホストを促進してきたアレナウイルス病因^1、3、11の相互作用とメカニズム。また、trisegmentedアレナウイルスの開発は、このようアレナウイルスベースのワクチンベクター·アプリケーション⁵の可能性を開いて、関心のある付加的な外来遺伝子を発現するアレナウイルスゲノムの利用を許可している。同様に、レポーター遺伝子を発現することができる単一サイクル感染アレナウイルスの開発がhighlて研究の安全性を向上させるために新しい実験ツールを提供Y病原人間アレナウイルス^16。プラスミドに基づく逆遺伝学技術を用いた組換えアレナウイルスの生成は、これまでの食品医薬品局の開発（FDA）認可されたワクチンまたはワクチンベクターのためのいくつかの障害を引き起こし^7,19齧歯類細胞株の使用に頼っている。この障害を克服するために、我々は、FDAが承認したVero細胞における組換えアレナウイルスの効率的な世代はここに記述します。

概要

アレナウイルスは、 アレナウイルス科に属するbisegmented、マイナス鎖RNAゲノム³エンベロープウイルスである。アレナウイルスゲノムは³ 2つの別々のウイルスのセグメントからambisenseファッションの4つのタンパク質をコードしている。大（L）セグメントは、出芽ウイルスの主要な原動力として機能するRNA依存性RNAポリメラーゼ（L）と小RING（実際おきたい新規遺伝子）フィンガータンパク質（Z）をコードする。小（S）のセグメントは、ウイルス核タンパク質（NP）と表面糖タンパク質（GP）（ 図1）をコードする。

アレナウイルス科のいくつかのメンバーは、人間³で致死性出血熱（HF）を担当しています。原理上の問題の入院患者^8、図9において高い死亡を引き起こすことが知られているラッサウイルス（LASV）とフニンウイルス（JUNV）がある。これらのウイルスは、それぞれ西アフリカと農村アルゼンチン、固有種であるが、増加した旅行¹⁰に起因する非流行地域へLASVとJUNVの輸入の増加が懸念される。通常、ヒトの重篤な疾患に関連付けられていないものの、さらに、原型アレナウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）は免疫不全患者^6、15に致命的感染症の場合があったように無視された病原体とみなされ、先天性先天性欠損症と自然流産の責任です妊婦^{2、13インチ}現在アレナウイルスと治療に対して何の米国FDAの承認を受けたワクチンが存在しない部分的にしか有効であり、多くの場合、重大な副作用に関連付けられているヌクレオシドアナログリバビリン、に限定されています。

プラスミドベースのリバースジェネティクス⁴および組み換えアレナウイルス^7、19の世代の導入は大幅アレナウイルス研究の分野を進めてきた。現在、齧歯類細胞（例えば、BHK-21など）GENERのために使用されるSとLのセグメントの初期の転写を誘導する種特異的ネズミRNAポリメラーゼI（POL-I）プロモーターによる換えアレナウイルスのATION。 BHK-21細胞におけるウイルスしかし救助は、潜在的なワクチンシード候補として換えアレナウイルスの生成のための承認された方法ではありません。ここでは、原型旧世界（OW）LCMVと新世界（NW）Vero細胞におけるJUNVスナップ＃1株の効率的な救助のための人間のPOL-Iプロモーターを使用することを文書化します。類似した方法論を用いて、我々は、組換えtrisegmented LCMV（r3LCMV）と2つの異なるS RNAセグメント⁵でエンコードされた二つの追加外来遺伝子が含まれている（＃1 r3Candid）＃1スナップアレナウイルスを生成しました。この新しいシステムでは、再現性の高い、シンプルなプロトコルに従いますが、すぐに潜在的なワクチンまたはワクチンベクターのシードとして換えアレナウイルスの生成で実装することができませんだけ。

