蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

Summary

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。

Abstract

ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を適用すると、サンプル内の個々の蛍光標識単分子の分布の空間マップ(画像)を数十ナノメートルの空間分解能で取得できます。蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)は、目的のタンパク質に融合した光活性化可能(PAFP)または光切り替え可能(PSFP)の蛍光タンパク質、または抗体やその他の目的分子に結合した有機色素を使用して、単一細胞内の複数種の分子を同時にイメージングできます。以下のアプローチを用いることで、多数の(数千から数十万)の個々の分子の集団を単一細胞でイメージングし、10~30nmの精度で局在化します。得られたデータは、細胞内の複数のタンパク質タイプのナノスケールの空間分布を理解するために適用できます。この技術の主な利点の1つは、空間分解能の劇的な向上です:従来の光学顕微鏡では回折によって分解能が200~250nmに制限されますが、FPALMは長さのスケールを一桁以上小さくすることができます。多くの生物学的仮説は異なる生体分子間の空間的関係に関係しているため、FPALMの分解能の向上は、従来の蛍光顕微鏡ではアクセスできなかった細胞組織の問題に対する洞察を提供することができます。ここでは、サンプル調製とデータ取得の方法について詳しく説明するだけでなく、FPALMの光学セットアップについても説明します。超解像顕微鏡法を希望する研究者にとってのもう1つの考慮事項はコストです:社内のセットアップは、ほとんどの市販のイメージングマシンよりも大幅に安価です。この手法の限界には、細胞サンプル内の目的分子の標識を最適化する必要性や、結果を視覚化するための後処理ソフトウェアの必要性などがあります。ここでは、PAFPおよびPSFP発現を使用して、固定細胞内の2つのタンパク質種をイメージングする方法について説明します。また、この技術の生細胞への拡張についても説明する。

Introduction

細胞構造は広範囲の空間スケールで存在しますが、回折限界の物理的制約により、~250 nm未満の長さスケールでの細胞組織の蛍光イメージングは従来の顕微鏡では制限されています。この限界は、蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM¹)や類似の技術^2,3の出現により克服され、多数の個々の分子を~10 nmの精度で局在化し、数十ナノメートルの分解能で画像を生成できます。FPALMは、光学制御を使用して分子のサブセットを活性化および不活性化することに基づいています(FPALMの詳細な説明、およびこのイメージングシステムの実装方法については、Gould et al.⁴)この技術により、単一分子の全集団の空間分布をマッピングすることができ、数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さスケールで生体構造を解明することができます。ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡法(以下、ローカリゼーション顕微鏡法と呼ぶ)は、現在、さまざまな生物学的問題に対処するために適応されており、技術開発により、例えば、偏光FPALMによる個々の分子配向のイメージング、またはP-FPALM5、複葉剤FPALM6または他の技術^7-9による3次元の単一分子の蛍光イメージングが可能になったローカリゼーション顕微鏡は、生細胞^10-12における単一分子の超解像蛍光イメージングにも適用されています。ローカリゼーション顕微鏡は、固定細胞^13-16の複数の種のイメージングにも適用されています。最近、3つのタンパク質種が固定細胞と生細胞の両方でFPALMで同時にイメージングされました¹⁷。ローカリゼーション顕微鏡は、さまざまな方法で標識されたサンプルをイメージングできます。 例としては、PAFPまたはPSFP融合タグで発現したタンパク質、ケージ入り有機色素で標識した抗体または分子、または従来の有機色素が含まれます。従来の蛍光色素の使用は、融合タンパク質タグの不在下でのタンパク質の標識を可能にする一方で、超解像イメージングにおける非ケージ有機色素の使用に一般的に必要とされる条件では、サンプルを還元バッファーに浸漬する必要があります². さらに、抗体色素複合体の細胞内送達では、通常、細胞を固定し、その膜を透過処理する必要があります。 または、生細胞がエレクトロポレーションまたはその他の手段によって透過性にする必要があります。バッファー条件と膜透過化を減らすための要件により、有機色素の生細胞イメージングへの適合性は制限されますが、最近の開発により、HaloTagとFPALMを膜構造のイメージングに効果的に使用できるようになりました¹⁸。

