蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

Summary

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。

Abstract

ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を適用すると、サンプル内の個々の蛍光標識単分子の分布の空間マップ(画像)を数十ナノメートルの空間分解能で取得できます。蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)は、目的のタンパク質に融合した光活性化可能(PAFP)または光切り替え可能(PSFP)の蛍光タンパク質、または抗体やその他の目的分子に結合した有機色素を使用して、単一細胞内の複数種の分子を同時にイメージングできます。以下のアプローチを用いることで、多数の(数千から数十万)の個々の分子の集団を単一細胞でイメージングし、10~30nmの精度で局在化します。得られたデータは、細胞内の複数のタンパク質タイプのナノスケールの空間分布を理解するために適用できます。この技術の主な利点の1つは、空間分解能の劇的な向上です:従来の光学顕微鏡では回折によって分解能が200~250nmに制限されますが、FPALMは長さのスケールを一桁以上小さくすることができます。多くの生物学的仮説は異なる生体分子間の空間的関係に関係しているため、FPALMの分解能の向上は、従来の蛍光顕微鏡ではアクセスできなかった細胞組織の問題に対する洞察を提供することができます。ここでは、サンプル調製とデータ取得の方法について詳しく説明するだけでなく、FPALMの光学セットアップについても説明します。超解像顕微鏡法を希望する研究者にとってのもう1つの考慮事項はコストです:社内のセットアップは、ほとんどの市販のイメージングマシンよりも大幅に安価です。この手法の限界には、細胞サンプル内の目的分子の標識を最適化する必要性や、結果を視覚化するための後処理ソフトウェアの必要性などがあります。ここでは、PAFPおよびPSFP発現を使用して、固定細胞内の2つのタンパク質種をイメージングする方法について説明します。また、この技術の生細胞への拡張についても説明する。

Introduction

細胞構造は広範囲の空間スケールで存在しますが、回折限界の物理的制約により、~250 nm未満の長さスケールでの細胞組織の蛍光イメージングは従来の顕微鏡では制限されています。この限界は、蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM¹)や類似の技術^2,3の出現により克服され、多数の個々の分子を~10 nmの精度で局在化し、数十ナノメートルの分解能で画像を生成できます。FPALMは、光学制御を使用して分子のサブセットを活性化および不活性化することに基づいています(FPALMの詳細な説明、およびこのイメージングシステムの実装方法については、Gould et al.⁴)この技術により、単一分子の全集団の空間分布をマッピングすることができ、数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さスケールで生体構造を解明することができます。ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡法(以下、ローカリゼーション顕微鏡法と呼ぶ)は、現在、さまざまな生物学的問題に対処するために適応されており、技術開発により、例えば、偏光FPALMによる個々の分子配向のイメージング、またはP-FPALM5、複葉剤FPALM6または他の技術^7-9による3次元の単一分子の蛍光イメージングが可能になったローカリゼーション顕微鏡は、生細胞^10-12における単一分子の超解像蛍光イメージングにも適用されています。ローカリゼーション顕微鏡....

Protocol

注意: このプロトコルで参照される光学コンポーネントの図表を図 1 に示します。

1. 細胞サンプル調製

1. 8ウェルチャンバーのウェル内で最適化された密度(NIH-3T3細胞の場合、これは約2-5 x 10⁴細胞/cm²)のプレートセル。細胞は、細胞タイプに適した完全な培地に播種する必要がありますが、培地は抗生物質やバックグラウンド蛍光の原因となるフェノールレッドを使用せずに作製する必要があります。継代数の最適な範囲など、細胞実験の条件は、個々の細胞株ごとに異なる場合があることに注意してください。
2. 細胞を37°Cおよび5%CO₂(または細胞タイプに適した条件)で24時間インキュベートし、細胞がカバーガラスに付着できるようにします。2つのタンパク質種コンストラクトのそれぞれについて、エンドトキシンフリーDNAで細胞をトランスフェクションします(この場合は、PAmCherry-actinおよびDendra2-HAのDNA)。アルミホイルなどの光不透過性材料でサンプルを覆います。トランスフェクションには、DNAコンストラクトの両方を含むウェルと、これらのコンストラクトのそれぞれ1つだけを含むウェルを含める必要があります。
3. 4〜6時間、37°C、5%_CO2(または細胞タイプに適した条件)でインキュベート....

Results

インフルエンザ赤血球凝集素(HA)は、数十ナノメートルからマイクロメートルのオーダーでクラスターを形成し、これらのクラスターはアクチンと可変的に共局在します(図5)。これらの空間分布は、これら2つのタンパク質のより粗いスケールのイメージング²⁸、およびHA空間分布のアクチン¹⁹への依存性を裏付けるものである。マルチカラーFPALM画像は、これらのクラスターの密度、面積、周囲長、およびナノスケールとマイクロスケールの両方での2つの種間の共局在の程度を記述するためにさらに使用できる。得られる画像の解像度は数十ナノメートルのオーダーです^1,17;ここで示すレンダリング画像では、画像上の個々の点は、20 nmの精度で、単一の標識タンパク質分子の局在化を表しています。透過光源を使用して全FOVの画像をさらに取得することにより(図6)、FPALM画像は細胞全体とその周辺環境のコンテキストで見ることができます。

上記のように2つの色設定で記録された画像(

Discussion

ローカリゼーションベースの超解像イメージングは、生物学的イメージングに多くの強力な機能を提供します。テーブル上に配置された個々の光学部品から、生体サンプル中の複数の蛍光種を同時にイメージングできる機能的な超解像顕微鏡までのルートには、多くの課題があります。アライメントの一部の側面は、他の側面よりも重要です。以下では、ルートの最も困難な側面に対処する将来のユーザーにガイダンスを提供するよう努めます。

重要なステップ

FPALMや同様の技術によって提供される画像解像度の向上には、顕微鏡の安定化にもっと注意を払う必要があります。従来の顕微鏡画像は、~20〜50 nmのスケールでのサンプルドリフトや振動運動(振動)によって目に見えて歪むことはありませんが、超解像顕微鏡画像はそのような動きによって劣化します。たとえば、不要な動きの原因には、顕微鏡およびサンプル内の熱勾配、エアテーブルに取り付けられた機器の冷却ファン、顕微鏡ステージまたはエアテーブルへの物体の不注意な接触、および建物内の振動(空気処理装置やその他の機械によって引き起こされる可能.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek IIチャンバー	Nunc
蛍光ビーズ	Invitrogen	F-8801	キャリブレーション用ビーズ
テトラスペックビーズ	Invitrogen	T-7279	キャリブレーション用4色ビーズ
対物レンズ 浸漬油	ツァイス	518F	高NA対物レンズ用浸漬オイル(対物レンズの選択による)
HPLCウォーター	フィッシャー科学	W5-4
媒体	ATCC	30-2003	またはCellgro 10-090
抗生物質	GIBCO	15070-063
血清	Thermo Scientific	SH30087.03
リポフェクタミン	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
トリプシン	MPBiomedicals
パラホルムアルデヒド	フィッシャーサイエンティフィック	AA433689M	注意:有毒