プロトコル

1。アレナウイルスレスキューフェ

私達の救助システムは、核タンパク質（NP）、およびRNA依存-RNA-ポリメラーゼ（L）、RNA複製およびアレナウイルスゲノムの遺伝子発現に必要なウイルスのトランス作用因子をコードするポリメラーゼIIのタンパク質発現プラスミドの両方の使用に基づいていた^7、19、およびSとLアンチゲノムRNA種の細胞RNAポリメラーゼ^{I（POL-I）、7}を介して細胞内合成を指示することができるプラスミド、。我々の研究では、私がプロモーターとマウスターミネーター配列（ 図2）人間のポリメラーゼを使用pCAGGsタンパク質ニワトリβ-アクチンプロモーターとpolyadenylanation（PA）シグナル配列を使用して発現プラスミドと、人間POL-Iプラスミドを使用。 S及びL RNAセグメントはHPOL-Iによる転写時のゲノムRNAセグメントの生成を可能にするためにアンチゲノム向きでHPOL-Iプラスミドにクローニングする。野生TYの救助のためにPEの組換えLCMV（rLCMV）とスナップ＃1（rCandid＃1）pCAGGs NPおよび各ウイルスのLは、それぞれのヒトPOL-I SおよびL RNAセグメント（ 図3）と一緒に同時トランスフェクトした。換えtrisegmented LCMV（r3LCMV）、＃1（＃1 r3Candid）スナップ写真の世代は同様のプロトコルに従ったが、S·セグメントは、2つの異なるPOL-I Sプラスミド、各エンコーディング独特レポーター遺伝子に分割されました：1で、NPオープンリーディングフレーム（ORF）は、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子（HPOL-I S GFP / GP）で置換し、他方に、ウイルス糖タンパク質前駆体（GPC）ORFは、 ガウルシフェラーゼ（Gluc）レポーター遺伝子で置換され（HPOL-I S NP / Gluc）。プロトコルの概略図を図4に示されている。次のトランスフェクションおよび感染プロトコルを6ウェルプレートのために確立されている。