FPALMは、生細胞に適用された最初の局在化顕微鏡技術でした¹⁰。生細胞では、標識された分子の位置の時間依存的な空間マップを提供するだけでなく、FPALMは複数のフレームにわたって単一分子を追跡し、ミリ秒の時間スケールで決定された分子の軌跡を追跡することができます¹⁹。したがって、FPALMは、かなり短い時間スケールとナノスケールの分解能へのアクセスを提供します。

Multicolor FPALMは、光活性化可能なタンパク質や有機ケージまたはノンケージ色素など、さまざまなプローブに使用できます。ここでは、2つの蛍光タンパク質種、Dendra2およびPAmCherryの同時イメージングのためのプロトコールとセットアップについて詳しく説明します。NIH-3T3線維芽細胞において、βアクチンに結合したPAmCherry(PAmCherry-actin)とインフルエンザ赤血球凝集素に結合したDendra2(Dendra2-HA)をイメージングした結果を報告する。セットアップで説明されているコンポーネントは、他のプローブのイメージングにより適した他のハードウェアと交換できます。この場合、テキストで明示的にするように努めました。

Multicolor FPALMは、生細胞または固定細胞内の複数のタンパク質種の空間分布を報告するのに理想的です。この手法は、ナノメートルの長さの空間スケールでの空間的および/または動的な関係の調査に特に適していますが、画像は数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さのスケールで局在を報告します。マルチカラーFPALMの主な利点の1つは、セットアップが比較的安価に構築でき、さまざまなプローブの組み合わせに非常に柔軟に使用できることです。コンポーネントからシステムを構築し、キャリブレーションするプロセスでは、データの品質と解釈可能性、ひいては研究成果を損なう可能性のある要因についても、かなりの理解を得ることができます。ここでは、FPALMを使用して、PSFPおよびPAFP融合コンストラクトを使用して、複数のタンパク質種の光学セットアップ、サンプル調製、およびデータ取得の方法について詳しく説明します。このプロトコルは固定細胞の分析を説明していますが、これらの手順は生細胞のイメージングに容易に適用できます。

ここで説明する光学セットアップは、PSFP Dendra2 と PAFP PAmCherry の同時イメージングに最適です。他の多くのプローブをマルチカラーイメージングに使用できます。ただし、必要な正確なコンポーネントは、選択したプローブの励起スペクトルと発光スペクトルによって異なる場合があります。ダイクロイックミラー、フィルター、レーザー波長の選択は、これらの考慮事項に基づいて行う必要があります。

Protocol

注意: このプロトコルで参照される光学コンポーネントの図表を図 1 に示します。

1. 細胞サンプル調製

1. 8ウェルチャンバーのウェル内で最適化された密度(NIH-3T3細胞の場合、これは約2-5 x 10⁴細胞/cm²)のプレートセル。細胞は、細胞タイプに適した完全な培地に播種する必要がありますが、培地は抗生物質やバックグラウンド蛍光の原因となるフェノールレッドを使用せずに作製する必要があります。継代数の最適な範囲など、細胞実験の条件は、個々の細胞株ごとに異なる場合があることに注意してください。
2. 細胞を37°Cおよび5%CO₂(または細胞タイプに適した条件)で24時間インキュベートし、細胞がカバーガラスに付着できるようにします。2つのタンパク質種コンストラクトのそれぞれについて、エンドトキシンフリーDNAで細胞をトランスフェクションします(この場合は、PAmCherry-actinおよびDendra2-HAのDNA)。アルミホイルなどの光不透過性材料でサンプルを覆います。トランスフェクションには、DNAコンストラクトの両方を含むウェルと、これらのコンストラクトのそれぞれ1つだけを含むウェルを含める必要があります。
3. 4〜6時間、37°C、5%_CO2(または細胞タイプに適した条件)でインキュベートしてから、完全な培地(抗生物質を含む、フェノールレッドを含まない)に変更し、さらに16〜48時間インキュベートして、細胞が目的のタンパク質を発現できるようにします。
   1. 細胞を固定するには、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、次に4%パラホルムアルデヒド(PFA)(注意:有毒)とPBSで室温で15分間インキュベートし、さらにPBSで3回洗浄します。しかし、目的のタンパク質によっては、この固定により、まだ運動性のあるタグ付き分子のかなりのプールが生じる可能性があります。移動度をさらに低下させるために、代替の固定方法には、冷却した100%メタノール、またはPBS中の0.2%グルテアルデヒドと4%PFAを25°^C20で>30分間使用することが含まれる。いずれの方法においても、細胞は上記のようにPBSで洗浄すべきである。グルテルアルデヒドの使用は、一部のイメージング条件下でバックグラウンド蛍光または自家蛍光を増加させる可能性があり、水素化ホウ素ナトリウムによる固定後治療が必要になる場合があることに注意してください²¹。
4. サンプルは4°Cに保持し、PBSに浸し、セルフシールフィルムに密封してからイメージングする前に最大7日間保存できます。