1. OptiMEM中-リポフェクトアミン2000（LPF2000）混合：OptiMEM中メディア250μlのを準備し、依存トランスフェクション当たりLPF2000の12μgの（1μgの/μl）を（ 表1） -ウイルス救助、10。 DNAのμgのあたり2.5μgのLPF2000の比率が推奨されます。 RTで10分間 - 5インキュベートする。一方、別のマイクロ遠心チューブ（ステップ1.2）でプラスミドトランスフェクション混合物を準備します。
2. プラスミドDNAのトランスフェクション混合物：各ウイルスの救助のための推奨量（ 表1を参照）を使用して、マイクロチューブにプラスミドのトランスフェクションカクテルを準備します。 OptiMEM中で50μlに、最終容量を持参してください。
3. OptiMEM中-LPF2000-DNAプラスミド混合物：プラスミドDNAのトランスフェクション混合物（ ステップ1.2）にOptiMEM中-LPF2000混合（ ステップ1.1）250μlのを追加します。室温で30分間 - 20で、この混合物をインキュベートする。一方、トランスフェクション反応あたり1×10 ⁶ Vero細胞を準備し、数える。ベロ細胞は、懸濁液中にトランスフェクトされる。
4. Vero細胞の調製：ベロCELLSを100mm皿で培養される。開始する前に、37℃に1×PBS、DMEM 10％FBS、1％PSメディア、トリプシン-EDTA混合物をもたらす
   1. 1X PBS 5mlで、二回、細胞を洗浄。
   2. トリプシン-EDTA 1 mlの細胞をトリプシン処理し、細胞のデタッチ（約5分）になるまで待ちます。ジェントルタップは多分完全に皿から細胞を分離するために必要。
   3. 慎重を15mlの遠心分離管中DMEM、10％FBS、1％PS 10mlの細胞懸濁する。
   4. 遠心分離機で1,000 rpmで5分間、細胞を遠心分離します。
   5. DMEM 10％FBS、1％PS 10mlの細胞を再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントし、1×10 ⁶細胞/ mlの濃度を調整します。トランスフェクション当たり1×10 ⁶個^のベロ細胞最良の結果が得られた-それは0.5ことが観察された。
5. LPF2000/DNA、細胞を混ぜる：20後- 30分室温でのインキュベーション（ ステップ1.3）にVero細胞を1ml（1×10 ^6）（ ステップ1.4）を追加室温で5分間OptiMEM中-LPF2000-DNAプラスミド混合物とインキュベート。
6. シード6ウェルプレートにLPF2000/DNA-cellミックス：6ウェルプレートのウェルにDNA-LPF2000-ベロ混合物（ ステップ1.5）を追加します。ゆっくり6ウェルプレートを振ると℃、5％CO _2、37℃インキュベーターで一晩クションインキュベートしてみましょう。
7. トランスフェクション培地変更：約16から24時間後にトランスフェクションし、トランスフェクションのメディアを取り出し、感染培地2 mlを加え、さらに48時間トランスフェクトされた細胞を培養する。
8. セル通路：感染媒体でのインキュベーションの48時間後、組織培養上清（TCS）を取り外し、100ミリメートル皿にトランスフェクトした細胞を渡す。トランスフェクトされた細胞は、ウイルス粒子を生成するために追加のインキュベーションを必要とするので、TCSはほとんど感染性ウイルスを含まない。セル通路の場合：
   1. 1X PBS 2mlで、二回、細胞を洗浄。
   2. 細胞のwトリプシン処理 i番目の0.5トリプシン-EDTA mlの細胞がデタッチされるまで待ちます。
   3. 1.5 mlのマイクロチューブでDMEM 10％FBS、1％PS 1mlに細胞を再懸濁します。
   4. 5,000 rpmで5分、4℃遠心で細胞を遠心分離します。
   5. 慎重に感染媒体1mlに細胞を再懸濁し、100ミリメートルシャーレに細胞を移す。 8ミリリットル、ウイルスを濃縮するためだけでなく、細胞の乾燥を防ぐために十分なボリュームに、感染媒体と、プレートの総容積を持ち出す。
9. ゆっくりと100ミリメートル皿を振ると72時間℃で、5％CO _2、37℃インキュベーター内でVero細胞のインキュベーションを続ける。
10. TCSのコレクション：72時間のインキュベーション後、15ミリリットルの遠心チューブにTCSを収集します。遠心分離機で2,500 rpmで5分間遠心分離することによって細胞の破片を取り除きます。アレナウイルス感染がTCSで発見されているので、細胞破片ペレットから削除して、-80℃でTCSを保管℃に

組み換えアレナウイルスレスキュール "> 2。確認

rLCMVとrCandid＃1の成功救助の検出は、焦点形成ユニット（FFU）免疫蛍光アッセイ（IFA）によって達成される。野生型ウイルスの救助のために我々はウイルスのNPに特異的な抗体を使用しています。 r3LCMVとr3Candid＃1は、このように蛍光顕微鏡（GFP）および/または発光（Gluc）によって抗体を必要とせずに、ウイルス検出や滴定を可能にし、2のレポーター遺伝子（GFPとGluc）エンコード。