2. 顕微鏡のアライメント

1. キャリブレーションスケール(レチクル)を顕微鏡ステージに置きます。10倍の対物レンズと透過光用のランプを使用して、レチクルを視野(FOV)の中央に配置します。
2. ケーラーイルミネーション。 顕微鏡をケーラー照明²²に調整します。まず、視野絞りを閉じ、接眼レンズを通してレチクルに焦点を合わせます。フィールドアパーチャの端に焦点が合っていない場合は、フィールドアパーチャとレチクルの両方にピントが合うまでコンデンサーの高さを調整します。
3. 視野絞りの横方向の位置を、FOVに対して中央に配置されるまで調整します。レチクルの中央のグリッドのみが照らされるまで、フィールドアパーチャを閉じます。
4. カメラの位置を粗く位置合わせする場合(つまり、セットアップを初めて位置合わせする場合)は、カメラのシャッターを閉じた状態でランプの強度を高くし、ステップ2.5に到達するまでボックスB(図1)にコンポーネントを光路に配置しないでください。カメラを最初に位置合わせするときは、L2とL3を検出経路に置かないでください。カメラの垂直位置と水平位置を調整して、レチクル画像をカメラのシャッターのほぼ中央に配置します(図2B)。EMゲインを無効にし、部屋の照明をオフにして、カメラのシャッターを開きます。
5. ランプの強度をカメラセンサーが損傷しないレベルまで下げた後、レチクル画像からの光を直接カメラセンサーに投影します(図2A)。顕微鏡のフォーカスノブを調整してレチクルの焦点を合わせ、取得ソフトウェア内のライブビデオモードで画像を表示します。カメラの垂直位置と水平位置を調整して、レチクル画像をカメラセンサーの中央に配置します(図2B)。
6. L2とL3を絞りとカメラの間の検出経路に配置します(図2C)。L2 が顕微鏡出口ポートの焦点から 1 焦点距離、L3 がカメラ センサーから 1 焦点距離になるように、L2 と L3 を位置合わせします。L2 と L3 の間の距離は、理想的には L2 と L3 の焦点距離の合計と等しくなければなりませんが、スペースの制約に対応するために多少調整できます。カメラとレンズは、出口ポートと同じ高さにする必要があります。
7. 顕微鏡から放出される光は、L2とL3の中心にある必要があることに注意してください。L2と顕微鏡の間の距離を調整して、レチクル画像がカメラと接眼レンズの両方でシャープに焦点が合っていることを確認します。
8. 必要に応じて、L2 と L3 の小さな平行移動 (<1 mm など) を使用して、レチクル画像をカメラ センサーの中央に配置できます。
9. 2色モジュール。カメラの位置が最適化されたら、ボックスB(図1)に示されているコンポーネントを検出パスに貼り付けます。これらのコンポーネントは取り外し可能なマウントに貼り付けることができるため、モジュール全体を挿入してマルチカラーFPALMに使用したり、モジュールを必要としない他のFPALMアプリケーション用に取り外したりすることができます。
10. これらのコンポーネントを初めて組み立てるときは、各チャネルのパス長を等しくなるように調整します。レチクルをカメラチップに投影し、M7とM9を調整するか、検出絞り(AP)を閉じて、2つのチャンネル間の空間的な重なりを防ぎます。レチクルの画像に反射光チャネルの焦点を合わせます。
11. 透過光チャンネルの画像にピントが合っていない場合は、レチクル画像が両方のチャンネルで同時にピントが合うまでM9を平行移動(および必要に応じて回転)します。2つのチャネルは互いに横方向にずらす必要があることに注意してください(図2D)。この変位は、水平であろうと垂直であろうと、取得速度に影響を与える可能性があります。詳細については、カメラのユーザーズマニュアルを参照してください。
12. レチクルスケールのスナップショットを記録します(後で全体の倍率を計算するときに使用します)。カメラソフトウェアを使用して、目的の関心領域を選択します。通常、関心のある領域が小さいほど、より高いフレーム レートが可能になります。

3. レーザーアライメント

1. 読み出しレーザーとアクティベーションレーザーをオンにします。(注意:レーザーは、オペレーターがレーザー安全トレーニングを受けた後にのみ使用する必要があります。ラボへのすべてのドアは閉めたままにし、レーザーが整列している間、訓練を受けた重要な人員のみがラボ内に配置する必要があります。SH1とSH2を使用して、使用しないときは読み出しビームと活性化ビームをそれぞれブロックし、NDフィルターを使用してレーザーパワーを安全なレベル(<1 mW)に減衰させます。アライメント中は、安全に必要な照明を除き、すべての部屋の照明を最小限に抑えると便利です。
2. アクティブ化ビームと読み出しビームをブロックします。レーザーパスからL1を取り外します。
3. 白いカードをM4と同じ高さに置きます。市販のほとんどの複合顕微鏡には、入射光を遮るシャッターが内蔵されています。可能な場合は、顕微鏡のシャッターを開き、レチクル画像がM4に投影されるまでピントを合わせます。内部顕微鏡シャッターが利用できない場合は、すべてのレーザービームが顕微鏡に入るのを防ぐ便利な場所で外部シャッターを使用してください。
4. FOV内の読み出しレーザーをセンタリングします。読み出しビームのブロックを解除します。M1 を調整して、読み出しビームを M4 のレチクル画像の十字線の中央に配置します。
5. レチクル イメージを M5 に投影し、ビームが M5 のイメージ十字線の中心に来るまでミラー M4 を調整します。読み出しビームが M4 と M5 の両方でレチクルの十字線の中心に来るようにします。読み出しビームをブロックします。
6. FOV内の芯出し活性化レーザー。レチクル画像をM3に投影し、レーザー光路からビームエキスパンダー(BE)を取り外します。アクティベーションビームのブロックを解除します。
7. M2 を調整して、アクティブ化ビームを M3 のレチクル画像の十字線の中央に配置します。中央に配置したら、MBE を M2 と M3 の間で交換し、ビームが M3 のレチクル画像の十字線の中央に配置されるまで BE の位置を調整します。
8. 10倍対物レンズを使用して、レチクル画像をM5に投影し、必要に応じて顕微鏡のフォーカスノブを調整してピントを合わせます。DM1の角度を調整して、放射光がレチクル像の中心に来るようにします。両方のビームをブロックします。
9. 対物レンズがなく、顕微鏡のシャッターが開いている状態で、読み出したレーザーを顕微鏡の背面開口部から投影します。(注意:この手順は、平行レーザービームをブロックされていない垂直経路に向けることにより、レーザーの安全上の問題を引き起こします。ビームが顕微鏡からまっすぐ出て真上の天井に着地するまで、またはタレットの対物レンズマウントに配置されたカードの中央に着地するまで、M5を調整します。
10. オプション:正しいアライメントの決定は、溶液中の染料のサンプル(この場合、ローダミンBを水または深さ>視覚目的で0.5cm)の~100μMの水またはメタノールに使用し、60倍対物レンズを所定の位置にしてサンプルステージに置くことで容易になります。ビームが正しく位置合わせされている場合、対物レンズは対物レンズと顕微鏡の軸に整列した蛍光円錐を投影します。対物レンズの後部開口部にレーザービームの配置がわずかにずれると、コーンが純粋に垂直な位置合わせから離れて傾きます。
11. 両方のビームをブロックします。L1を対物レンズの後部開口部から適切な距離(つまり、1つの焦点距離)でレーザー光路に取り付けます。60X対物レンズを所定の位置に設置し、読み出しビームを天井に投影します。L1の水平位置と垂直位置(レーザー伝搬方向に垂直)を調整して、ビームが顕微鏡の中央に配置されるまで調整します。注:このステップでは、ビームは前のステップよりも大きなスポットを形成します。
12. L1の軸方向位置とその焦点距離は、サンプルの照らされた領域のサイズに影響します。厳密に言えば、サンプルでの照明プロファイルの計算は、回折を考慮しなければならない²³。しかし、大まかに言えば、L1を対物レンズの後焦点面から1焦点距離以外の軸距離に配置すると、多くの場合、L1が後焦点面からちょうど1焦点距離にある場合よりも小さく、より強いレーザー照明プロファイルが生じる。照らされた領域を小さくすることで、高速イメージングなどの特定のアプリケーションでより高いレーザー強度を生成できます。