1. 野生型組換えアレナウイルス救助確認： - 90％コンフルエントに翌日（4×10 ⁴細胞/ウェル）滴定の前日を、PBSで2回Vero細胞を洗浄し、80に到達する96ウェルプレートをトリプシン処理し、準備します。優しく細胞の制服を着た分布を得るために手でプレートを振る。文化細胞、一晩、37℃のインキュベーター5％CO ₂で。感染症に進む前に、単層を確認するために、顕微鏡下で細胞を確認します。
   1. シリアル希釈（10倍希釈）ウイルス含有TCSはOptiMEM中さ100mmディッシュ（ ステップ1.10）でトランスフェクションされた細胞から回収した。
   2. 播種ベロ細胞からメディアを取り出し、1×PBS50μlので二回洗い、希釈したウイルス（ ステップ2.1）50μlの細胞に感染。 37℃および5％CO _2を 1.5時間細胞に感染。
   3. 感染後、ウイル​​ス接種を削除100感染媒体のμL/ウェルを加え、16細胞をインキュベート - 18時間。ウイルスの再感染は、ウイルス力価の過大評価につながる可能性がある、18時間のインキュベーション後に発生する可能性があります。
   4. 16時 - 18時間感染後、各ウェルからTCSを除去し、室温で15分間、1×PBSで希釈し、4％ホルムアルデヒドで細胞を固定します。
   5. 次に、定着液を除去し、細胞を透過性に0.1％のトリトンX-100、室温で10分間、1×PBSで希釈した。
   6. 透過液を吸引し、3回のWi細胞を洗浄番目1X PBS。
   7. RTで1時間1×PBS（ブロッキング溶液）で2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞を遮断する。あるいは、細胞を4℃で一晩ブロックし、抗体のインキュベーション翌日に継続することができる。
   8. 一方、一次抗体を作製。ブロッキング溶液内LCMVと率直＃1-特異的な一次抗体を希釈した後、3,500 rpmで15分間/ブロッキング溶液抗体を遠心。 BEIリソース（1:500希釈）からのモノクローナル抗LCMV NP抗体クローン1.1.3（1：30希釈^）16及びモノクローナル抗JUNV NP抗体SA02-BG12はrLCMVとrCandid＃1の検出のために用いることができるそれぞれ。
   9. 1時間のインキュベーション後、ブロッキング液を吸引し、細胞への一次抗体を50μlを加え、37℃で1時間インキュベート℃で
   10. この時点で、ブロッキング溶液に二次抗体を希釈した後、3,500 rpmで15分間抗体/ブロッキング溶液を遠心する。ポリ一次モノクローナル抗体の検出のためのクローンウサギ抗マウスIgG二次抗体をFITCは、 図5で観察画像を得るために使用された。
   11. 1時間のインキュベーション後、1×PBSで3回洗浄し、一次抗体を吸引し、37℃で30分間、二次抗体を加え℃で
   12. 30分間のインキュベーションの後、二次抗体を吸引し、1×PBSで3回洗浄する。細胞は両方ミリリットル（FFU / ml）を形成単位焦点をカウントによるウイルス救助や滴定の成功を決定するために、蛍光顕微鏡を用いて観察することが今準備ができています。
2. r3LCMV、＃1 r3Candidウイルスのレスキュー：これらのウイルスは、2つのレポーター遺伝子を発現するので、それらは、GFPの発現またはTCSでGluc発現を検出するために蛍光顕微鏡法によってモニターすることができる救う。救助はまた、TCSのGlucの発現によって確認することができる。 trisegmentedウイルスを滴定するために、我々はステップ2.1〜2.1.4に従って、しかし、細胞がBにする必要はありませんeはためGFP発現の正常なウイルスの救出を決定するために修正しました。ウイルスの力価測定は、FFU / mlに計数することによって決定される。 Gluc発現による成功ウイルス救出を決定するには、TCSからGluc式がGlucアッセイキット（Biolux ガウルシフェラーゼアッセイキット、New England Biolabs社）を用いて測定することができる。そのために：
   1. 96ウェルホワイトプレートにTCSのピペットで100μlの（平底マイクロタイタープレート、フィッシャーサイエンティフィック）。
   2. ルミノメーター（LumiCount、パッカードBiosciences）を設定します。
   3. 各サンプルに100μlのGlucアッセイ溶液（としてメーカーが推奨）とルミノとGlucレポーター遺伝子発現を測定 - 50を追加します。陰性対照として、野生型ウイルス感染細胞からのTCSのGluc発現を測定した。

3。組織培養上清のパッセージ

ウイルスの救助はトランスフェクション効率に依存します。 Vero細胞が示されている他の細胞株¹⁴よりも低いトランスフェクション効率を持っている。 TCS中のウイルス力価が低い場合には、ウイルスを増幅するために72時間0.01（LCMV）または0.1（＃1スナップ写真）の感染多重度（MOI）で新鮮なVero細胞に感染する。

結果

組換え野生型アレナウイルスの成功救助はIFAます（ 図5）を使用してウイルス抗原の存在によって確認されます。組換えウイルスtrisegmented、成功したウイルスのレスキューの場合、蛍光顕微鏡（ 図6A）によってGFP発現を観察することにより評価することができる。成功した救助はさらにGluc式（ 図6B）を評価することによって確認される。野生型およびtrisegmentedアレナウイルスの正常な救助を示す代表的な結果は、上述したプロトコルを使用して得られた。

図1。アレナウイルスゲノム組織とビリオン構造。アレナウイルスはbisegmentedゲノム³と包まれ、マイナスセンスRNAウイルスである。各セグメントは、2つのウ...