13. 読み出しビームプロファイルの測定。L1 を所定の位置に配置した状態で、適切な濃縮色素溶液(この場合は、水中で ~100 μM のローダミン B)のサンプルをステージ上に置きます。
14. 活性化レーザーをブロックした状態で、読み出しレーザーを 60X 対物レンズを通じて 60X 対物レンズに投影し (ND1 を調整して出力 <<露光されたすべてのビームで 1 mW) を取得し、(EM ゲインを無効にして) この画像をカメラに送信します。
15. 対物レンズをサンプルに焦点を合わせます。このステップでは、ビームプロファイル全体をイメージングするために十分な大きさのアパーチャが必要です。
16. ビーム プロファイルと AP の中心が同心になるように、AP を横方向に移動します。カメラソフトウェアを使用して、関心領域を選択し、両方のチャンネルをカプセル化する最小のカメラ読み出し領域を許可します。これらの座標を記録します。1 つのスナップショットを記録します (これが読み出しビーム プロファイルです)。
17. 焦点面でのレーザープロファイルをより正確に反映する画像は、色素溶液サンプルができるだけ薄い場合に取得されます。このような薄いサンプルは、顕微鏡スライドとカバースリップの間に~5 ulの色素溶液を一滴垂らすことで作成できます。
18. 放射光ビームプロファイルの測定。読み出しレーザーをブロックします。活性化レーザーをサンプルに投影します。そして、この画像をカメラに投影します。
19. 必要に応じて、EMゲイン<100を使用し、ビームが各FOVの中心に来るまでDM1を調整します。活性化ビーム プロファイルのスナップショットを記録します。
20. 各ビームの出力を測定します。 染料溶液を取り出し、パワーメーターセンサーを60X対物レンズの上に置きます(液浸媒体なし)。各ビームの出力(活性化と読み出し)を個別に測定します。出力されたすべてのレーザーパワーがパワーメーターセンサーに当たるように、パワーメーターの位置を慎重に調整する必要があることに注意してください。
21. 各レーザーについて、ND1およびND2のNDフィルターを使用して、実験に適したサンプルで強度が得られるように出力を調整します。
22. 画像取得のための読み出しレーザーの強度。読み出しレーザー強度は、数フレームの時間内に単一分子を励起して光漂白するのに十分な高さにする必要があります。典型的な値は 10^{3-10 4} W/cm² です (Gould et al.⁴). サンプルの強度は画像領域のサイズに依存するため、目的の強度を達成するために必要な電力はシステムによって異なります。
23. 活性化レーザーの強度。活性化レーザー強度は、任意の取得フレームで活性分子の数が小さい(例えば、1〜100)ように選択する必要があります。大まかに言えば、活性分子間の最も近い距離が回折限界分解能よりもわずかに大きいときに、所望の密度に達する(セクション6、イメージングも参照)。不活性な単一分子の集団が減少するにつれて、より高い強度の活性化レーザーが必要になります。典型的な強度は^{10-1-10 2} W / cm²です。
24. クォーター波長板を最適化します。クォーター波長板(QWP)はオプションですが、QWPを使用して読み出しレーザーと活性化レーザーの円偏光の度合いを増やすと、最終画像の分子密度を高めることができます。QWPを最適化するには、QWPとM5の間に偏光子を配置します。アクティベーションレーザーをブロックします。読み出したレーザーを、乾式60倍対物レンズの上のパワーメーターに投影します。
25. QWPの角度を記録します。偏光子を最大まで調整し、その後、最小電力が達成されます。これらの各値を記録し、最小/最大の比率を計算します。QWPの角度を調整し、これらの測定を繰り返します。1.0に近い値を求めることが望ましいですが、イメージングには>0.8の比率で十分です。