ディスカッション

プラスミドベースの逆遺伝学的手法を用いて組換えアレナウイルスの生成は、アレナウイルス生物学のさまざまな側面の研究のために広く使われているアプローチとなっています。ここでは、アレナウイルスを実行して、現在のシステムに不可欠な改善を文書化し、他の感染症に対するアレナウイルスとワクチンベクターに対するFDAの承認を受けたワクチン候補の電位発生を可能にし、Vero細胞で救う。

関係する実験手順は、一般的に十分に確立されており、重要なハードルをもたらすべきではありません。慎重に一貫した成功を確実にするために監視されるべきいくつかの要因が、しかし、存在する。 Vero細胞の適切なメンテナンスが成功ウイルス救助のために極めて重要である。さらに、それは（適切な細胞の維持やプラスミド調製のためのプロトコルを参照してください）組換えアレナウイルスを生成するために良好なプラスミド調製を持っていることが不可欠です。 rLCMVとrCandiの救助のためにD＃1野生型またはそれらのtrisegmentedバージョンはVero細胞を簡単に^14をトランスフェクトされていな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料と方法
細胞株 Vero E6(アフリカミドリザル腎臓上皮細胞)は37°Cで維持されています。DMEM 10 % FBS 1 % PS< 5 % CO>sub2 の C インキュベーター 細胞は、American Type Culture Collection (ATCC, カタログ番号 CRL-1586). Plasmids hpol-I L を除くすべてのプラスミドを 37 °C で増殖できます。C、16-18時間。hpol-I Lの培養物は30°Cで培養することをお勧めします。Cを24時間使用します。プラスミドは、プラスミドマキシキット(EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit、Omega Bio-tek)を使用して、メーカーの推奨に従って調製され、-20°Cで保存されます。精製されたDNAプラスミドの濃度は、260 nmの分光光度法によって決定され、純度は260:280 nmの比率を使用して推定されます。1.8-2.0 260:280 nmの比率の調製物は、ウイルスレスキューの目的に適していると考えられています。さらに、プラスミドの濃度と純度は、アガロースゲル電気泳動で確認する必要があります. Viruses rLCMV(Armstrong 53b)およびrCandid#1を救助するための記載のプロトコルは、バイオセーフティレベル(BSL)2条件下で実行できます。TCSや細胞などの汚染された物質は、廃棄する前に滅菌する必要があります。他のアリーナウイルスの救助には、より高いBSL施設が必要になる場合があるため、適切な安全/セキュリティ対策に従う必要があります. Tissue culture culture culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml のウシ胎児血清 (FBS)、および 5 ml の 100X ペニシリン/ストレプトマイシン (PS)。4°Cで保管してください。この培地は、Vero細胞のメンテナンスに使用されます。 Infectious Media: OptiMEMとDMEMの2対1の混合物 10 %FBS 1 %PS. 4°Cで保存します。この培地はウイルス感染中に使用されます. 10Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS):NaCl80 g、KCl2 g>、NaHPO4.7H2O、 KH2PO4 2g。ddH2Oを1リットルまで追加します。pHを7.3に調整します。オートクレーブで滅菌します。室温で保存します。 1X PBS: 10X PBS 1:10をddH2Oで希釈します。オートクレーブで滅菌し、室温で保存します。 2.5% BSA:1X PBSの97.5mlにBSAの2.5g。4°Cで保管してください。これは、IFA のブロッキング ソリューションとして使用されます。