4. チャンネルアライメントのためのビーズの耐久性のあるサンプルの作成

1. 蛍光ビーズ(直径40〜100 nm)のサンプルをHPLCグレードの水に1:70に希釈します。このストック溶液をHPLC水でさらに1:15に希釈すると、水に懸濁液が200μlになります。
2. カバーガラスに液体ポリ-L-リジンを塗布します。室温で30分間インキュベートします。吸引して溶液を取り除き、カバーガラスをHPLCグレードの水で3回洗浄します。カバーガラスから微量の水をすべて吸引し、RTで乾燥させます。
3. ビーズ懸濁液200μlをカバーガラスにピペットで移します。このカバーガラスをRTで20分間放置してから、HPLC水で3回洗浄します。あるいは、カバースリップO/NをRTのままにして、懸濁液を乾かします。
4. ~20 μl の HPLC 水または封入剤を使用して、カバーガラスをスライドガラスに取り付けます。カバーガラスの周囲を透明なマニキュアで密封します。ポリッシュが乾いたら、カバーガラス(および水または油の適切な対物レンズ浸漬剤)を60X対物レンズの上に置きます。

5. 画像取得:検出チャネルのアライメントのためのイメージングビーズサンプル

1. ビーズサンプルを、イメージングに使用する強度の約10倍の低い強度で読み出したレーザービームで照らします。EMゲインを100に設定した状態で、画像をカメラに投影し、ビーズが両方のチャンネルに表示されるまでフォーカスを調整します。
2. ビーズが暗い場合は、レーザー出力またはEMゲインを上げます。ビーズ画像のノイズを最小限に抑えること(多数の光子、つまり各ビーズから合計で少なくとも5,000の光子を検出すること)は、正確なチャンネルレジストレーションにとって重要です。カメラを100フレームを記録するように構成し、その後のFPALMイメージングに使用されるのと同じ露光時間で
。
3. ビーズがチャネルの中心と周辺の両方に分布し、ビーズ密度が十分に低く、個々のビーズが十分に分離され、個別に識別できる領域を探します。
4. これらのビーズ密度で、異なる領域の画像を10〜20セット取得します。チャンネルキャリブレーションにビード画像を使用する方法の詳細については、結果のセクションを参照してください。

6. 画像取得: マルチカラー FPALM

1. 各コンストラクトのうち1つだけでトランスフェクションされた細胞を画像化すること、およびすべてのコンストラクトで細胞の画像を記録することが重要です。これらのデータは、使用される各プローブのアルファヒストグラムを確立するのに役立ち、マルチカラーデータの解釈に必要です。
2. フォトスイッチング可能なプローブを発現する細胞を見つけます(使用されている場合)。すべての部屋の照明を消します。フリップマウント(FM)を介して水銀ランプをサンプル(トランスフェクションされた細胞を含む)に投影します。タレットフィルターキューブを、適切なダイクロイックミラー/フィルターの組み合わせを含むものに変更して、ラベルのフォトスイッチ前状態の励起を可能にします。例えば、プレフォトスイッチDendra2や緑色プレスイッチ発光のプローブをイメージングする場合、DM4は青色光(<488 nm)を反射するダイクロイックを、F5は500~570 nmの光を通過させ、この範囲外の光を遮断するフィルターを1つ選択します。
3. 眼球を使用して、前光プローブを発現している細胞を検索します。例えば、Dendra2を発現する細胞は緑色に見えます。すべてのプローブがフォトスイッチング可能であるわけではなく、事前に切り替えられた発光スペクトルによっては、ここにリストされているものとは異なるDM4 / F5の組み合わせが必要になる場合があることに注意してください。
4. セルを選択したら、FMを下に動かして、レーザーが顕微鏡に通過できるようにします(経路から水銀光をブロックします)。フィルタータレットをイメージングに適したダイクロイックを含むものに変更します(この場合、DM2は読み出しレーザーと活性化レーザーの両方を反射し、より長い波長を透過し、F1はレーザーの赤まで波長を透過し、理想的にはレーザー波長で高い抑制を特徴とする必要があります)。
5. 細胞がフォトスイッチングプローブを発現しない場合は、画像をカメラに投影し、読み出したレーザーを使用してサンプルを照らして細胞を検索します。多くの細胞で単一分子が見える可能性があります(図3を参照)。
6. トランスフェクションされた細胞をバックグラウンド蛍光(依然として個別に点滅する分子として現れることがあります)と区別し、分子が光活性化可能であることを確認するには、低出力の活性化レーザー(通常はマイクロワットオーダー)でサンプルを短時間照射します。読み出しビームの下で見える光活性化可能な分子の数は、活性化照明が再びブロックされた後でも、劇的に増加し、短時間高いままであるはずです。プローブが異なれば、その明るさ、光変換効率、および活性化に必要なレーザー出力がかなり異なる場合があることに注意してください^24-27。
7. EMゲインを200に設定し、必要なフレーム数(通常は5,000〜10,000)と露出時間(通常は10〜30ミリ秒が適切)を選択して、キネティックシリーズ取得用のカメラソフトウェアを準備します。EMゲインは200より高く設定することができますが、あるポイントを超えてEMゲインを上げるとノイズが増加する可能性があります。
8. 発動ビームをブロックします。読み出しビームのブロックを解除し、照らされたセルの画像をカメラに投影します。
9. セルがトランスフェクションされていることを確認します(ステップ6.6)。細胞を見ながら、目的の焦点面が見え、分子に鋭く焦点が合うまで焦点を調整します。
10. 細胞膜下部付近を画像化する焦点面を選択するには、個々の分子が見えなくなるまで焦点を下にシフトします。次に、分子が最初に見えるようになるまで、焦点を徐々に上に動かします。
11. 上部細胞膜付近で画像化するには、顕微鏡のフォーカスノブまたは自動フォーカスを使用して距離を記録しながら、フォーカスを希望の量だけ上にシフトし続けます。これら 2 つの制限の間でフォーカス領域を選択すると、セルの中央に領域がイメージングされます。
12. 活性化ビームのブロックを解除し、サンプルを低強度で照射します(ND2フィルターを使用して、ビームを非常に低い強度(サンプルで約<1 W / cm²)に減衰させます)。
13. データ取得を開始します。高密度の活性分子が望まれます。ただし、分析ステップでは、これらの分子が空間的に重ならないようにすることが重要です。
14. ND2を調整することにより、可視光活性化性分子の密度を~0.1-1μm-2に維持しようとします。通常、直径が~10-20 μmの画像領域では、一度に~10-100個の分子が見えます(図3および図4を参照)。取得の過程で残る不活性分子の数が減少するにつれて、密度を維持するために活性化レーザーの出力を徐々に増加させる必要がある場合があります。
15. TIRFイメージング*が必要な場合は、M5とL1の両方を1つの並進ステージ(TS、図1)に取り付けて、横方向(つまり、顕微鏡の入口のすぐ後ろでレーザーに垂直な方向)に移動する必要があります。M5とL1が並進されると、対物レンズからサンプルを上向きに出すレーザーは、徐々に片側に傾きます(注意:レーザーの安全上の問題)。
16. レーザーの角度が垂直から90°に達すると、出現するレーザー自体が消え、入力された読み出されたレーザーは後方反射され、対物レンズの後部開口部から移動するビームとして出現し、入力ビームに反平行になり、横に変位します。
17. 同時に、バックグラウンド蛍光はほぼ完全に減衰し、識別可能な焦点を合わせた単一分子を含むサンプル領域の厚さが大幅に減少します.
    *TIRFは、カバーガラスから100~500nm上にあるサンプルの薄い部分のイメージングを可能にします。サンプルのさらに奥にある焦点面のイメージングは、広視野照明(セクション3)を使用して簡単に実現できますが、TIRF.
    には適していません。
18. 取得が完了したら、すぐに顕微鏡のシャッターを閉じ、両方のビームをブロックします。EMゲインを無効にし、カメラを1フレームを記録するように設定し、カメラ読み出し領域を最大サイズに設定します。
19. F3またはF4の上にカードを置いて、1つのチャンネルをブロックします。顕微鏡ランプに取り付けられたロングパスフィルター(>580nm)を使用して、サンプルを照らし、この画像をカメラに投影します。セルのスナップショットを記録します。
20. オプション:1つのチャンネルがブロックされたままの状態で、透過光照明によってサンプルの広い領域が見えるように開口部を開きます。スナップショットを記録します。これらの透過光画像は、対応するFPALM画像のコンテキストを表示するのに非常に役立ちます。
21. ライブセルイメージング。生細胞をイメージングするには、ステップ1.1-1.3に従って細胞をトランスフェクションしますが、これらのサンプルは固定しないでください。代わりに、上記のようにセットアップを完全に位置合わせしますが、サンプルをイメージングする前に、サンプルを37°Cおよび5%CO₂から取り出し、PBSで3回洗浄し、サンプルをイメージングメディア(例:20 mMグルコースを含むPBS)に浸します。培地の除去と洗浄により、ほとんどの細胞培地に関連するバックグラウンドが減少します。
22. サンプルは、必要に応じて固定細胞と同様にRTでイメージングするか、顕微鏡ステージに取り付けられたインキュベーションステージを使用して37°Cおよび5%CO₂でイメージングできます。NIH 3T3細胞の1つのサンプルは、イメージング培地に約1時間以内浸漬する必要があります。この種の実験の準備をする前に、イメージング培地への浸漬に対する細胞の応答をモニターし、液浸の時間を最適化し、場合によってはイメージング培地の組成を最適化して細胞の摂動を減らすことが役立つ場合があります。

Results

インフルエンザ赤血球凝集素(HA)は、数十ナノメートルからマイクロメートルのオーダーでクラスターを形成し、これらのクラスターはアクチンと可変的に共局在します(図5)。これらの空間分布は、これら2つのタンパク質のより粗いスケールのイメージング²⁸、およびHA空間分布のアクチン¹⁹への依存性を裏付けるものである。マルチカラーFPALM画像は、これらのクラスターの密度、面積、周囲長、およびナノスケールとマイクロスケールの両方での2つの種間の共局在の程度を記述するためにさらに使用できる。得られる画像の解像度は数十ナノメートルのオーダーです^1,17;ここで示すレンダリング画像では、画像上の個々の点は、20 nmの精度で、単一の標識タンパク質分子の局在化を表しています。透過光源を使用して全FOVの画像をさらに取得することにより(図6)、FPALM画像は細胞全体とその周辺環境のコンテキストで見ることができます。

上記のように2つの色設定で記録された画像(

Discussion

ローカリゼーションベースの超解像イメージングは、生物学的イメージングに多くの強力な機能を提供します。テーブル上に配置された個々の光学部品から、生体サンプル中の複数の蛍光種を同時にイメージングできる機能的な超解像顕微鏡までのルートには、多くの課題があります。アライメントの一部の側面は、他の側面よりも重要です。以下では、ルートの最も困難な側面に対処する将来のユーザーにガイダンスを提供するよう努めます。

重要なステップ

FPALMや同様の技術によって提供される画像解像度の向上には、顕微鏡の安定化にもっと注意を払う必要があります。従来の顕微鏡画像は、~20〜50 nmのスケールでのサンプルドリフトや振動運動(振動)によって目に見えて歪むことはありませんが、超解像顕微鏡画像はそのような動きによって劣化します。たとえば、不要な動きの原因には、顕微鏡およびサンプル内の熱勾配、エアテーブルに取り付けられた機器の冷却ファン、顕微鏡ステージまたはエアテーブルへの物体の不注意な接触、および建物内の振動(空気処理装置やその他の機械によって引き起こされる可能...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek IIチャンバー	Nunc
蛍光ビーズ	Invitrogen	F-8801	キャリブレーション用ビーズ
テトラスペックビーズ	Invitrogen	T-7279	キャリブレーション用4色ビーズ
対物レンズ 浸漬油	ツァイス	518F	高NA対物レンズ用浸漬オイル(対物レンズの選択による)
HPLCウォーター	フィッシャー科学	W5-4
媒体	ATCC	30-2003	またはCellgro 10-090
抗生物質	GIBCO	15070-063
血清	Thermo Scientific	SH30087.03
リポフェクタミン	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
トリプシン	MPBiomedicals
パラホルムアルデヒド	フィッシャーサイエンティフィック	AA433689M	注意:有毒